九原生質體融合原理技術應用PPT學習教案

1、會計學1九原生質體融合原理技術應用九原生質體融合原理技術應用歷史沿革基本原理主要實驗技術第2頁/共28頁第1頁/共28頁011、早期嘗試期早期嘗試期2、基礎研究期基礎研究期 營養(yǎng)營養(yǎng)3、新技術建立時期新技術建立時期 原生質體融合原生質體融合 植物細胞固化植物細胞固化 質粒轉化原生質質粒轉化原生質體體 體細胞克隆與變異體細胞克隆與變異4 4、植物生物技術期植物生物技術期 與基因工程結合與基因工程結合 產業(yè)化產業(yè)化第3頁/共28頁第2頁/共28頁02滅菌培養(yǎng)基培養(yǎng)保存第4頁/共28頁第3頁/共28頁021植物材料 滅菌前處理、表面滅菌劑、內感染2培養(yǎng)基 濕熱、過濾3器皿和工具 干熱、濕熱、火焰灼燒

2、4培養(yǎng)室5無菌技術 超凈工作臺 100級滅菌滅菌第5頁/共28頁第4頁/共28頁02水 雙蒸水以上無機鹽 大量 微量有機成分 碳源 蔗糖 葡萄糖 氨基酸 幾種常用的 有能力合成，但刺激生長 產物合成前體 多種混合 維生素 有能力，但不夠 幾種常用的培養(yǎng)基培養(yǎng)基第6頁/共28頁第5頁/共28頁02生長調節(jié)劑 生長素 細胞激動素 促進分裂 打破頂芽休眠 促進莖的分化 赤霉素和脫落酸不確定成分混合物其他物質 瓊脂 活性炭 去除植物細胞產生的 酚類、氧化物、丹寧PH 滅菌前5-6培養(yǎng)基培養(yǎng)基第7頁/共28頁第6頁/共28頁02儀器設備 常用儀器設備 培養(yǎng)器皿和設備 實驗室設置培養(yǎng)條件 溫度 低于植物生

3、長溫度3-4 光照 用于分化的細胞和光自養(yǎng)型細胞 氧培養(yǎng)類型 愈傷組織 生長迅速 疏松 非褐化 單細胞培養(yǎng) 懸浮細胞培養(yǎng) 大量培養(yǎng) 發(fā)酵罐 生物反應器 植物細胞與微生物比較 固定細胞培養(yǎng) 特點 轉化細胞培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)第8頁/共28頁第7頁/共28頁03愈傷組織培養(yǎng)單細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)大量培養(yǎng)固定細胞培養(yǎng)轉化細胞培養(yǎng)細胞保存第9頁/共28頁第8頁/共28頁03愈傷組織培養(yǎng)1外植體的選擇 外植體的來源 部位 年齡 生理狀態(tài) 外植體的大小2培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基的配制 大量成分 微量成分 有機成分 鐵、激動素 按比例混合 調酸堿 定容 分裝 滅菌 定容后加瓊脂 融化 定容 培養(yǎng)基的選擇 外植體 培養(yǎng)基

4、 生長素 激動素四因子3愈傷組織的誘導 接種材料的滅菌 莖段和葉：蠟質 表面活性劑擦 種子：一般的采用莖段和葉片的方法 根和地下器官無菌操作愈傷組織的培養(yǎng)第10頁/共28頁第9頁/共28頁03單細胞培養(yǎng)1單細胞的分離 機械法 酶法 懸浮培養(yǎng)法 愈傷組織在振蕩器中培養(yǎng)， 過濾得到單細胞2單細胞的培養(yǎng) 看護培養(yǎng)：將親本愈傷組織或高密度的懸浮細胞同低密度細胞一起培養(yǎng)，以促進低密度細胞生長、分裂的培養(yǎng)方法。 鋪板培養(yǎng) 微室培養(yǎng) 第11頁/共28頁第10頁/共28頁03懸浮細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)的建立 細胞系的建立 松散色淡的愈傷組織轉入懸浮五代以上 培養(yǎng) 接種量1/5、1/2、1/10 繼代培養(yǎng) 生長模

5、式 封閉系統(tǒng)中S型曲線培養(yǎng)基的選擇 培養(yǎng)基的特點 酸堿緩沖能力差 生長素的濃度 條件培養(yǎng) 低密度培養(yǎng)液中放高密度培養(yǎng)懸浮細胞的透析袋細胞生活力和生長的測定 生活力測定 熒光素二乙酸酯法、伊萬蘭染色法 細胞生長的測定 細胞計數法、干重、鮮重、堆積細胞體積法 第12頁/共28頁第11頁/共28頁03大量培養(yǎng)1高產細胞系的篩選 顏色目視（紫草素） 化學分析（生物堿）2種子的準備 逐級繼代培養(yǎng)3生物反應器的設計 獲得產品生物反應器 得到細胞發(fā)酵罐4培養(yǎng)條件的最適化 混合、通氣、剪切力、溫度、PH5培養(yǎng)系統(tǒng)的操作 成批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)6測定方法 電導率測定、kla測定 第13頁/共28頁第12

6、頁/共28頁03固定細胞培養(yǎng)細胞固定 在膠體中固定植物細胞 在網或泡沫中固定 空心纖維膜中固定固定細胞反應器的設計 流動床式 固定床式第14頁/共28頁第13頁/共28頁03轉化細胞培養(yǎng)轉化 根瘤農桿菌 轉化細胞的建立 葉片 懸浮液 不要沒過 誘導愈傷組織 轉化細胞的培養(yǎng) 農桿菌質粒中攜帶生長素基因轉化細胞的分析 轉化細胞的篩選 抗性基因 報道基因 標記基因 外源基因表達 產物積累（生物、免疫、化學）第15頁/共28頁第14頁/共28頁03細胞保存冷凍保存 冷凍 慢凍 快凍 莖尖保存 分部凍 莖尖 芽 懸浮培養(yǎng) 慢 中間溫度30min 液氮快 干凍 真空脫水 液氮保藏 維持 融冰 液氮迅速37

7、-40度90s后 室溫 再培養(yǎng)冷藏保存 1-9度下仍需繼代培養(yǎng)低壓保存低氧保存第16頁/共28頁第15頁/共28頁植物細胞中主要生理活性物質和其他化學組分植物細胞技術的優(yōu)缺點應用實例一二三第17頁/共28頁第16頁/共28頁011.生理活性物質（1）酶類:淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶（2）維生素:輔酶（3）植物激素（4）抗生素和植物殺菌素:蒜，蔥，蘿卜第18頁/共28頁第17頁/共28頁012.其他成分（后含物）（1）生物堿:罌粟科，茄科（2）糖苷類:洋地黃毒苷（3）揮發(fā)油:薄荷油，丁香油（4）有機酸:蘋果酸，檸檬酸，水楊酸第19頁/共28頁第18頁/共28頁03工業(yè)化產品希臘毛地黃細胞 生物轉化

8、地高辛地高辛日本黃連細胞 黃連堿黃連堿人參根細胞 人參皂甙人參皂甙中試水平長春花 吲哚生物堿丹參 丹參酮青蒿 青蒿素紅豆杉 紫杉醇紫草 萘醌三七 皂甙第20頁/共28頁第19頁/共28頁021、不受地區(qū)、季節(jié)、土壤及有害生物的影響2、節(jié)約農田 3、在無菌條件下完成的, 能排除病菌及蟲害對藥用植物的侵擾; 4、研究植物的代謝途徑, 探索或創(chuàng)造新的合成路線5、人工控制提高代謝物產量 優(yōu)點第21頁/共28頁第20頁/共28頁02(1)生長周期長,易污染。(2)生物反應器的設計裝置要求較高。(3)高產細胞株較難獲得。缺點第22頁/共28頁第21頁/共28頁03發(fā)狀根、冠癭組織細胞培養(yǎng)技術 激素自主 增

9、殖快常規(guī)細胞 次生代謝物含量高、種類廣懸浮培養(yǎng)細胞 桔味薄荷冠癭細胞 萜烯 洋地黃冠癭細胞 強心甙 丹參冠癭細胞 丹參酮 長春花冠癭細胞 吲哚生物堿 人參發(fā)狀根培養(yǎng) 人參皂甙 長春花發(fā)狀根培養(yǎng) 長春堿 青蒿發(fā)狀根培養(yǎng) 青蒿素 蘿芙木發(fā)狀根培養(yǎng) 生物堿第23頁/共28頁第22頁/共28頁03兩相培養(yǎng)技術 培養(yǎng)體系形成上、下兩相,細胞在水相中生長與合成次生物質,然后分泌出來轉移到有機相中。 減少減少反饋抑制反饋抑制 產量產量提高提高 有機相循環(huán)使用有機相循環(huán)使用, ,連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng), ,成本降低成本降低 長春花細胞 XAD-7大孔吸附樹脂 吲哚生物堿 花菱草懸浮細胞 液體硅膠 血根堿 第24頁/共28頁第23頁/共28頁03 美國 白細胞介素 荷蘭 轉基因馬鈴薯 血清白蛋白 南朝鮮 轉基因煙草和番茄 人胰島素 BoyceThompson研究所 馬鈴薯 食用霍亂疫苗 美國 開發(fā)研究煙草 治療人類高歇氏病和費勃萊氏病的酶 新思路：以病毒為載體在植物中生產藥用蛋白，還處在實驗階段藥用蛋白(1)易吸收(2)