引物設計原則(必看)

1、-作者xxxx-日期xxxx引物設計原則(必看)【精品文檔】mi引物設計原則1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA聚合酶進行反應。2. 引物序列在模板內(nèi)應當沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。3. 引物3端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾

2、結(jié)構也可能導致PCR反應失敗。5端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。5. 引物所對應模板位置序列的Tm值在72左右可使復性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)。6. G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應當選用3端G值較低（絕對值不超過9），而5端和中間G值相對較高的引物。引物的3端的G值過高，容易在

3、錯配位點形成雙鏈結(jié)構并引發(fā)DNA聚合反應。7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構的能值過高（超過）易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。8. 對引物的修飾一般是在5端增加酶切位點，應根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應序列而確定。引物序列應該都是寫成5-3方向的，Tm之間的差異最好控制在1度之內(nèi)，另外我覺得擴增長度大一些比較好，500bp左右。要設計引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結(jié)構。如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構，就要避開它。如這一段不能形成二級結(jié)構，那就可以在這一區(qū)域設計引物。 引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性

4、。 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構。 引物長度一般在1530堿基之間。 G+C含量在40%60%之間。 堿基要隨機分布。 引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。1.引物的特異性 引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。 2.避開產(chǎn)物的二級結(jié)構區(qū) 某些引物無效的主要原因是引物重復區(qū)DNA二級結(jié)構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構區(qū)域。用有關計算機軟件可以預測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（G）小于時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)

5、域時，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。 3.長度 寡核苷酸引物長度為1530bp，一般為2027mer。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因為38時，最適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的最適溫度（74),不能保證產(chǎn)物的特異性。 4.G+C含量 G+C含量一般為40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復性條件最佳。 5.堿基

6、礎隨機分布 引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。6.引物自身 引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構牙引物本身復性。這種二級結(jié)構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。 7.引物之間 兩引物之間不應不互補性，尤應避免3端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。 8.引物的3端 引物的延伸是從3端開始的，不能進行任何修飾。3端也不能有形成任何二級結(jié)構可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反

7、應中，引物3端不能發(fā)生錯配。 在標準PCR反應體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800mol/L dNTP（四種dNTP各200mol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95，25s；55，25s；72，1min的循環(huán)參數(shù)擴增HIV-1 gag基因區(qū)的條件下，引物3端錯配對擴增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。AA錯配使產(chǎn)量下降至1/20，AG和CC錯七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。 9.引物的5端 引物的5端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu

8、3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。 10.密碼子的簡并 如擴增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。Hairpin 發(fā)卡結(jié)構如果自由能值大于0 則該結(jié)構不穩(wěn)定從而不會干擾反應如果自由能值小于0 則該結(jié)構可以干擾反應二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向。引物之間形成如果配對區(qū)域在3 末端問題會更為嚴重3 末端配對很容易引起引物二聚體擴增使Pair Rating 匹配度評分匹配度低的引物對常常不太有效是因為在同樣退火溫度下Tm低的引物決定擴增的特異性而Tm高的引物更易于形成非特異性結(jié)合

9、而造成錯誤的起始【1】引物的長度以1530bp為宜，否則會影響擴增的特異性?！?】 】堿基盡可能隨機分布，避免相同的堿基成串排列，引物的G+C含量在4060之間，若G+C含量太低，可在5端加上一些G或C，若GC含量太高，可在5端加上一些A或T?！?】 應避免每條引物內(nèi)部形成二級結(jié)構及兩條引物的3端互補形成引物二聚體，避免在引物的3端有3個G或3個C成串排列，3端的末位堿基最好選T、C、G,而不選A，也有建議在引物的兩端用12個嘌呤堿基?！?】 盡可能使用兩條引物的Tm值相同（最好相差不要超過5），退火溫度根據(jù)較低的Tm值選定，也可以通過改變引物的長度來平衡兩條引物的退火溫度。Tm值可以根據(jù)Tm

10、=4(G+C)+2(A+T)計算。而對于較長的引物，Tm值需要考慮動力學參數(shù)、從“最近鄰位”的計算方式得到，現(xiàn)有的PCR引物設計軟件大多數(shù)都采用這種方式。（注：對于Tm值的計算有爭議的地方是附加序列應不應該計算在內(nèi)，我覺得有值得商討的地方。因為從理論上只有最開始的循環(huán)引物的附加序列是不與模板鏈結(jié)合的，而在后來的PCR反應中，引物的附加序列是和模板鏈結(jié)合了的。）【5】 引物的3端要與模板嚴格配對，而5端堿基沒有嚴格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的部分足夠長，其5端堿基可不與模板DNA配對而呈游離狀態(tài)，這樣，我們可以在引物的5末端加上酶切位點（引入酶切位點時，要考慮到進行雙酶切的共用緩沖液，否則給下

11、游工作帶來困難）、啟動子，方便下游操作?！?】 不要在擴增序列的二級結(jié)構區(qū)設計引物，以免退火困難。也要考慮引物設計處模板的特異性。PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。 要設計引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結(jié)構。如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構，就要避開它。如這一段不能形成二級結(jié)構，那就可以在這一區(qū)域設計引物。 現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設計一對引物。一般引物長度為1530堿基，擴增片段長度為100600堿基對。 讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G C含量

12、一般為40%60%。而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設計的就不合理。應重新尋找區(qū)域設計引物。 同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基的互補。 引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5端加酶切位點序列；標記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3端開始的。這里還需提醒的是3端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。 綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設計原則： 引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級

13、結(jié)構。 引物長度一般在1530堿基之間。 G C含量在40%60%之間。 堿基要隨機分布。 引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。 PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。 1.引物的特異性 引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。 2.避開產(chǎn)物的二級結(jié)構區(qū) 某些引物無效的主要原因

14、是引物重復區(qū)DNA二級結(jié)構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構區(qū)域。用有關計算機軟件可以預測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（G）小于時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。 3.長度 寡核苷酸引物長度為1530bp，一般為2027mer。引物的有效長度：Ln=2（G C） （A T ，Ln值不能大于38，因為38時，最適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的最適溫度（74),不能保證產(chǎn)物的特異性。 4.G C含量 G C含量一般為40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃

15、度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G C） 2（A T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復性條件最佳。 5.堿基礎隨機分布 引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。 6.引物自身 引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構牙引物本身復性。這種二級結(jié)構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。 7.引物之間 兩引物之間不應不互補性，尤應避免3

16、端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。 8.引物的3端 引物的延伸是從3端開始的，不能進行任何修飾。3端也不能有形成任何二級結(jié)構可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應中，引物3端不能發(fā)生錯配。 在標準PCR反應體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800mol/L dNTP（四種dNTP各200mol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95，25s；55，25s；72，1min的循環(huán)參數(shù)擴增HIV-1 gag基因區(qū)的條件下，引物3端錯配對擴增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。AA錯配使產(chǎn)量下降至1/20，AG和CC錯七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。 9.引物的5端 引