《生物技術(shù)實(shí)踐》復(fù)習(xí)課件

1、一、微生物的培養(yǎng)與分離一、微生物的培養(yǎng)與分離 微生物的培養(yǎng)與分離微生物的培養(yǎng)與分離培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制微生物的分離微生物的分離純化大腸桿菌的操作純化大腸桿菌的操作 某種微生物數(shù)量的測(cè)定某種微生物數(shù)量的測(cè)定土壤中分解尿素細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)土壤中分解尿素細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用分解纖維素的微生物的分離分解纖維素的微生物的分離 利用微生物進(jìn)行發(fā)酵來生產(chǎn)特定的產(chǎn)物利用微生物進(jìn)行發(fā)酵來生產(chǎn)特定的產(chǎn)物u果酒、果醋、腐乳的制作果酒、果醋、腐乳的制作 發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的測(cè)定發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的測(cè)定u制作泡菜并檢測(cè)亞硝酸鹽含量制作泡菜并檢測(cè)亞硝酸鹽含量 微生

2、物的培養(yǎng)：微生物的培養(yǎng)：1.培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的種類依據(jù)物理性質(zhì)、化學(xué)成分、用途劃分依據(jù)物理性質(zhì)、化學(xué)成分、用途劃分培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)碳源、氮源、水、無機(jī)鹽碳源、氮源、水、無機(jī)鹽配制培養(yǎng)基的操作：配制培養(yǎng)基的操作：倒平板與平板倒置倒平板與平板倒置u制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基計(jì)算（配方比例）計(jì)算（配方比例）稱量（各種成分）稱量（各種成分）溶化（瓊脂）溶化（瓊脂）調(diào)整調(diào)整pH滅菌滅菌倒平板倒平板2.滅菌與消毒方法及對(duì)象滅菌與消毒方法及對(duì)象滅菌方法：滅菌方法：灼燒、干熱、高壓蒸汽、過濾滅菌法灼燒、干熱、高壓蒸汽、過濾滅菌法滅菌對(duì)象：滅菌對(duì)象：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿

3、、接種用具等培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、接種用具等消毒方法：消毒方法：煮沸消毒、巴氏、酒精、過氧乙酸、紫外煮沸消毒、巴氏、酒精、過氧乙酸、紫外線線消毒的對(duì)象：消毒的對(duì)象：操作臺(tái)、操作空間、操作者的衣著和雙手操作臺(tái)、操作空間、操作者的衣著和雙手3.接種接種純化大腸桿菌的操作純化大腸桿菌的操作平板劃線法平板劃線法平板劃線操作五區(qū)劃線法倒置培養(yǎng)皿稀釋涂布平板法系列稀釋操作涂布平板操作：4. 培養(yǎng)培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)箱u培養(yǎng)：放在培養(yǎng)箱中，適宜恒溫、培養(yǎng)：放在培養(yǎng)箱中，適宜恒溫、氧氣、二氧化碳的含量氧氣、二氧化碳的含量5. 觀察觀察菌落：菌落：u菌落群體結(jié)構(gòu)特征：菌落群體結(jié)構(gòu)特征：菌落的形狀、大小、邊緣、光澤度

4、、菌落的形狀、大小、邊緣、光澤度、隆起度、透明度等隆起度、透明度等u是菌種鑒定重要依據(jù)是菌種鑒定重要依據(jù)u菌落的觀察二、二、某種微生物數(shù)量的測(cè)定：某種微生物數(shù)量的測(cè)定：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)1.選擇菌種選擇菌種2.梯度稀釋培養(yǎng)菌液梯度稀釋培養(yǎng)菌液3.稀釋涂布接種稀釋涂布接種4.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：p樣品稀釋度足夠高時(shí)，樣品稀釋度足夠高時(shí)，一個(gè)菌落一個(gè)菌落來源于樣品來源于樣品稀釋液中的稀釋液中的一個(gè)活菌一個(gè)活菌（不是絕對(duì)的）。（不是絕對(duì)的）。p實(shí)驗(yàn)至少要涂布實(shí)驗(yàn)至少要涂布三個(gè)平板三個(gè)平板作為重復(fù)組作為重復(fù)組p一般選擇一般選擇菌落數(shù)在菌落數(shù)在30300的平板計(jì)數(shù)

5、的平板計(jì)數(shù)p每克樣品中的菌落數(shù)每克樣品中的菌落數(shù)p平均菌落數(shù)平均菌落數(shù)稀釋液的體積稀釋液的體積稀釋的倍數(shù)稀釋的倍數(shù)稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基固體固體選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基液體液體三、培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用三、培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用分解纖維素微生物的分離分解纖維素微生物的分離四、利用微生物進(jìn)行發(fā)酵來生產(chǎn)特定的產(chǎn)物四、利用微生物進(jìn)行發(fā)酵來生產(chǎn)特定的產(chǎn)物果酒和果醋的制作果酒和果醋的制作果酒果醋實(shí)驗(yàn)原理酵母菌無氧分解葡萄糖產(chǎn)生酒精醋酸桿菌有氧分解葡萄糖、乙醇產(chǎn)生醋酸實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)操作過程挑選葡萄沖洗榨汁酒精發(fā)酵醋酸發(fā)酵 無氧1-3周 有氧10天左右 生成果酒 生成果醋結(jié)果評(píng)價(jià)成分鑒定

6、3mol/LH2SO4 3滴、飽和重鉻酸鉀溶液3滴，酒精與重鉻酸鉀反應(yīng)呈現(xiàn)灰綠色或通過嗅味和品嘗觀察菌膜、嗅味、品嘗，檢測(cè)和比較醋酸發(fā)酵前后的pH、顯微鏡觀察。.實(shí)驗(yàn)原理2. 操作條件3.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作. 課題成果評(píng)價(jià)是否完成腐乳的制作腐乳質(zhì)量的評(píng)價(jià)影響腐乳質(zhì)量的因素：1. 實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：乳酸菌無氧條件將葡萄糖分解成乳酸。泡菜中微生物將蔬菜中硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在特定的條件下會(huì)轉(zhuǎn)變成致癌物亞硝胺。用對(duì)氨基苯磺酸重氮法測(cè)量亞硝酸鹽含量（紫紅色）：在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸形成重氮化合物，再與N-1-萘基乙二胺偶合，形成紫紅色染料與標(biāo)準(zhǔn)顯色液比較、定量分析。

7、 2. 操作步驟操作步驟腌制泡菜腌制泡菜 制備標(biāo)準(zhǔn)顯色液制備標(biāo)準(zhǔn)顯色液 制備樣品處理液制備樣品處理液 比色比色結(jié)果分析計(jì)算結(jié)果分析計(jì)算u腌制條件的控制腌制條件的控制將壇口用水封好，防止外界空氣進(jìn)入壇中要加一些白酒（白酒可抑制泡菜表面雜菌的生長(zhǎng)，是一種調(diào)味劑，可增加醇香感）腌制條件的控制：溫度、食鹽量、腌制時(shí)間溫度過高、食鹽用量不足10、腌制時(shí)間過短，容易造成細(xì)菌大量繁殖，亞硝酸鹽含量增加。一般在腌制10天后，亞硝酸鹽的含量開始下降。、亞硝酸鹽含量的測(cè)定、亞硝酸鹽含量的測(cè)定泡菜亞硝酸鹽含量（泡菜亞硝酸鹽含量（mg/kg）= 樣品亞硝酸鹽含量樣品亞硝酸鹽含量 取樣量（取樣量（40ml濾液）濾液）比

8、色亞硝酸含量單位：比色亞硝酸含量單位：1g= 10-3mg取樣量：取樣量：0.41/260/50040/100 = 9.610-3kgu泡菜亞硝酸鹽含量的計(jì)算泡菜亞硝酸鹽含量的計(jì)算p觀察樣品顏色的變化，并與標(biāo)準(zhǔn)顯色液比較，找出與觀察樣品顏色的變化，并與標(biāo)準(zhǔn)顯色液比較，找出與標(biāo)準(zhǔn)液最相近的顏色，記錄對(duì)應(yīng)的亞硝酸鈉含量，并標(biāo)準(zhǔn)液最相近的顏色，記錄對(duì)應(yīng)的亞硝酸鈉含量，并計(jì)算。每隔計(jì)算。每隔2天測(cè)一次，將結(jié)果記錄下來。天測(cè)一次，將結(jié)果記錄下來。 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1號(hào)壇2號(hào)壇3號(hào)壇1月4日0.150.150.151月8日0.600.200.801月12日0.200.100.601月15日0.

9、100.050.201月19日0.100.05020u解釋數(shù)據(jù)：腌制后的前6天內(nèi)，泡菜中的亞硝酸鹽含量就可以達(dá)到最高峰。由于泡菜在開始腌制時(shí)，壇內(nèi)環(huán)境有利于某些硝酸鹽還原菌的繁殖，可以促進(jìn)硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。第9天后泡菜中的亞硝酸鹽含量開始有明顯下降。隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，泡菜中亞硝酸鹽的含量又有所下降。乳酸細(xì)菌也大量繁殖，對(duì)硝酸鹽還原菌產(chǎn)生一定的抑制作，使其生長(zhǎng)繁殖受到影響。果酒、果醋、腐乳、泡菜相關(guān)內(nèi)容比較比較果酒果醋腐乳泡菜微生物酵母菌醋酸桿菌毛霉菌乳酸菌生物類型真核原核真核原核呼吸類型兼性厭氧酒精需氧醋酸需氧菌絲層厭氧乳酸生殖類型出芽生殖分裂生殖孢子生殖分裂生殖原理無氧分解葡萄糖產(chǎn)生酒

10、精。有 氧 分 解葡 萄 糖 、乙 醇 產(chǎn) 生醋酸。毛 霉 分 解 蛋白質(zhì)和脂肪，配 料 腌 制 生成腐乳香氣。乳 酸 菌 無氧 分 解 葡萄 糖 產(chǎn) 生乳酸。果酒、果醋、腐乳、泡菜相關(guān)內(nèi)容比較比較比較果酒果酒果醋果醋腐乳腐乳泡菜泡菜微生物微生物生物類型生物類型呼吸類型呼吸類型生殖類型生殖類型原理原理微生物的培養(yǎng)與分離主要考查內(nèi)容微生物的培養(yǎng)與分離主要考查內(nèi)容培養(yǎng)基的類型與配制培養(yǎng)基的類型與配制液體、固體、選擇、鑒別液體、固體、選擇、鑒別倒平板、平板倒置倒平板、平板倒置滅菌與消毒滅菌與消毒滅菌與消毒的方法與對(duì)象滅菌與消毒的方法與對(duì)象接種方法接種方法平板劃線法、稀釋涂布平板法平板劃線法、稀釋涂布

11、平板法微生物的培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)溫度、溫度、pH、含氧量、培養(yǎng)箱、天數(shù)、含氧量、培養(yǎng)箱、天數(shù)觀察結(jié)果觀察結(jié)果菌落形態(tài)、菌落周圍透明圈、抑菌圈等菌落形態(tài)、菌落周圍透明圈、抑菌圈等二、酶的研究與應(yīng)用果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用探討加酶洗衣粉的洗滌效果酵母細(xì)胞的固定化1.實(shí)驗(yàn)原理：果膠是植物細(xì)胞壁的主要成分，果膠酶果膠是植物細(xì)胞壁的主要成分，果膠酶和果膠甲酯酶可水解果膠，與制取果汁和果膠甲酯酶可水解果膠，與制取果汁有關(guān)有關(guān)果膠酶適宜溫度范圍：果膠酶適宜溫度范圍：10-50 適適宜宜pH值為值為3.2-5.0相同重量的蘋果泥在不同溫度或相同重量的蘋果泥在不同溫度或pH值下值下和相同時(shí)間內(nèi)比較果汁產(chǎn)量，從而確

12、定和相同時(shí)間內(nèi)比較果汁產(chǎn)量，從而確定果膠酶的最適反應(yīng)溫度或果膠酶的最適反應(yīng)溫度或 pH值值2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)操作步驟操作步驟：設(shè)置不以溫度或設(shè)置不以溫度或pH梯度梯度探究最適溫度或探究最適溫度或pH值值.觀察并記錄數(shù)據(jù)觀察并記錄數(shù)據(jù) 4.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)曲線圖形式表示不同溫度或不同曲線圖形式表示不同溫度或不同pH下，下，制作制作1L果汁與果膠酶用量的關(guān)系，果汁與果膠酶用量的關(guān)系，分解果汁的最適溫度和分解果汁的最適溫度和pH。如何判斷果膠是否被全部分解如何判斷果膠是否被全部分解 果膠不溶于酒精（混濁）果膠不溶于酒精（混濁）. 原理：原理：利用添加了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶

13、利用添加了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶等酶類的洗衣粉，將蛋白質(zhì)、油脂、淀粉、纖維等酶類的洗衣粉，將蛋白質(zhì)、油脂、淀粉、纖維素等類污漬水解成水溶性小分子物質(zhì)。素等類污漬水解成水溶性小分子物質(zhì)。2. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模禾骄吭谑裁礈囟认率褂眉用赶匆路鄣南礈焯骄吭谑裁礈囟认率褂眉用赶匆路鄣南礈煨Ч詈眯Ч詈锰骄科胀ㄏ匆路酆图用赶匆路蹖?duì)衣物污漬探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉對(duì)衣物污漬的洗滌效果的洗滌效果探究添加不同種類酶的洗衣粉其洗滌效果探究添加不同種類酶的洗衣粉其洗滌效果有哪些區(qū)別有哪些區(qū)別.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì).結(jié)果分析與評(píng)價(jià)確定加酶洗衣粉的洗滌效果最好確定加酶洗衣粉的洗滌效果最好的最適溫度的最適溫度比較普

14、通洗衣粉和加酶洗衣粉洗比較普通洗衣粉和加酶洗衣粉洗滌效果滌效果分析各種不同品牌的加酶洗衣粉分析各種不同品牌的加酶洗衣粉對(duì)油漬、汗?jié)n、血漬的洗滌效果對(duì)油漬、汗?jié)n、血漬的洗滌效果1. 實(shí)驗(yàn)原理：酶在催化反應(yīng)中易變性失活，反應(yīng)后不易酶在催化反應(yīng)中易變性失活，反應(yīng)后不易回收再利用，提高成本，影響產(chǎn)品質(zhì)量?；厥赵倮?，提高成本，影響產(chǎn)品質(zhì)量。將酶固定在將酶固定在不溶于水的載體不溶于水的載體上，既能與上，既能與反反應(yīng)物接觸應(yīng)物接觸，又能與，又能與產(chǎn)物分離產(chǎn)物分離，可，可回收反復(fù)回收反復(fù)利用。利用。酶是由酶是由細(xì)胞合成細(xì)胞合成的，直接固定的，直接固定合成酶的細(xì)合成酶的細(xì)胞胞，既操作簡(jiǎn)便，又可降低成本。，既操

15、作簡(jiǎn)便，又可降低成本。. 固定化細(xì)胞技術(shù)固定化酶：固定化酶：是指限制或固定于特定空是指限制或固定于特定空間位置的酶，具體的說，指經(jīng)物理或間位置的酶，具體的說，指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動(dòng)受到限制，而又能發(fā)揮催化失即運(yùn)動(dòng)受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑作用的酶制劑u固定化細(xì)胞固定化技術(shù)：將細(xì)胞限制或定位于固定化技術(shù)：將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細(xì)胞固定特定空間位置的方法稱為細(xì)胞固定化技術(shù)化技術(shù)固定化細(xì)胞：被限制或定位于特定固定化細(xì)胞：被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞空間位置的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞u酶固定的幾種方式示

16、意圖淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)有吸附法將淀粉酶的固定在石英砂上。用淀粉指示劑溶液測(cè)試，流出物呈紅色，表明水解產(chǎn)物糊精生成。三、DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)DNA的粗提取與鑒定多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA段 PCR體外擴(kuò)增DNA技術(shù)血紅蛋白的提取和分離1.實(shí)驗(yàn)原理：NaCl溶液濃度為溶液濃度為0.14mol/L時(shí)，時(shí)，DNA溶解度最低溶解度最低析出析出DNA；DNA不溶于酒精不溶于酒精提純提純DNA；DNA遇二苯胺遇二苯胺(沸水浴沸水浴)能被染成能被染成藍(lán)色藍(lán)色鑒定鑒定DNA. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：制備雞血細(xì)胞液制備雞血細(xì)胞液檸檬酸鈉檸檬酸鈉提取血細(xì)胞的核物質(zhì)提取血細(xì)胞的核物質(zhì)蒸餾水蒸餾水溶解溶解DNA2

17、mol/LNaCl溶液溶液析出析出DNA0.14mol/LNaCl溶溶液液提純提純DNA95冷酒精冷酒精再溶解再溶解DNA2mol/LNaCl鑒定鑒定DNA二苯胺鑒定二苯胺鑒定3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)材料的選擇實(shí)驗(yàn)材料的選擇動(dòng)物：雞血?jiǎng)游铮弘u血（不能選擇哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞）（不能選擇哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞）植物：菜花（用植物細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料時(shí)植物：菜花（用植物細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料時(shí) 需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜）需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜）提取提取DNA的基本思路：的基本思路：利用利用DNA與與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分去除其

18、他成分uDNA在酒精溶液中的溶解性在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離uDNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒有影響沒有影響大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受6080的高溫，而的高溫，而DNA在在80以上才會(huì)變性以上才會(huì)變性洗滌劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋洗滌劑可以溶解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)白質(zhì),但對(duì)但對(duì)DNA沒有影響沒

19、有影響u操作步驟破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞雞血蒸餾水雞血蒸餾水?dāng)嚢钄嚢柽^濾過濾收集濾液收集濾液溶解溶解DNA并去掉濾液中雜質(zhì)并去掉濾液中雜質(zhì)2mol/LNaCl溶液濾液溶液濾液析出析出DNA2mol/LNaCl溶液蒸餾水溶液蒸餾水0.14mol/LNaClDNA析析出出再溶解再溶解DNA2mol/LnaCl溶液析出的溶液析出的DNA析出析出濾液濾液提純提純DNA： 95冷酒精濾液冷酒精濾液靜置靜置min出現(xiàn)白色絲狀物出現(xiàn)白色絲狀物鑒定鑒定DNA2mol/LnaCl溶液溶液mL白色絲狀的白色絲狀的物物mL二苯胺溶液二苯胺溶液沸水浴沸水浴min出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)設(shè)置對(duì)照設(shè)置對(duì)照2mol/LnaCl溶液溶液mLmL二苯胺二苯胺溶液溶液沸水浴沸水浴min沒有藍(lán)色反應(yīng)沒有藍(lán)色反應(yīng)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果：觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組是否變藍(lán)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組是否變藍(lán)1. 實(shí)驗(yàn)原理：通過通過溫度變化溫度變化控制控制DNA的的變性變性和和復(fù)復(fù)性性，可將極微量的靶，可將極微量的靶DNA特異地?cái)U(kuò)增特異地?cái)U(kuò)增上百萬倍上百萬倍通過設(shè)計(jì)相應(yīng)的通過設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物引物，加入，加入四種脫氧四種脫氧核苷酸核苷酸原料、原料、DNA模板、模板、TaqDNA聚合酶聚合酶(耐高耐高93高溫高溫)等，完成特定等，完成特定基因的基因的體外復(fù)制體外復(fù)制。u脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)式O OO OP PO OHOHO堿基堿基