從線粒體DNA研究亞低溫的腦保護(hù)機(jī)制

1、從線粒體dna研究亞低溫的腦保護(hù)機(jī)制 【摘要】 目的 探討亞低溫對(duì)創(chuàng)傷性sd大鼠線粒體dna的腦保護(hù)機(jī)制的研究。方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：常溫創(chuàng)傷性腦損傷組、亞低溫創(chuàng)傷性腦損傷組二組。 各組按照處死時(shí)間點(diǎn)不同分為2h、24h和3d 3個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只大鼠。結(jié)果：亞低溫組dna的缺失明顯少于常溫組。結(jié)論：亞低溫能抑制腦線粒體dna的死亡，從而起到很好的腦保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】 亞低溫；線粒體dna 【中圖分類(lèi)號(hào)】q5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】b【文章編號(hào)】1005-0019（2013）12-0523-02 創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，tbi）占全身各部位損傷的第2位，病死率卻

2、達(dá)30%-50%左右，居第1位.創(chuàng)傷性腦損傷是一種常見(jiàn)的神經(jīng)外科疾病，流行病學(xué)調(diào)查資料顯示， 當(dāng)今我國(guó)顱腦外傷的發(fā)病率已經(jīng)超過(guò)100/ 10 萬(wàn)人口， 傷數(shù)百萬(wàn)人，接近西方發(fā)達(dá)國(guó)家150200/10 萬(wàn)人口，且隨著社會(huì)的發(fā)展而逐漸增加1。tbi不僅發(fā)生在損傷瞬間，且發(fā)生于其后的數(shù)分鐘到數(shù)天內(nèi)，稱(chēng)為繼發(fā)性腦損傷（sbi）。 國(guó)內(nèi)江基堯教授等研究表明，應(yīng)用亞低溫治療患者預(yù)后明顯改善，顯著減少腦損傷的死殘率，但亞低溫腦保護(hù)機(jī)制仍未完全明了，亞低溫腦保護(hù)作用機(jī)制仍待研究 2。 我們本課題針對(duì)對(duì)創(chuàng)傷性sd大鼠線粒體dna進(jìn)行研究，研究亞低溫治療后能否減輕線粒體dna的缺失，能否保護(hù)線粒體的功能，改善預(yù)后

3、，現(xiàn)報(bào)道如下： 1.資料與方法 （1）實(shí)驗(yàn)分組：常溫創(chuàng)傷性腦損傷組、亞低溫創(chuàng)傷性腦損傷組。 （2）外傷模型制作：各組按照處死時(shí)間點(diǎn)不同分為2h、24h和3d，每個(gè)亞組6只sd大鼠。大鼠用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，在大腦左頂（前囟后4.5 mm，矢狀縫旁左開(kāi)3.5 mm）鉆孔，約5mm2，避免損傷硬腦膜。假手術(shù)組只在顱骨上打孔不給予外傷打擊，常溫tbi組和亞低溫tbi組用液壓沖擊傷裝置進(jìn)行打擊，壓力1.5 x 102 - 1.7 x 102 kpa，作用時(shí)間2123 ms，造成中度顱腦創(chuàng)傷模型。亞低溫tbi組傷后即刻連續(xù)給予腦室內(nèi)物理降溫，持續(xù)2h后復(fù)溫至37 （3）亞低溫模型

4、制作：亞低溫組實(shí)驗(yàn)大鼠打擊模型制作成功后，將溫度探頭埋于損傷灶皮質(zhì)下2 mm處，經(jīng)骨窗穿刺置入兩根微型腦室管分別至雙側(cè)側(cè)腦室并固定之，其中一根腦室管接一套輸液器，另一根腦室管接一引流管，將25 的林格氏液自腦損傷后30 min開(kāi)始通過(guò)輸液器流入側(cè)腦室冷卻腦脊液，利用其循環(huán)途徑使腦組織迅速進(jìn)入亞低溫狀態(tài)（3l33），林格氏液再?gòu)牧硪桓X室管通過(guò)引流管排出。根據(jù)腦溫監(jiān)測(cè)儀所顯示的腦溫變化及顱內(nèi)壓監(jiān)測(cè)情況適時(shí)調(diào)節(jié)水流速度，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦溫在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)（2030 min）降低至亞低溫水平，并保持這一腦溫達(dá)2h，然后用骨蠟封閉骨窗、縫合頭皮并再次消毒后放入籠中，采用自然復(fù)溫法使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦溫恢復(fù)正常 2

5、.腦線粒體的分離及線粒體dna的提取 （1）腦線粒體的分離（參考文獻(xiàn)： palva t k， palva e t. rapid isolation of animal mitochondrial dna by alkaline extractionj. febs，1985，192（2）；267） （2） 線粒體dna的提?。ā緟⒖嘉墨I(xiàn)】krlstian t，weatherby tm，bates te，et a1.heterogeneity of the calcium-induced permeability transition in isolated nonsynaptic brain m

6、itochondria.j neurochem，2002，83：12971308）： 3.pcr檢測(cè)線粒體dna 參照大鼠線粒體dna全序列（參考：richer c，park j w，ames b n. nomal oxidative damage to mitochondrial and nuclear dna is extensivej.proc natl acad sci usa，1988，85（17）；6465），自行設(shè)計(jì)，由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所合成兩對(duì)引物。 p1 gcttagagcgttaaccttttaag （53） p2 aagcctgctaggatgcttc （53） p3

7、acaggcatctggttcttact （53） p4 catgtctaatcttacctcca （53） 引物p1、p2 橫跨mtdna常見(jiàn)缺失區(qū)，分別對(duì)假手術(shù)組、常溫創(chuàng)傷性腦損傷組、亞低溫創(chuàng)傷性腦損傷組進(jìn)行擴(kuò)增。引物p3、p4 位于無(wú)缺失區(qū)，分別對(duì)假手術(shù)組、常溫創(chuàng)傷性腦損傷組、亞低溫創(chuàng)傷性腦損傷組進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出產(chǎn)物代表作為對(duì)照組，與p1、p2擴(kuò)增出產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)照，相當(dāng)于內(nèi)參。 4.結(jié)果 如下圖：分別為2h、24h和3d三個(gè)時(shí)間段的pcr圖片，亞低溫組dna的缺失明顯少于常溫組的。 （2小時(shí)） （24小時(shí)） （3天） 5 結(jié)論 亞低溫通過(guò)抑制線粒體dna的缺失，減少腦細(xì)胞的凋亡，從而起到腦

8、保護(hù)作用。 討論 重癥顱腦損傷是一種危重疾病，發(fā)病較急，而且病勢(shì)兇猛，如果患者沒(méi)有得到及時(shí)的對(duì)癥治療，則會(huì)導(dǎo)致其病情不斷發(fā)展，最終危及患者生命安全，甚至導(dǎo)致死亡，嚴(yán)重制約了患者生活質(zhì)量的提高。因此，對(duì)于此病的治療，臨床醫(yī)生要及時(shí)對(duì)患者實(shí)行準(zhǔn)確診斷，并給予及早的對(duì)癥治療，以促進(jìn)病情的良好改善，降低病死率，從而促進(jìn)患者生活質(zhì)量的提高，亞低溫是一種理論基礎(chǔ)逐漸完善的治療方法 是重型顱腦損傷早期救治的重要手段3。 目前重型顱腦外傷病死率和致殘率居高不下，除了顱腦本身病變的直接原因外，其并發(fā)癥導(dǎo)致的病理性連鎖反應(yīng)及疊加效應(yīng)均是造成死亡的重要原因4。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究都顯示出低溫的保護(hù)作用，尤其是20

9、世紀(jì)90年代以來(lái)，歐、美、日本及我國(guó)一些神經(jīng)外科中心有關(guān)亞低溫治療重型腦創(chuàng)傷的臨床研究結(jié)果令人振奮。近10年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)始重視急性重型顱腦損傷的亞低溫治療。亞低溫是輕度低溫（3335 ）和中度低溫（2932）的合稱(chēng)，大量的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用均證實(shí)，3235低溫對(duì)急性重型顱腦損傷具有肯定改善患者的預(yù)后，降低死亡率的臨床效果5，亞低溫治療腦損傷的機(jī)制：降低腦組織耗氧量，減少腦組織乳酸堆積；保護(hù)血腦屏障，減輕腦水腫；抑制內(nèi)源性毒物產(chǎn)生對(duì)腦細(xì)胞的損害作用；減少鈣離子內(nèi)流，阻斷鈣對(duì)神經(jīng)元的毒性；減少細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)破壞，促進(jìn)腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)；最近研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫治療能顯著減少腦外傷后彌漫性軸索損傷

10、的程度，為亞低溫治療顱腦損傷提供了有力的病理學(xué)證據(jù)6。 研究資料表明，腦外傷3h以?xún)?nèi)開(kāi)始亞低溫效果較理想，提示腦外傷3h內(nèi)開(kāi)始亞低溫可能是較理想的治療時(shí)間窗7，亞低溫治療中溫度不宜降得太低，可維持在3235，溫度太低可能會(huì)導(dǎo)致明顯的循環(huán)與呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥。但是開(kāi)始降溫時(shí)應(yīng)使體溫快速降至目標(biāo)溫度，以迅速呈現(xiàn)治療效果。亞低溫治療時(shí)間一般持續(xù) 35天，以保證腦組織順利度過(guò)水腫高峰期；但最長(zhǎng)時(shí)間一般不超過(guò)7天。復(fù)溫時(shí)需要控制性緩慢復(fù)溫，每34小時(shí)升高1，1216小時(shí)后將體溫逐漸升到36.537.5。 采用控制性復(fù)溫法既可避免因腦溫上升過(guò)快而發(fā)生急性腦腫脹，并且可有效避免因?yàn)閺?fù)溫太快，短時(shí)間內(nèi)周?chē)苎杆?/p>

11、擴(kuò)張致使有效回心血量不足、血壓下降，甚至出現(xiàn)復(fù)溫后低血容量休克的情況。 本組結(jié)果可以看出亞低溫治療后2小時(shí)線粒體dna凋亡明顯減少，到傷后第24小時(shí)、3天凋亡顯著低于對(duì)照組，進(jìn)一步說(shuō)明了3235的亞低溫通過(guò)抑制線粒體dna的凋亡來(lái)治療急性重型顱腦損傷，是一項(xiàng)安全可靠的治療措施。使用亞低溫治療由于克服了傳統(tǒng)深低溫治療的缺陷，使用得當(dāng)一般不會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥8，但隨著復(fù)溫繼續(xù)或進(jìn)行相應(yīng)的處理，均能及時(shí)糾正，一般不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重影響。 參考文獻(xiàn) 1 王忠誠(chéng)，趙元立.加強(qiáng)顱腦外傷腦床基礎(chǔ)研究，提倡規(guī)范化治療j.中華神經(jīng)外科雜志，2001，17（3）：133 2 jiang jy，xu w，li wp，

12、et a1.effect of long-term mild hypothermia or short-term mild hypothermia on outcome of patients with severe traumatic brain injury j.j cereb blood flow metab，2006，26：771776. 3 孫來(lái)廣 程振國(guó) 王進(jìn)忠.亞低溫對(duì)重型顱腦損傷的治療作用j .中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志 2010 13 2 56-57. 4 孔權(quán).亞低溫腦保護(hù)在重型顱腦損傷治療中的應(yīng)用j.醫(yī)學(xué)研究雜志，2009，38（6）：33-35. 5 李小東.亞低溫治療急性重型顱腦