生化校準(zhǔn)方法分析

1、 龍崗區(qū)中醫(yī)院 姜敬學(xué) 理論k值：根據(jù)摩爾系數(shù)（）來計算。通常試劑生產(chǎn)降價給出的k值都屬于此。 實測k值：是根據(jù)儀器當(dāng)前的實際狀態(tài)，試劑的穩(wěn)定性等因子數(shù)測得的值。 校準(zhǔn)k值：通過高質(zhì)量校準(zhǔn)直接校準(zhǔn)得到的k值 K因數(shù)法適用的分析方法有一點終點法，兩點終點法，兩點速率法，多點速率法。 K=SV/TV & .1*106線性兩點法非線性法：又稱非直線性校準(zhǔn)法 非線性法包括logit-log法、指數(shù)函數(shù)法、樣條函數(shù)法等方法Logit-log3p對數(shù)函數(shù)法中的一種，適用于濃度升高而吸光度表現(xiàn)為收束的工作曲線。P表示參數(shù)之意，由3個參數(shù)（S1Abs、k、a）參與計算。S1Abs表示試劑空白，K表示校準(zhǔn)所得斜

2、率，a表示近似常數(shù)。、logit-log4p對數(shù)函數(shù)法中的一種，適用于濃度升高而吸光度表現(xiàn)為收束的工作曲線。P表示參數(shù)之意，由4個參數(shù)（S1Abs、k、a、b）參與計算。S1Abs表示試劑空白，K表示校準(zhǔn)所得斜率，a表示近似常數(shù)。logit-log5p對數(shù)函數(shù)法中的一種，適用于濃度升高而吸光度表現(xiàn)為收束較明顯的工作曲線。P表示參數(shù)之意，由5個參數(shù)（S1Abs、k、a、b、c）參與計算。S1Abs表示試劑空白，K表示校準(zhǔn)所得斜率，a表示近似常數(shù)。而使結(jié)果更加精確。指數(shù)函數(shù)法（exponential）是適用于隨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度增加，而測定的吸光度值呈現(xiàn)分散狀態(tài)的趨勢。 5個參數(shù)（S1Abs、k、a、b

3、、c） 樣條函數(shù)法（spline）：是將每一標(biāo)準(zhǔn)液測定的標(biāo)準(zhǔn)液測定的吸光度連接起來（點對點），形成一個完整曲線，即為曲線擬合。該曲線擬合優(yōu)于折線法校準(zhǔn)。由4個近似常數(shù)a（l），b（l）c（l），d（l）參與計算。折線法（line Graph）：是將標(biāo)準(zhǔn)液1-6的吸光度值多用條直線連接起來的工作曲線。 s1Abs、k1; s2Abs、k2; s2Abs、k2; s3Abs、k3; s4Abs、k4; s5Abs、k5;參與計算。 Logit-log3p適用于一點終點法、兩點速率法和兩點終點法等分析方法。 logit-log4p適用于一點終點法、兩點速率法、兩點終點法、三點雙項目分析法、速率法A、

4、速率法B等分析方法。 Logit-log5p適用于一點終點法、兩點速率法、兩點終點法、速率A等分析方法。 樣條函數(shù)法是為N個標(biāo)準(zhǔn)品，（N）有多個標(biāo)準(zhǔn)液（N1）之間的范圍適應(yīng)于前后的測定值并使之接近，總體成為一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，需用樣條函數(shù)擬合的校準(zhǔn)方法。 樣條函數(shù)法適用于多點定標(biāo)。 通常，生化分析儀器都設(shè)置有樣品最小用量和最小體積，如日立7170反應(yīng)體積為180-380ul，最大體積為570ul，最小吸樣量2ul，在不影響結(jié)果的準(zhǔn)確度，精密度的前提下，可適當(dāng)調(diào)整樣品和試劑的用量。 樣品與試劑的比例（SV/RV），也可表示為樣品分?jǐn)?shù)樣品體積與反應(yīng)液總體積。 SV/TV是方法學(xué)基本參數(shù)，在其他參數(shù)不變時

5、，直接影響結(jié)果的計算。一般情況下以試劑說明為準(zhǔn)，不宜輕易改動。 如總膽固醇與甘油三脂的測定，血清樣品與試劑的最佳比列為1:100，樣本的最低用量不能小于3ul。 測定方法的選擇： 自動生化儀一般都可選擇一點終點法，兩點速率法，速率A法等。對于，一種新的實驗方法，通常選擇高中低嘗試樣本與標(biāo)準(zhǔn)品觀察其它反應(yīng)進(jìn)程曲線。若均在5min之內(nèi)呈直線，可采用速率A測定。如反應(yīng)進(jìn)程曲線不呈直線而且需5-10min，甚至更長的時間才能達(dá)到終點，可采用兩點速率法測定，如反應(yīng)曲線在2-3min，甚至更短的時間即達(dá)到終點，則采用終點法為宜。 同一項目可用不同的方法測定 如血清肌酐測定通常的就有氧化酶和苦味酸，兩點速率

6、法和酶法的。 當(dāng)前情況下大多以使用，JAFFF法苦味酸法的，由于價格便宜，但苦味酸污染管道及比色杯。 酶法測定肌酐價格雖然貴但其測定結(jié)果準(zhǔn)確，試劑抗干擾力強(qiáng)。標(biāo)本用量少，污染少，有逐漸被酶法試劑盒取代的趨勢。 同一個項目相同的試劑也可用不同的方法進(jìn)行測定，在血清葡萄糖測定方法中，己糖激酶HK法的特異性高，分析方法中有一點終點法，兩點終點法，速率A法，有研究表明，三種分析方法中只有兩點終點法能扣除其光譜干擾（溶血、脂濁、黃疸）的影響，到反應(yīng)終點的第二點間仍能保持相對的與校準(zhǔn)曲線基本一致的曲線，其吸光度差值乃能保持原比例，因而檢測結(jié)果較正確。誤差較小，能較好地克服（溶血、脂濁、黃疸）取得較準(zhǔn)確的結(jié)

7、果。 波長的選擇應(yīng)根據(jù)吸收光譜曲線，選擇特定反應(yīng)產(chǎn)物對吸光度吸收的最高峰值時的。波長為測定波長及雙單波長測定的主波長。 副波長的選擇原則是干擾因數(shù)在主波長與副波長有相同的吸光度或是越接近越好，但不影響測定的靈敏度及副波長的正確選擇有利于提高測定的靈敏度和減少測定誤差，單波長測定易受到樣品溶血，黃疸，脂血等因素的干擾，雙波長測定可以通過副波長加以修正，減少甚至消除干擾因素，提高測定的準(zhǔn)確度。 雙波長的選擇常見： 血紅蛋白在340nm和380nm波長吸光度相同， 以NADH和NADPH作為測定底物或產(chǎn)物的試驗常用340nm、380nm 340、405ALP和GGT常用405nm、476nmTRIN

8、DER反應(yīng)多選取520nm、600nm或550nm、660nm免疫比濁常用340nm、700nm等。 分析時間的選擇 分析時間主要包括反應(yīng)時間，監(jiān)測時間（讀點）和讀數(shù)間隔時間，延遲時間，根據(jù)反應(yīng)類型，儀器和試劑的狀況，就遵循有利于抗干擾，有足夠靈敏度以及準(zhǔn)確度的原則適當(dāng)調(diào)配延遲時間和讀數(shù)時間的長短。 定血清葡萄糖、膽固醇的試劑盒由于增加了可加快反應(yīng)速率的工具酶的量3-4min反應(yīng)完全，設(shè)置5min已足夠。目前多數(shù)自動生化分析儀設(shè)置有多個反應(yīng)時間可選（如日立7170,5min，10min，15min），須預(yù)先選定，多數(shù)儀器設(shè)定在10min左右 監(jiān)測時間是指該時間內(nèi)的測定讀數(shù)要用于結(jié)果計算。它的設(shè)置與加樣點、加試劑