紫外分光光度法

1、Ultravioletvisible spectroscopy，UV-Vis華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 范瑞芳范瑞芳 有機(jī)化合物的紫外有機(jī)化合物的紫外可見吸收光譜，是其分子中外層價(jià)電子躍遷的結(jié)果（三可見吸收光譜，是其分子中外層價(jià)電子躍遷的結(jié)果（三種）種）：電子、電子、電子、電子、n電子電子。 分子軌道理論分子軌道理論：一個(gè)成鍵軌道必定一個(gè)成鍵軌道必定有一個(gè)相應(yīng)的反鍵軌道。通常外層電有一個(gè)相應(yīng)的反鍵軌道。通常外層電子均處于分子軌道的基態(tài)，即成鍵軌子均處于分子軌道的基態(tài)，即成鍵軌道或非鍵軌道上。道或非鍵軌道上。 外層電子吸收紫外或可見輻射后，就從外層電子吸收紫外或可見輻射后，

2、就從基態(tài)基態(tài)向向激發(fā)態(tài)（反鍵軌道激發(fā)態(tài)（反鍵軌道) )躍遷躍遷。主要有四種躍遷所需能量主要有四種躍遷所需能量大小順序?yàn)榇笮№樞驗(yàn)椋簄 n n n 第一節(jié)第一節(jié) 紫外紫外可見吸收光譜的基本概念與原理可見吸收光譜的基本概念與原理一、紫外一、紫外-可見吸收光譜的基本原理可見吸收光譜的基本原理躍遷躍遷 所需能量最大，所需能量最大，電子只有吸收遠(yuǎn)紫外光的能量才能發(fā)生躍遷。電子只有吸收遠(yuǎn)紫外光的能量才能發(fā)生躍遷。飽飽和烷烴的分子吸收光譜出現(xiàn)在遠(yuǎn)紫外區(qū)和烷烴的分子吸收光譜出現(xiàn)在遠(yuǎn)紫外區(qū)(吸收波長吸收波長200nm。這類躍遷在躍遷選律上屬于禁阻這類躍遷在躍遷選律上屬于禁阻躍遷，躍遷，摩爾吸光系數(shù)一般為摩爾吸光

3、系數(shù)一般為10100 Lmol-1 cm-1，吸收譜帶強(qiáng)度較弱。分吸收譜帶強(qiáng)度較弱。分子中孤對電子和子中孤對電子和鍵同時(shí)存在時(shí)發(fā)生鍵同時(shí)存在時(shí)發(fā)生n 躍遷。丙酮躍遷。丙酮n 躍遷的躍遷的為為275nm, max為為22 Lmol-1 cm -1（溶劑環(huán)己烷溶劑環(huán)己烷)。二、生色團(tuán)與助色團(tuán)二、生色團(tuán)與助色團(tuán)生色團(tuán)：生色團(tuán)： 最有用的紫外最有用的紫外可見光譜是由可見光譜是由和和n躍遷躍遷產(chǎn)生的產(chǎn)生的。這兩種躍這兩種躍遷均要求有機(jī)物分子中含有遷均要求有機(jī)物分子中含有不飽和基團(tuán)。不飽和基團(tuán)。這類含有這類含有鍵的不飽和基團(tuán)稱為鍵的不飽和基團(tuán)稱為生色團(tuán)。生色團(tuán)。簡單的生色團(tuán)由雙鍵或叁鍵體系組成，如乙烯基、

4、羰基、亞硝簡單的生色團(tuán)由雙鍵或叁鍵體系組成，如乙烯基、羰基、亞硝基、偶氮基基、偶氮基NN、乙炔基、腈基乙炔基、腈基CN等。等。助色團(tuán)：助色團(tuán)： 有一些含有有一些含有n n電子的基團(tuán)電子的基團(tuán)(如如OH、OR、NH、NHR、X等等)，它們本身沒有生色功能它們本身沒有生色功能( (不能吸收不能吸收200nm200nm的光的光) )，但當(dāng)它們與生色團(tuán)相，但當(dāng)它們與生色團(tuán)相連時(shí)，就會發(fā)生連時(shí)，就會發(fā)生n n共軛作用，增強(qiáng)生色團(tuán)的生色能力共軛作用，增強(qiáng)生色團(tuán)的生色能力( (吸收波長向長吸收波長向長波方向移動，且吸收強(qiáng)度增加波方向移動，且吸收強(qiáng)度增加) )，這樣的基團(tuán)稱為，這樣的基團(tuán)稱為助色團(tuán)。助色團(tuán)。由

5、于取代基或溶劑的影響造成有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的變化，使 吸收峰向長波方向移動的現(xiàn)象稱為吸收峰“紅移紅移”。 能使有機(jī)化合物的max 向長波方向移動的基團(tuán)（如助色團(tuán)、生色團(tuán)）稱為向紅基團(tuán)。由于取代基或溶液的影響造成有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的變化，使 吸收峰向短波方向移動的現(xiàn)象稱為吸收峰“藍(lán)移藍(lán)移”。 能使有機(jī)化合物的max 向短波方向移動的基團(tuán)（如-CH3，-O-CO-CH3等）稱為向藍(lán)基團(tuán)。三、紅移與三、紅移與三、紅移與三、紅移與三、紅移與三、紅移與藍(lán)移藍(lán)移藍(lán)移藍(lán)移藍(lán)移藍(lán)移由于有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)變化使吸收峰摩爾吸光系數(shù)增加的現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)增色效應(yīng)。由于有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)變化使吸收峰的摩爾吸光系數(shù)減小的現(xiàn)象稱為減

6、色效應(yīng)減色效應(yīng)。*躍遷躍遷可以發(fā)生在任何具有不飽和鍵的有機(jī)化合物分子中，其最大摩爾吸光率很大，吸收峰隨溶劑極性增加向長波方向移動，即產(chǎn)生紅移紅移。下表列出了一些常見生色團(tuán)*躍遷的吸收特性。生色團(tuán)生色團(tuán)化合物化合物溶劑溶劑羰基羰基正己烷正己烷188900烯烯正庚烷正庚烷17713000炔炔正庚烷正庚烷17810000max/nmmaxH3CCCH3OC6H13CHCH2C5H11CCCH3另有一些基團(tuán)，本身并不產(chǎn)生吸收峰，但與生色團(tuán)共存于同一分子時(shí)，可引起吸收峰的位移和吸收強(qiáng)度的改變，這些基團(tuán)稱為助色團(tuán)助色團(tuán)。如苯環(huán)的一個(gè)氫原子被一些基團(tuán)取代后，苯環(huán)在254nm處的吸收帶的最大吸收位置和強(qiáng)度就會

7、改變?；衔锘衔锶〈〈奖?54300氯苯氯苯264320溴苯溴苯262325苯酚苯酚2731780苯甲醚苯甲醚2722240max/nmmaxClBrOHOCH3OH當(dāng)一個(gè)分子中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的生色團(tuán)時(shí)，按相互間的位置可以分為共共軛軛和非共軛非共軛兩種情況：非共軛時(shí)，各個(gè)生色團(tuán)各自獨(dú)立吸收，吸收帶由各生色團(tuán)的吸收帶疊加吸收帶疊加而成；共軛時(shí)，生色團(tuán)原有的吸收峰會發(fā)生改變吸收峰會發(fā)生改變，可產(chǎn)生新的吸收峰。下表列出了一些有關(guān)共軛結(jié)構(gòu)的化合物的吸收特性。化合物化合物共軛雙鍵數(shù)共軛雙鍵數(shù)11955000220010000221721000325425000325835000C H3C

8、HC H2C O O HH(CHCH)3HH2CC HC HC H2CH2CHCO O HCH2CH2max/nmmax四、常見有機(jī)化合物紫外吸收光譜四、常見有機(jī)化合物紫外吸收光譜1. 飽和烴飽和烴飽和單鍵碳?xì)浠衔镏挥须娮?，因而只能產(chǎn)生 * 躍遷。由于電子最不易激發(fā)，需要吸收很大的能量，才能產(chǎn)生 * 躍遷，因而這類化合物在 200nm 以上無吸收。所以它們在紫外光譜分析中常用作溶劑使用中常用作溶劑使用，如：己烷、環(huán)己烷、庚烷等。當(dāng)飽和單鍵碳?xì)浠衔镏械臍浔谎?、氮、鹵素、硫等原子取代時(shí)，這類化合物既有電子，又有n 電子，可以實(shí)現(xiàn) * 和 n * 躍遷，其吸收峰可以落在遠(yuǎn)紫外區(qū)和近紫外區(qū)。例如：

9、甲 烷的吸收峰在 125nm，而 碘甲烷的 * 躍遷為 150210nm，n * 躍遷為 259nm；氯甲烷相應(yīng)為 154161nm 及 173nm?？梢?，烷烴和鹵代烴的紫外吸收很小，它們的紫外吸收光譜直接用于分析這類化合物的價(jià)值不大。不過，飽和醇類化合物如甲醇、乙醇都由于在近紫外區(qū)無吸收，常被用作紫外光譜分析的溶劑。2. 不飽和脂肪烴不飽和脂肪烴3. 芳香化合物芳香化合物4. 雜環(huán)化合物雜環(huán)化合物五、影響紫外五、影響紫外-可見吸收光譜的因素可見吸收光譜的因素 物質(zhì)的吸收光譜與測定條件有密切的關(guān)系。測定條件（溫度、溶劑極性、物質(zhì)的吸收光譜與測定條件有密切的關(guān)系。測定條件（溫度、溶劑極性、pH等

10、）不同，等）不同，吸收光譜的形狀、吸收峰的位置、吸收強(qiáng)度吸收光譜的形狀、吸收峰的位置、吸收強(qiáng)度等都可能發(fā)生變化。等都可能發(fā)生變化。1.溫度溫度 在室溫范圍內(nèi)，溫度對吸收光譜的影響不大。在室溫范圍內(nèi)，溫度對吸收光譜的影響不大。2. 溶劑溶劑 注意如下幾點(diǎn)：注意如下幾點(diǎn)： （1）同一種物質(zhì)由于使用的溶劑不同，得到的紫外）同一種物質(zhì)由于使用的溶劑不同，得到的紫外可見吸收光譜的峰形和可見吸收光譜的峰形和最大吸收位置可能不一樣，所以在測定物質(zhì)的吸收光譜時(shí)，一定要注明所使最大吸收位置可能不一樣，所以在測定物質(zhì)的吸收光譜時(shí)，一定要注明所使用的溶劑用的溶劑（2）盡量選用低極性溶劑；）盡量選用低極性溶劑；（3）

11、能很好地溶解被測物，并且形成的溶液具有良好的化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性；）能很好地溶解被測物，并且形成的溶液具有良好的化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性；（4）溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)無明顯吸收。）溶劑在樣品的吸收光譜區(qū)無明顯吸收。3.pH值值圖4 紅茶樣品與標(biāo)樣1（波長：196nm;流動相：乙腈 1%磷酸水溶液=5 95（體積比）a為標(biāo)樣1的色譜曲線b為紅茶樣品12的色譜曲線NHOONH2OH茶氨酸的分子式圖a, b,c為不同濃度茶氨酸標(biāo)樣在在196nm下的色譜圖。(茶氨酸標(biāo)樣用甲醇溶劑配制）。圖d為甲醇在196nm下的色譜圖。abcd第二節(jié)第二節(jié) 紫外吸收光譜的應(yīng)用紫外吸收光譜的應(yīng)用一、定性鑒定一、定性鑒定1.1

12、未知試樣的定性未知試樣的定性鑒定鑒定將經(jīng)提純的樣品和標(biāo)準(zhǔn)物用相同溶劑配成溶液，并在相同條件下繪制吸收光譜曲線，比較其吸收光譜是否一致。如果紫外光譜曲線完全相同（包括曲線形狀、max、min，吸收峰數(shù)目、拐點(diǎn)及max 等）。則可初步認(rèn)為是同一種化合物。為了進(jìn)一步確認(rèn)可更換一種溶劑重新測定后再作比較. 如果沒有標(biāo)準(zhǔn)物，則 可借助各種有機(jī)化合物的紫外可見標(biāo)準(zhǔn)譜圖及有關(guān)電子光譜的文獻(xiàn)資料進(jìn)行比較。最常用的譜圖資料是薩特勒標(biāo)準(zhǔn)譜圖及手冊. 紫外-可見吸收光譜一般不用于化合物的結(jié)構(gòu)分析，但利用紫外吸收光譜鑒定化合物中的共軛結(jié)構(gòu)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)還是有一定價(jià)值。例如，某化合物在近紫外區(qū)內(nèi)無吸收，說明該物質(zhì)無共軛結(jié)構(gòu)

13、和芳香結(jié)構(gòu)。1.2 推測化合物的分子結(jié)構(gòu)推測化合物的分子結(jié)構(gòu)1.3化合物純度的檢測化合物純度的檢測 用紫外吸收光譜確定試樣的純度是比較方便的。 如蛋白質(zhì)與核酸的純度分析中，可用A280/A260的比值，鑒定其純度。 當(dāng)A260/A280 2.0，表示RNA含量較高 當(dāng)A260/A280=1.82.0，表示DNA較純因?yàn)楹怂嶂泻泄曹椀膲A基，蛋白質(zhì)中含有一些芳香族氨基酸（含有共軛雙鍵），蛋白質(zhì)與核酸的濃度在260 nm處與紫外吸收波長成正比，蛋白質(zhì)在280nm處有吸收峰，有公式計(jì)算：DNA濃度（ng /L）=A26050稀釋倍數(shù) （1）待上樣： （2）上樣： （3）上樣30min （4）上樣60

14、min（5）加洗脫液20min （6）加洗脫液40min（7）接取洗脫溶液 （8）洗脫完畢可見A618.5nm時(shí)出現(xiàn)峰值1.555，又由于A258.5nm和A310.5時(shí)出現(xiàn)峰值2.476和0.491，且兩點(diǎn)間近似于直線關(guān)系，于是可得A280nm約等于1.655。最終A618.5/ A280=0.94。所得純度與一般認(rèn)可值4相比較低。取A620nm吸收最大一管在紫外可見光譜儀作200nm700nm掃描得到以下結(jié)果：二、朗伯二、朗伯-比爾定律比爾定律朗伯朗伯-比爾定律比爾定律：當(dāng)一束平行單色光通過含有吸光物質(zhì)當(dāng)一束平行單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時(shí)，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積的稀

15、溶液時(shí)，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積成正比成正比，即，即 A= cl 式中比例常數(shù)式中比例常數(shù)與吸光物質(zhì)的本性，入射光波長及溫度等與吸光物質(zhì)的本性，入射光波長及溫度等因素有關(guān)。因素有關(guān)。c為吸光物質(zhì)濃度，為吸光物質(zhì)濃度，l為透光液層厚度。為透光液層厚度。 -朗伯朗伯-比爾定律是紫外比爾定律是紫外-可見分光光度法定量的理論基礎(chǔ)可見分光光度法定量的理論基礎(chǔ)三、吸光系數(shù)三、吸光系數(shù)當(dāng)l以cm，c以g/L為單位，稱為吸光系數(shù)，用 a表示。A= a cla的單位為L/(g.cm)朗伯朗伯比耳定律只適用于稀溶液。比耳定律只適用于稀溶液。四、偏離朗伯四、偏離朗伯-比耳定律的因素比耳定律的因素（1

16、）入射光為非單色光）入射光為非單色光 難以獲得真正的純單色光難以獲得真正的純單色光。 朗朗比耳定律的前提條件之一是入射光為比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。單色光。 分光光度計(jì)只能獲得近乎單色的狹窄光帶。分光光度計(jì)只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復(fù)合光可導(dǎo)致對朗伯復(fù)合光可導(dǎo)致對朗伯比耳定律的正或負(fù)偏離。比耳定律的正或負(fù)偏離。 非單色光、雜散光、非平行入射光都會引起非單色光、雜散光、非平行入射光都會引起對朗伯對朗伯比耳定律的偏離，最主要的是非單色光比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。作為入射光引起的偏離。 為克服非單色光引起的偏離，首先應(yīng)選擇比較好的單色器。此外還應(yīng)將入射波

17、長選定在待測物質(zhì)的最大吸收波長且吸收最大吸收波長且吸收曲線較平坦處曲線較平坦處。（2）溶液的不均性。）溶液的不均性。實(shí)際樣品的混濁，加入的保護(hù)膠體，蒸餾水中的微生物，存在散射以及共振發(fā)射等，均可吸光質(zhì)點(diǎn)的吸光特性變化大。（4）光程的不一致性。）光程的不一致性。光源不是點(diǎn)光源，比色皿光徑長度不一致，光學(xué)元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光徑不一致，從而與定律偏離。測量前的化學(xué)預(yù)處理工作是十分重要的，如控制好顯色反應(yīng)條件，控制溶液的化學(xué)測量前的化學(xué)預(yù)處理工作是十分重要的，如控制好顯色反應(yīng)條件，控制溶液的化學(xué)平衡等，以防止產(chǎn)生偏離吸收定律。平衡等，以防止產(chǎn)生偏離吸收定律。（3）溶液的化學(xué)因素引起偏離

18、）溶液的化學(xué)因素引起偏離溶液中的吸光物質(zhì)因離解、締合，形成新的化合物而改變了吸光物質(zhì)的濃度，導(dǎo)致偏離吸收定律；（5）比爾定律的局限性引起偏離）比爾定律的局限性引起偏離嚴(yán)格說，比爾定律是一個(gè)有限定律，它只適用于濃度小于0.01mol.L-1 的稀溶液。因?yàn)闈舛雀邥r(shí)，吸光粒子間平均距離減小，以致每個(gè)粒子都會影響其鄰近粒子的電荷分布。這種相互作用使它們的摩爾吸光系數(shù)發(fā)生改變，因而導(dǎo)致偏離比爾定律。為此，在實(shí)際工作中，待測溶液的濃度應(yīng)控制在待測溶液的濃度應(yīng)控制在 0.01 molL-1 以下以下。pH=7.5的緩沖液定容至25mL在540nm處測定茶飲料5mL酒石酸亞鐵5mL蒸餾水9mL顯色液A1 底

19、色液A2 空白對照 茶多酚 分光光度法 茶葉中多酚類物質(zhì)能與亞鐵離子形成紫藍(lán)色絡(luò)合物。用分光光度法測定其含量。 2526線性回歸得：20.8270.0765,0.9989yxR故茶游離氨基酸在0.007mg0.341mg之間，線性關(guān)系良好 根據(jù)GB/T 8314-2002 茶 游離氨基酸總量，用茚三酮比色法檢測茶飲料中游離氨基酸的含量。以茶氨酸標(biāo)樣的質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，ABS值為縱坐標(biāo)，繪制茶氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。 茚三酮比色法分析茶飲料中的游離氨基酸-氨基酸在pH8.0的條件下與茚三酮共熱，形成紫色絡(luò)合物，用分光光度法在特定的波長下測定其含量。第三節(jié)紫外第三節(jié)紫外-可見分光光度計(jì)可見分光光度計(jì)一、主要部件的性能與作用一、主要部件的性能與作用 基本結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu):光源光源單色器單色器吸收池吸收池檢測器檢測器信號顯示系統(tǒng)信號顯示系統(tǒng) 樣