綠膿桿菌課件

1、化妝品中銅綠假單胞菌化妝品中銅綠假單胞菌（pseudomonasaeruginosa）的檢測的檢測v目的：1.了解化妝品中銅綠假單胞菌檢測的基本過程。2.掌握幾種培養(yǎng)基的配置方法。3.掌握銅綠假單胞菌的鑒定及生化特征。v原理： 銅綠假單胞菌為需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，有鞭毛，在普通培養(yǎng)基上生長良好，菌落大小不一，平均直徑2mm3mm，扁平，邊緣不整齊，且常呈相互融合狀態(tài)。氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素，此外還能液化明膠，還原硝酸鹽產(chǎn)生氮氣，在42條件下可以生長，可與類似菌區(qū)別。操作步驟 檢樣前化妝品的處理 接樣于營養(yǎng)肉湯增菌，37，12h，140rpm培養(yǎng)分離培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)物接于十六烷基三甲

2、基溴化銨平 板， 37，18-24h 染色鏡檢 配十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基（選擇性培養(yǎng)基，大腸桿菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長完全受到抑制） 配綠膿菌素測定用培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基，硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基，普通瓊脂斜面培養(yǎng)基操作步驟 特征性檢驗氧化酶 綠膿菌素 硝酸鹽還原 明膠液化 42 生長 試驗 試驗 產(chǎn)氣試驗 試驗 試驗取菌+ 1滴 接菌，37 接菌 接菌 接菌二甲基對 24h +氯仿 37 24h 37 24h 42 24h 苯二胺 移出+鹽酸紫紅色（+） 紫紅色（+） 有氣體（+） 溶解成液狀（+） 生長（+） 不變色（-） 不變色（-） 無氣體（-） 未溶解（-） 不生長（-） 實驗一

3、培養(yǎng)基的制備及細(xì)菌的分離培養(yǎng)實驗?zāi)康恼莆张囵B(yǎng)基制備的原理和方法掌握細(xì)菌的分離培養(yǎng)了解滅菌方法實驗原理 不同的微生物生長繁殖都需要提供一定的營養(yǎng)條件，在實驗室中，微生物的營養(yǎng)是由培養(yǎng)基來提供的。培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。 除營養(yǎng)條件以外，微生物必須在最適酸堿度范圍內(nèi)才表現(xiàn)出最大生命力，因此，應(yīng)針對不同的微生物將培養(yǎng)基的ph值調(diào)節(jié)到適當(dāng)范圍。 操作步驟按培養(yǎng)基按培養(yǎng)基配方稱量配方稱量加水加加水加熱熔化熱熔化調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)ph值值分裝分裝包裝包裝滅菌滅菌備用備用操作步驟 1.綠膿菌素測定用培養(yǎng)基300ml 加熱溶解 調(diào)ph 分裝試管 高壓 制成斜面2.明膠培

4、養(yǎng)基300ml 加熱溶解 調(diào)ph 分裝試管 高壓 直立制成高層3.硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基300ml 加熱溶解 調(diào)ph 分裝有小倒管的試管 高壓 直立制成高層4.普通瓊脂斜面培養(yǎng)基300ml 加熱溶解 調(diào)ph 分裝試管 高壓 制成斜面注意事項1.培養(yǎng)基溶解時，加有瓊脂的培養(yǎng)基易沸，應(yīng)注意看守。2.注意調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的ph。3.稱牛肉膏用玻片，稱甘油用小燒杯。4.加熱后應(yīng)補足液量。5.注意做好標(biāo)記。細(xì)菌的分離培養(yǎng)v原理： 通過劃線，將混雜的細(xì)菌在平板表面逐一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，各自形成菌落(colony)。根據(jù)菌落形態(tài)、特征挑選單個菌落，移種培養(yǎng)后，即得到純種細(xì)菌。v方法：平板劃線法有幾種，可根據(jù)不同情況選

5、用其中一種。 (1)平行劃線法 此法適用于含菌不多的液體標(biāo)本，如腦脊液(csf)、腹水、分泌物、膿汁以及稀薄的菌液等。左手斜持平板底，右手持接種環(huán)。接種環(huán)在火焰上滅菌，冷卻后，沾取一接種環(huán)標(biāo)本，先在平板的一端涂開，并從此處開始向下劃密集的平行線，約占平板面積的一半。將平板轉(zhuǎn)180角，從平板另一端開始也劃密集的平行線，直到劃滿平板的剩余部分。 將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)火焰滅菌后放下，將平板倒置，37培養(yǎng)。(2)分區(qū)劃線法。此法適用于含菌多的檢測標(biāo)本，如糞便，喀痰、細(xì)菌固體培養(yǎng)物等。劃線前的操作同平行劃線法。先在平板的一端將標(biāo)本涂開并在平板的1/51/4面積上劃密集的平行線，接種環(huán)火焰滅菌。將平板

6、轉(zhuǎn)約70角，待接種環(huán)冷卻后，使接種環(huán)通過已劃線的1區(qū)57次，以后即不與1區(qū)接觸作連續(xù)密集劃線，約占平板面積的1/4，接種環(huán)再通過火焰滅菌。再轉(zhuǎn)平板約70，如上法在第3區(qū)劃線，此后接種環(huán)不再滅菌。重復(fù)上述操作在第4區(qū)劃線，劃滿余下的培養(yǎng)基表面。將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)滅菌后放下，置37培養(yǎng)。實驗二 染色鏡檢及五項指標(biāo)試驗革蘭氏染色方法 涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色鏡檢鏡檢1涂片：取一潔凈的載玻片，用記號筆在載玻片做好標(biāo)記，涂片：取一潔凈的載玻片，用記號筆在載玻片做好標(biāo)記，并在載玻片中間滴一小滴生理并在載玻片中間滴一小滴生理.鹽水，以無菌接種環(huán)挑取鹽水，以無菌接種環(huán)挑取少量菌體涂片，玻片要潔凈

7、無油，否則菌液涂不開。少量菌體涂片，玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。 為防止細(xì)菌濺散污染環(huán)境，接種環(huán)滅菌前，須先將接種環(huán)為防止細(xì)菌濺散污染環(huán)境，接種環(huán)滅菌前，須先將接種環(huán)靠近火焰或放內(nèi)焰中烤干，然后再在外焰中燒紅滅菌，殺靠近火焰或放內(nèi)焰中烤干，然后再在外焰中燒紅滅菌，殺死殘留的細(xì)菌死殘留的細(xì)菌。2干燥：放空氣中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于干燥：放空氣中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的熱氣層中烘烤，但切勿將涂膜烤焦?；鹧嫔喜康臒釟鈱又泻婵荆形饘⑼磕た窘埂?固定：用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續(xù)通固定：用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續(xù)通過三次，以固定之。此時殺

8、死大部分細(xì)菌，并使標(biāo)本固定過三次，以固定之。此時殺死大部分細(xì)菌，并使標(biāo)本固定于玻片上，以免在染色或水洗過程中被沖掉。于玻片上，以免在染色或水洗過程中被沖掉。 4染色：染色： 初染初染:將結(jié)晶紫染液加于涂膜上，將結(jié)晶紫染液加于涂膜上，1min。 媒染媒染:水洗后加蘆戈氏碘液處理，水洗后加蘆戈氏碘液處理，1min。 脫色：水洗后用脫色：水洗后用95乙醇脫色，并搖動玻片，直至流乙醇脫色，并搖動玻片，直至流下的液體無色為止，約需下的液體無色為止，約需0.5min。 復(fù)染：水洗后加石炭酸復(fù)紅稀釋液染色，復(fù)染：水洗后加石炭酸復(fù)紅稀釋液染色，1min。 水洗，用濾紙吸干，待標(biāo)本充分干燥后進行鏡檢。水洗，用濾

9、紙吸干，待標(biāo)本充分干燥后進行鏡檢。5鏡檢：鏡檢：干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽性菌（被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽性菌（g+），被染成紅色的），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（為革蘭氏陰性菌（g-）。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。 注意事項：v酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環(huán)節(jié)，如脫色過度，酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環(huán)節(jié)，如脫色過度，則革蘭氏陽性菌可能被誤染為革蘭氏陰性菌，如脫色則革蘭氏陽性菌可能被誤染為革蘭氏陰性菌

10、，如脫色不夠，則革蘭氏陰性菌可能被誤染為革蘭氏陽性菌，不夠，則革蘭氏陰性菌可能被誤染為革蘭氏陽性菌，所以脫色時間要很好掌握。脫色時間的長短還受涂片所以脫色時間要很好掌握。脫色時間的長短還受涂片厚薄的影響，一般涂片時取菌要少，涂片薄而均勻為厚薄的影響，一般涂片時取菌要少，涂片薄而均勻為好。好。v被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會影響染色結(jié)果，如革蘭氏陽性菌的陳舊培養(yǎng)物也有會影響染色結(jié)果，如革蘭氏陽性菌的陳舊培養(yǎng)物也有出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在在1824h1824h之內(nèi)。

11、之內(nèi)。 革蘭氏染色方法操作步驟涂片生理生理鹽水鹽水接種環(huán)接種環(huán)草酸銨結(jié)晶紫 碘 液95%乙醇自然干燥媒染1min脫色0.5min固定初初染染1min復(fù)染1min干燥鏡檢 復(fù)紅銅綠假單胞菌鏡下形態(tài)圖示：氧化酶試驗v原理：有氧呼吸過程中，氧化酵素（oxidase）于電子傳送系統(tǒng)扮演一重要角色，其可藉氧分子將已還原之細(xì)胞色素（reduced cytochrome）氧化，產(chǎn)生水或過氧化氫。好氧菌與部份兼性厭氧菌及微好氧菌均具氧化酵素之作用，本實驗有助于區(qū)分奈瑟氏菌屬（neisseria）、假單胞桿菌屬（pseudomonas）此二屬為氧化酵素陽性(oxidase positive)，與腸道桿菌科（en

12、terobacteriaceae）此科之細(xì)菌為氧化酵素陰性（oxidase negative）。v方法： 白色濾紙片 取菌+1滴1% 二甲基對苯二胺 1530s 變紅色（+） 不變色（-）實驗三 結(jié)果觀察及報告v綠膿菌素實驗：23個可疑菌落綠膿菌素培養(yǎng)基37 24h 35ml氯仿振蕩 提取液呈藍(lán)色取液體于一新試管+1ml1mol/l鹽酸 上層鹽酸內(nèi)變?yōu)榧t色為陽性，不變色則為陰性。v硝酸鹽還原產(chǎn)氣實驗：可疑菌落硝酸鹽蛋白胨水 37 24h 小倒管內(nèi)有氣體產(chǎn)生為陽性，否則陰性。v明膠液化實驗：可疑菌落穿刺接種于明膠培養(yǎng)基 37 24h 取出放冰箱1030min 呈溶解狀為陽性，不溶解則為陰性。v4

13、2生長實驗 ：可疑菌落普通瓊脂斜面42 24h銅綠假單胞菌生長，而近似的熒光假單胞菌不能生長 。結(jié)果判斷 氧化酶（+）綠膿菌素（+） 可報告檢出 典型或可疑菌落 氧化酶（+）綠膿菌素（-） 明膠液化（+） 可報告檢出 硝酸產(chǎn)氣（+） 42 生長（+） 革蘭氏染色（革蘭氏染色（gram staining）:革蘭氏染色法是由丹麥醫(yī)生gram于1884年創(chuàng)立，其簡要操作分初染媒染脫色復(fù)染。如果染色得當(dāng)，鏡檢發(fā)現(xiàn)g+菌體呈藍(lán)紫色，g-菌體呈淺紅色。通過革蘭氏染色法可把所有細(xì)菌分兩在類。因此它是分類鑒定菌種的重要指標(biāo)。其染色機制：通過初染和媒染操作后，在細(xì)菌細(xì)胞的膜或原生質(zhì)體上染上了不溶于水的結(jié) 晶紫與碘的大分子復(fù)合物。革蘭氏染色陽性（蘭氏染色陽性（gram positive）:革蘭氏陽性菌由于細(xì)胞壁厚、肽聚糖含量較高和其分子交聯(lián)度較緊 密，故在用乙醇洗脫時，肽聚糖網(wǎng)孔會因脫水而明顯收縮，再加上它基本不含類脂，故用乙醇處理不能在壁上溶出縫隙