被子植物開花時(shí)間和花器官發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控研究進(jìn)展

1、園 藝 學(xué) 報(bào) 2014，41（6）：12451256 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20131108；修回日期：20140410 基金項(xiàng)目：中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2571014EA03）；林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（東北林業(yè)大學(xué)）創(chuàng)新項(xiàng)目（C201016）；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C201016）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2013RFLXJ015） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：qijiangx

2、u；Tel 被子植物開花時(shí)間和花器官發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控研究進(jìn)展 李 巍，徐啟江* （東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040） 摘 要：成花轉(zhuǎn)換是被子植物生活周期中的關(guān)鍵發(fā)育過程，植物通過調(diào)控基因表達(dá)模式而整合多條內(nèi)外開花信號(hào)實(shí)現(xiàn)成花誘導(dǎo)。近幾十年來(lái)，學(xué)者們?yōu)殛U釋植物成花轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制做了大量的分子遺傳學(xué)研究。其中，影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的表觀遺傳修飾是調(diào)控成花轉(zhuǎn)換過程的重要分子機(jī)制之一。表觀遺傳調(diào)控是植物在適宜環(huán)境條件下實(shí)現(xiàn)開花誘導(dǎo)和花器官發(fā)育的決定性因素。綜述了有關(guān)開花時(shí)間和花器官發(fā)育的表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展，包括染色質(zhì)重塑、組蛋白甲基

3、化和miRNAs。 關(guān)鍵詞：被子植物；表觀遺傳；染色質(zhì)重塑；miRNA；開花時(shí)間；花器官發(fā)育 中圖分類號(hào)：S 68；Q 945.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0513-353X（2014）06-1245-12 Epigenetic Research Progress on Flowering Time and Flower Organ Development in Angiosperms LI Wei and XU Qi-jiang* （The State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，College of Life Sciences

4、，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China） Abstract：The floral transition is a critical developmental process in angiosperms life cycle. Plants integrate multiple endogenous and environmental signals through gene expression pattern changes to result in flowering. Over the past few decades，e

5、xtensive molecular genetic studies have elucidated the molecular mechanisms governing the floral transition. One key molecular mechanism for this transition involves epigenetic modifications that affect a number of aspects of plant growth and development. Epigenetic control is determinative in plant

6、s for coordinating the switch to flowering under favorable internal and external conditions and achieving reproductive success. In this review，research progress on the epigenetic regulation associated with flowering time and floral organ development. These epigenetic modifications include chromatin

7、remodeling，histone methylation，and the miRNAs that mediate epigenetic modifications. Key words：angiosperms；epigenetic；chromatin remodeling；miRNAs；flowering time；floral organ development 1246 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 被子植物，即有花植物，是植物界進(jìn)化最高級(jí)、種類最多、分布最廣的類群，約有35萬(wàn)種。植物開花過程是個(gè)復(fù)合的多步驟過程，適當(dāng)?shù)拈_花時(shí)間對(duì)植物的成功繁殖很重要。植物開花時(shí)間和花器官發(fā)育受到眾多基因的復(fù)

8、雜調(diào)控，其中包括花器官特征基因、開花整合因子和一些進(jìn)化保守的microRNAs（miRNAs）。隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷進(jìn)步和發(fā)展，人們已經(jīng)從眾多模式植物如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、矮牽牛（Petunia hybrida）、金魚草（Antirrhinum majus）等分離并鑒定了包括miRNAs在內(nèi)的許多影響植物開花時(shí)間和花器官發(fā)育的基因與調(diào)控因子。表觀遺傳學(xué)（epigenetics）是指DNA序列未發(fā)生變化，但是基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變。不僅是基因組序列包含遺傳信息，其修飾也可以記載遺傳信息。表觀遺傳現(xiàn)

9、象包括DNA甲基化、RNA干擾、組蛋白修飾等。近年來(lái)在開花基因座C（FLOWERING LOCUS C，F(xiàn)LC）表觀遺傳調(diào)控過程中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），即冷誘導(dǎo)的長(zhǎng)鏈基因內(nèi)反義RNA（cold induced long antisense intragenic RNA，COOLAIR）和冷輔助內(nèi)含子非編碼RNA（cold assisted intronic noncoding RNA，COLDAIR），二者通過寒冷誘導(dǎo)，促進(jìn)春化過程的發(fā)生。這兩個(gè)IncRNAs的研究為春化作用調(diào)控機(jī)制提供了新思路。目前發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在表觀遺傳學(xué)的調(diào)控

10、中也起到重要作用。同時(shí)，作為開花負(fù)調(diào)控因子，F(xiàn)LC是調(diào)控植物開花時(shí)間的關(guān)鍵基因，通過FLC染色質(zhì)修飾而實(shí)現(xiàn)對(duì)其調(diào)控作用。表觀遺傳是被子植物開花信號(hào)通路中的重要機(jī)制，對(duì)開花及花器官發(fā)育產(chǎn)生關(guān)鍵調(diào)控作用，深入解析表觀遺傳調(diào)控開花的機(jī)理，將為通過表觀遺傳途徑調(diào)控花發(fā)育奠定理論基礎(chǔ)。本文中主要綜述了染色體重塑、組蛋白甲基化和miRNA（包括miRNA172、miRNA156、miRNA159、miRNA169、miRNA319及miRNA167/160）對(duì)被子植物開花時(shí)間及花器官發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展。 1 染色體重塑對(duì)植物春化的影響 在真核生物中，染色質(zhì)是由DNA和組蛋白一起被壓縮成的一個(gè)高度有序的

11、結(jié)構(gòu)。核小體是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，其核心是由H2A、H2B、H3、H4各兩個(gè)分子所組成的組蛋白八聚體，每一個(gè)核小體中都有146 bp的DNA纏繞在組蛋白八聚體上，核小體之間由組蛋白H1和DNA結(jié)合。染色質(zhì)重塑（chromatin remodeling）就是基因表達(dá)調(diào)控過程中出現(xiàn)的一系列染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的總稱。 春化作用（vernalization）為低溫（一般4 ，14 15 d）誘導(dǎo)開花，它只是誘導(dǎo)植物開花的必要條件，而不是充分條件，經(jīng)過春化處理的幼苗在常溫下不會(huì)立即開花，需要數(shù)周以后才能開花，低溫誘導(dǎo)和開花之間這種明顯的時(shí)間間隔表明植物細(xì)胞有記憶功能經(jīng)春化處理的植物回到常溫后，F(xiàn)LC mR

12、NA水平仍然很低，這種低水平不會(huì)因有絲分裂而改變。 在春化之前FLC位點(diǎn)的染色質(zhì)是有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的，在冷處理之前FLC的表達(dá)水平和激活型組蛋白修飾H3K4三甲基化水平很高。催化H3K4甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶Set1/COMPASS（complex of proteins associated with Set1）復(fù)合體與啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄早期的RNA聚合酶復(fù)合物結(jié)合，給FLC染色體打上“活性”標(biāo)簽，而且這個(gè)標(biāo)簽會(huì)被RNA聚合酶相關(guān)因子1（RNA-polymerase associated factor 1，PAF1）識(shí)別進(jìn)行激活轉(zhuǎn)錄。在寒冷環(huán)境下，F(xiàn)LC染色質(zhì)從“激活”到“抑制”狀態(tài)發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變，并伴隨著

13、抑制型組蛋白的修飾H3K9和H3K27甲基化的增加。在這個(gè)過程中有3個(gè)重要因子VERNALIZATION INSENSITIVE 3（VIN3）、VERNALIZATION 1（VRN1）和VRN2起作用（Gendall et al.，2001；Levy et al.，2002；Sung & Amasino，2004），并推測(cè)VRN1、VRN2和VIN3對(duì)FLC基因表達(dá)調(diào)控是通過調(diào)節(jié)FLC 基因染色質(zhì)中組蛋白不同化學(xué)修飾狀態(tài)實(shí)現(xiàn)的。人們普遍認(rèn)為植物同源結(jié)構(gòu)域（plant homeodomain，PHD）參與蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，常見于染色質(zhì)重塑復(fù)合體各個(gè)成員的分子結(jié)構(gòu)中（Sung & Amas

14、ino，2004）。VIN3編碼的PHD結(jié)構(gòu)域蛋白與染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的6期 李 巍等：被子植物開花時(shí)間和花器官發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控研究進(jìn)展 1247 變化有關(guān)（Sung & Amasino，2004）。在vin3突變體中FLC含量沒有下降，證明了VIN3在形成FLC染色質(zhì)抑制狀態(tài)起到了重要作用。VRN1和VRN2蛋白通過維持由VIN3引起的H3K9和H3K27甲基化來(lái)維持FLC的抑制狀態(tài)。VRN2編碼鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，通過對(duì)組蛋白氨基端特異氨基酸脫乙?；图谆揎検谷旧|(zhì)保持沉默狀態(tài)。VRN1編碼一種植物特有的DNA結(jié)合蛋白（Levy et al.，2002），改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)。 春化過程中，F(xiàn)LC的

15、表達(dá)活性逐漸減弱，植物同源域多梳蛋白抑制復(fù)合體2（plant homeodomain- polycomb repressive complex 2，PHD-PRC2）結(jié)合到FLC上。最近的研究表明，PRC2作為一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，主要促進(jìn)H3K27三甲基化。除了PRC2的核心部分，PHD-PRC2還含有植物特異性組分，可以提高PRC2組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性。同時(shí)在冷處理過程中，F(xiàn)LC位點(diǎn)的H3K27me3水平不斷上升。雖然H3K27me3對(duì)于維持FLC沉默是必要的，但是還不夠，在vernalization1（vrn1）突變體中，春化結(jié)束后FLC活性得到恢復(fù)，即使高甲基化水平的H3K27仍然存在

16、（Bastow et al.，2004）。H3K27me3不能直接引起染色體的壓縮或者抑制轉(zhuǎn)錄，但是可以抑制起始FLC轉(zhuǎn)錄的蛋白因子對(duì)FLC啟動(dòng)子序列的識(shí)別。PRC2自身結(jié)合H3K27me3，可以對(duì)未修飾的新合成蛋白質(zhì)進(jìn)行甲基化處理，從而使這個(gè)標(biāo)記在整個(gè)細(xì)胞分裂過程中穩(wěn)定遺傳。但是，PcG（polycomb group）蛋白復(fù)合體缺乏與DNA結(jié)合的能力，那么它們是如何結(jié)合到FLC這樣的靶基因上的？大量試驗(yàn)證明，兩個(gè)非編碼的RNA參與了春化誘導(dǎo)的PHD-PRC2與FLC結(jié)合。調(diào)節(jié)FLC表觀沉默的lncRNA COLDAIR，其轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)1.1 kb，由FLC正義鏈第1個(gè)內(nèi)含子形成，具有5帽子結(jié)構(gòu)，

17、但是缺少3多聚腺苷酸（poly A）結(jié)構(gòu)。研究顯示PHD-PRC2復(fù)合體的催化亞基卷葉蛋白（CURLY LEAF，CLF）可以結(jié)合到COLDAIR RNA上（Heo & Sung，2011）。這個(gè)過程可以幫助PHD-PRC2與FLC結(jié)合。對(duì)COLDAIR進(jìn)行RNA干涉會(huì)減少CLF與FLC的結(jié)合，最終損害冷處理后FLC沉默的維持。第2個(gè)非編碼RNA即COOLAIR，也來(lái)自于FLC（Swiezewski et al.，2009），由RNA聚合酶（RNA polymerase，Pol）轉(zhuǎn)錄，是植物體內(nèi)天然存在的FLC反向轉(zhuǎn)錄本，具有典型的5帽子結(jié)構(gòu)和3 poly A結(jié)構(gòu)。像COLDAIR一樣，COO

18、LAIR的表達(dá)也會(huì)在冷處理后顯著上調(diào)。在春化過程中，F(xiàn)LC編碼區(qū)3端下游啟動(dòng)子啟動(dòng)COOLAIR表達(dá)。根據(jù)剪切方式的不同，COOLAIR分為近端和遠(yuǎn)端兩種類型。COOLAIR轉(zhuǎn)錄本在近端和遠(yuǎn)端分別有兩個(gè)多聚腺苷酸化位點(diǎn)。在COOLAIR遠(yuǎn)3端的聚腺苷酸化與FLC的高豐度表達(dá)相關(guān)。在近3端與FLC的低豐度表達(dá)相關(guān)。兩個(gè)自主途徑基因FCA和FPA編碼RNA結(jié)合蛋白，促進(jìn)了COOLAIR轉(zhuǎn)錄本近多聚腺苷酸化位點(diǎn)3端的形成，清除了激活型組蛋白修飾（FLC的H3K4me3）（Hornyik et al.，2010；Liu et al.，2010a），最終引起FLC轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)促進(jìn)開花。 2 miRNA調(diào)

19、控植物開花時(shí)間 2.1 miRNA的合成 miRNA是由內(nèi)源基因編碼、長(zhǎng)度約21 23 nt的非編碼小RNA分子，作為負(fù)調(diào)控因子主要在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的活性（Httenhofer et al.，2002），通過與靶基因的互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合而降解或抑制靶mRNA的翻譯。植物存在大量的miRNAs家族，miRNA在調(diào)控植物發(fā)育方面發(fā)揮著廣泛的作用。從成花誘導(dǎo)到花器官特征屬性的形成，miRNA在整個(gè)花發(fā)育過程均發(fā)揮著關(guān)鍵作用（Llave et al.，2002；Park et al.，2002；Reinhart et al.，2002）。miRNA通常由獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位編碼，由核酸內(nèi)切酶Dicer加工而

20、成，Dicer酶特異性的對(duì)具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的70 90 nt的雙鏈RNA前體（pre-miRNA）進(jìn)行剪切，產(chǎn)生miRNA/miRNA*二聚體，而后miRNA選擇性的整合到AGO（argonaute）等蛋白質(zhì)上而形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA induced silencing complex，RISC）。此時(shí)miRNA*從AGO復(fù)1248 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 合物中脫離，RISC通過抑制靶基因的翻譯或者對(duì)靶基因進(jìn)行切割，從而調(diào)控基因的表達(dá)。在擬南芥中的10個(gè)AGO家族蛋白，其中AGO1是miRNA合成途徑中最重要的因子。 2.2 miRNA172調(diào)控?cái)M南芥開花時(shí)間 擬南芥MIR172基因組

21、包含5類：MIR172a、MIR172b、MIR172c、MIR172d和MIR172e?；趍iR172對(duì)開花調(diào)控機(jī)理的研究，miR172已成為翻譯抑制最好的例子（Chen，2004）。最近的研究顯示miR172可以通過降解靶基因mRNA（Jung et al.，2007；Wollmann et al.，2011）來(lái)進(jìn)行調(diào)控。在擬南芥中，miR172調(diào)控具有miR172結(jié)合位點(diǎn)的APETALA2（AP2）類轉(zhuǎn)錄因子基因，包括AP2、TARGET OF EAT1（TOE1）、TOE2、TOE3、SCHLAFMUTZE（SMZ）和SCHNARCHZAPFEN（SNZ）。 Aukerman和Sak

22、ai（2003）首次發(fā)現(xiàn)miR172對(duì)于開花時(shí)間的調(diào)控作用。miR172b過表達(dá)突變體植株（eat-D）是早花突變體。與35S：miR172早花表型相比，miR172的靶基因TOE1過表達(dá)導(dǎo)致了晚花表型。這個(gè)觀察證明了TOE1是控制開花時(shí)間的抑制因子。與此相同，toe1的缺失突變體導(dǎo)致開花稍微提前，這個(gè)表型在TOE2基因的缺失突變體中加強(qiáng)了。然而toe1 toe2雙突變體開花時(shí)間仍然比miR172過表達(dá)突變體晚，意味著除了TOE1和TOE2還有其他因子抑制開花。最近的研究表明SMZ和SNZ過表達(dá)突變體開花比野生型晚，雖然smz snz雙突變體的開花時(shí)間沒有受到顯著影響（Mathieu et a

23、l.，2009），但是toe1 toe2 smz snz四突變體開花比toe1 toe2雙突變體早很多。但是四突變體開花卻比35S：miR172株系晚，證明除了AP2家族，仍然有其他基因起到抑制作用。 AP2家族基因通過編碼轉(zhuǎn)錄抑制子來(lái)控制開花時(shí)間。AP2可以直接結(jié)合到開花途徑的整合因子SUPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1（SOC1）和花分生組織決定基因APETALA1（AP1）啟動(dòng)子上（Yant et al.，2010）。染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（chromatin immunoprecipitation-sequencing，ChIP-Seq）分析發(fā)現(xiàn)AP2蛋白也

24、結(jié)合到TOE3啟動(dòng)子上（Yant et al.，2010），證明在AP2家族基因之間存在反饋調(diào)節(jié)環(huán)。另一個(gè)AP2家族蛋白SMZ直接結(jié)合到光周期途徑開花時(shí)間調(diào)控因子FLOWERING LOCUS T （FT）下游1.5 kb處，并抑制其轉(zhuǎn)錄。在莖尖分生組織中，除了SOC1和FT，SMZ也直接結(jié)合到AP1上（Mathieu et al.，2009）。由于在toe1 toe2雙突變體中FT的表達(dá)上調(diào)，所以FT被認(rèn)為是TOE1和TOE2蛋白的靶基因（Jung et al.，2007）。 除了TOE3，AP2家族基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著種子萌發(fā)不斷下降（Aukerman & Sakai，2003；Jung e

25、t al.，2007；Mathieu et al.，2009）。這種時(shí)空表達(dá)模式可能是由于miR172活性的增加。miR172隨著植物生長(zhǎng)其表達(dá)量不斷增加，主要受到SBP（SQUAMOSA promoter binding protein）盒轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而且miR172自身也受到miR156的調(diào)控（Wu et al.，2009）。通過抑制AP2家族基因的活性，SBP轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控MIR172b的轉(zhuǎn)錄促使植物開花。 Jung等（2007）研究表明日照長(zhǎng)度也可以影響擬南芥中miR172的表達(dá)水平。在長(zhǎng)日照（long day，LD）條件下，miR172的積累比短日照（short day，SD）

26、條件下多。相比光周期途徑constans（co）突變體中miR172水平在gigantea（gi）突變體中有所下降。雖然GI作用在CO上游，但是miR172積累量的減少不依賴于CO作用。這個(gè)事實(shí)表明CO可能通過獨(dú)立于miR172的作用途徑調(diào)控開花時(shí)間。 溫度是另一個(gè)影響開花時(shí)間的重要環(huán)境因素，同時(shí)也影響miR172的表達(dá)水平。Lee等（2010）檢測(cè)植物16 時(shí)miRNA水平，發(fā)現(xiàn)miR172是一個(gè)應(yīng)答環(huán)境溫度的miRNA。最近的報(bào)道顯示，擬南芥的RNA結(jié)合蛋白FCA對(duì)環(huán)境溫度產(chǎn)生應(yīng)答并促進(jìn)pre-miR172的加工過程從而大量合成miR172，合成的miR172進(jìn)而作用于開花調(diào)節(jié)因子FT誘導(dǎo)

27、開花（Jung et al.，2012b）。FCA-miR172 調(diào)節(jié)子為植物提供了一個(gè)在變動(dòng)的環(huán)境溫度條件下對(duì)開花時(shí)間進(jìn)行微調(diào)的自適應(yīng)策略。 6期 李 巍等：被子植物開花時(shí)間和花器官發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控研究進(jìn)展 1249 2.3 miR156對(duì)植物開花時(shí)間的調(diào)控 植物的生長(zhǎng)發(fā)育分為兩個(gè)階段：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期和生殖生長(zhǎng)時(shí)期。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期主要是葉片的產(chǎn)生，生殖生長(zhǎng)時(shí)期主要是開花和結(jié)果。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期又包括幼年期和成年期。miR156是植物生長(zhǎng)周期轉(zhuǎn)變的主要調(diào)控基因，控制營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期到生殖生長(zhǎng)期、幼年期到成年期的轉(zhuǎn)變。在擬南芥和玉米中，miR156被證明是最為保守的miRNA，主要調(diào)控植物幼年期的生長(zhǎng)。 在

28、擬南芥基因組中，有10個(gè)等位基因編碼miR156，包括最新發(fā)現(xiàn)的MIR156i和MIR156j（Breakfield et al.，2012）。miR156直接抑制轉(zhuǎn)錄因子SQUAMOSAPROMOTER BINDING PROTEIN LIKE（SPL）家族成員的表達(dá)。Klein等（1996）首次在金魚草中發(fā)現(xiàn)了這些植物中特有轉(zhuǎn)錄因子，隨后證實(shí)這類蛋白均含有一個(gè)對(duì)結(jié)合DNA所必需的高度保守結(jié)構(gòu)域（SBP-box）。幾乎所有的植物都含有SBP-box，其中有些含有miR156靶作用位點(diǎn)，這表明植物界中miR156和SBP-box靶基因?qū)I(yíng)養(yǎng)器的生長(zhǎng)周期轉(zhuǎn)變起著重要的調(diào)控作用。擬南芥中17個(gè)家族

29、成員SPL1到SPL16（包括兩個(gè)編碼相同蛋白的基因SPL13A和SPL13B），其中11個(gè)基因含有miR156的靶作用位點(diǎn)。SPL3過表達(dá)突變體的早花表型是第一個(gè)證據(jù)，證明了SPL基因參與開花時(shí)間調(diào)控（Cardon et al.，1999）。隨著植物的生長(zhǎng)，SPL3表達(dá)水平在不斷上升（Cardon et al.，1999）。此外，Schmid 等（2003）證明光誘導(dǎo)引起了SPL基因的上調(diào)。 miR156的表達(dá)量在胚胎和幼苗早期很高（Wu & Poethig，2006；Nodine & Bartel，2010），隨著植物的生長(zhǎng)而表達(dá)量逐漸下降（Schmid et al.，2003；Wu &

30、Poethig，2006；Wang et al.，2009；Wu et al.，2009）。到目前為止，在幾個(gè)具有開花表型的突變體和轉(zhuǎn)基因植株中均檢測(cè)到miR156的表達(dá)（Wang et al.，2009）。然而在這些突變體中miR156的表達(dá)量都沒有受到影響，而且赤霉素和生長(zhǎng)素也沒有影響miR156的表達(dá)（Wang et al.，2009）。這些研究結(jié)果表明，miR156的表達(dá)水平并不受影響植物開花時(shí)間的因子調(diào)控，miR156的表達(dá)水平主要依賴于植物的年齡。 長(zhǎng)日照條件下，miR156的過量表達(dá)會(huì)引起幼年期的延長(zhǎng)，延遲成年期的起始，同時(shí)下調(diào)SPL基因家族的表達(dá)（Klein et al.，19

31、96）。大多數(shù)miR156靶基因SPL的表達(dá)量隨著植物的生長(zhǎng)逐漸增加（Cardon et al.，1999；Schmid et al.，2003；Wu & Poethig，2006；Wang et al.，2009；Wu et al.，2009；Yamaguchi et al.，2009），當(dāng)靶基因的表達(dá)量積累到一定豐度就會(huì)啟動(dòng)下游基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)開花。這種表達(dá)模式反映了miR156對(duì)于植物的正常生長(zhǎng)尤其是對(duì)開花時(shí)間很重要。當(dāng)miR156的調(diào)控受到SPL基因上miR156靶位點(diǎn)突變的干擾，植物可以提早開花，同時(shí)SPL大量表達(dá)（Wu & Poethig，2006；Wang et al.，200

32、9）。SPL3的過表達(dá)可以促使植物提前開花，同時(shí)SPL3 mRNA在向開花轉(zhuǎn)變的過程中上升（Cardon et al.，2002）。SPL3有兩個(gè)同源基因SPL4和SPL5，SPL3過表達(dá)沒有導(dǎo)致花序分生組織基因LEAFY（LFY），APETALA1（AP1）和FRUITFULL（FUL）表達(dá)的上調(diào)，但是SPL4或者SPL5過表達(dá)導(dǎo)致了這3個(gè)基因表達(dá)量的增加。說(shuō)明雖然SPL3、SPL4、SPL5基因序列相似，均調(diào)控花分生組織形成基因，但是作用是不一致的（Yamaguchi et al.，2009）。SPL9 的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SPL3，SPL9促進(jìn)了成年期的形態(tài)特征形成。SPL10 也調(diào)控營(yíng)養(yǎng)生

33、長(zhǎng)階段的變化，但是其過表達(dá)的表現(xiàn)型與SPL9不同，因此可能與SPL9有不同的功能。 miR156/SPL模型以兩種不同方式調(diào)控開花時(shí)間：一是通過miR172調(diào)控消除AP2家族基因產(chǎn)生的開花抑制；二是通過直接促進(jìn)開花整合因子和分生組織形成調(diào)控因子。SPL9直接結(jié)合到MIR172b的調(diào)控區(qū)域并誘導(dǎo)MIR172b表達(dá)（Wu et al.，2009）。miR172抑制AP2家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，使植物應(yīng)答適當(dāng)?shù)拇碳亩T導(dǎo)開花。除了miR172，開花整合因子SOC1和它的同源基因AGAMOUS-LIKE 24（AGL24）也是SPL9的直接靶基因（Wang et al.，2009）。雖然FUL調(diào)節(jié)開花時(shí)

34、間的作用還不明確，但是FUL受到SPL9和SPL3的調(diào)控，也是SPL9和SPL3過表達(dá)突變體產(chǎn)生早1250 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 花表型的原因（Wang et al.，2009；Yamaguchi et al.，2009）。最近也發(fā)現(xiàn)FT啟動(dòng)子與SPL3之間的聯(lián)系，染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)證明了SPL3蛋白可以直接結(jié)合到FT啟動(dòng)子的GTAC基序上（Kim et al.，2012）。 因?yàn)閜ri-miR156a的表達(dá)量隨著植物的發(fā)育而逐漸下降（Wang et al.，2009），所以miR156積累水平的下降是由于其轉(zhuǎn)錄水平下降引起的。如果把已經(jīng)形成的葉片去掉，miR156的水平反而上升（Yang

35、et al.，2011）。證明葉原基是調(diào)控miR156積累量的信號(hào)之源。此外，環(huán)境溫度會(huì)影響miR156和miR172的積累量（Lee et al.，2010；Kim et al.，2012），證明環(huán)境因子通過影響這兩個(gè)miRNAs的積累量進(jìn)而調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)。 SPL積累的時(shí)空模式對(duì)于理解年齡途徑及植物生長(zhǎng)與環(huán)境因子之間的復(fù)雜關(guān)系很重要。通過提高光周期途徑因子CO或FT活性從而促進(jìn)SPL基因的表達(dá)，與miR156對(duì)SPL的調(diào)控途徑不同（Schmid et al.，2003；Wang et al.，2009）。這種作用模式可能直接受到花開整合因子SOC1和FT的調(diào)控（Jung et al.，201

36、2a）。在長(zhǎng)日照條件下，F(xiàn)T和轉(zhuǎn)錄因子FD一起直接或通過SOC1調(diào)控SPL基因的表達(dá)，促進(jìn)光周期途徑誘導(dǎo)植物開花。在短日照條件下，SOC1通過結(jié)合到SPL基因啟動(dòng)子上，促進(jìn)赤霉素途徑誘導(dǎo)植物開花（Jung et al.，2012a）。作為對(duì)環(huán)境溫度的應(yīng)答，miR156-SPL3相互作用模塊和FT基因共同調(diào)控溫敏植物的開花時(shí)間（Kim et al.，2012）。因此，miR156對(duì)于開花植物的階段轉(zhuǎn)變、開花時(shí)機(jī)、花的形成起著重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)也可以調(diào)控miR172等其他miRNA。 2.4 miRNA159對(duì)植物開花時(shí)間的調(diào)控 第3類小RNA miR159在赤霉素途徑中起著重要作用。擬南芥中，

37、由于在長(zhǎng)日照條件下的Gibberellic Acid（GA）缺失突變體ga1沒有表現(xiàn)出顯著的開花表型，所以GA對(duì)于開花時(shí)間的影響一直被人們忽略了。但是在短日照條件下，ga1缺失突變體卻需要GA來(lái)促進(jìn)開花（Wilson et al.，1992）。GA受體GIBBERELLIC INSENSITIVE DWARF1（GID1）的發(fā)現(xiàn)，引起了研究者對(duì)GA影響開花時(shí)間的重視。在長(zhǎng)日照條件下，3個(gè)GID1受體功能冗余拷貝的三突變體表現(xiàn)出晚花表型（Griffiths et al.，2006；Willige et al.，2007），證明GA是長(zhǎng)日照條件下調(diào)控開花時(shí)間的重要線索。 花序分生組織基因LFY參與

38、赤霉素途徑。GA信號(hào)受到LFY啟動(dòng)子上GAMYB結(jié)合因子的調(diào)控，在短日照條件下GA提高了LFY啟動(dòng)子活性（Blazquez et al.，1998；Blazquez & Weigel，2000）。在擬南芥GAMYBs家族中，MYB33結(jié)合到LFY啟動(dòng)子的GAMYB結(jié)合域上，MYB33的表達(dá)可以導(dǎo)致GA外源性或內(nèi)源性水平的增加，證明了GAMYBs對(duì)于GA調(diào)控的開花促進(jìn)起到重要的作用（Gocal et al.，2001）。 在擬南芥中，MIR159a、MIR159b和MIR159c構(gòu)成了miR159家族。這些miRNAs主要作用于GAMYB類轉(zhuǎn)錄因子，包括MYB33、MYB65和MYB101。在植

39、物分生組織中MYB33表達(dá)受到miR159強(qiáng)烈的抑制（Alonso-Peral et al.，2010）。短日照條件下，miR159過表達(dá)，植物開花延遲，而且MYB33和LFY水平降低（Achard et al.，2004）。這些觀察至少證明有一部分miR159通過赤霉素途徑調(diào)控開花時(shí)間。但是miR159表達(dá)量和GA之間的關(guān)系還不是很明確，需要進(jìn)一步研究miR159與GA之間的調(diào)控模式。 3 miRNAs調(diào)控花器官的形成 3.1 miRNA159調(diào)控花藥的生長(zhǎng) 被子植物中對(duì)于花藥的調(diào)控是保守的。在擬南芥、水稻和大麥（Hordeum vulgare）中，MIR1596期 李 巍等：被子植物開花時(shí)

40、間和花器官發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控研究進(jìn)展 1251 及其靶基因GAMYB-相關(guān)的基因?qū)τ诨ㄋ幍恼ＩL(zhǎng)是必須的（Achard et al.，2004）。GAMYB首次在大麥糊粉細(xì)胞中作為種子發(fā)育階段GA信號(hào)途徑的正調(diào)節(jié)因子被發(fā)現(xiàn)（Gubler et al.，1999）。隨后的研究揭示了GAMYB也作用在花發(fā)育階段（Murray et al.，2003）。在大麥中，HvGAMYB的過表達(dá)導(dǎo)致花藥長(zhǎng)度的減少，并引起雄性不育（Murray et al.，2003）。GAMYB基因也在其它物種中被發(fā)現(xiàn)，例如擬南芥、水稻、燕麥（Avena sativa）等（Woodger et al.，2003；Achar

41、d et al.，2004；Tsuji et al.，2006），其作用和表達(dá)是高度保守的，而且都有保守的miR159結(jié)合位點(diǎn)。 擬南芥MYB33和MYB65都屬于GAMYB家族。AtMYB33的表達(dá)限制在小的花藥中。擬南芥中myb33/myb65雙突變體導(dǎo)致絨氈層肥大和花粉不育。miR159過表達(dá)減少了AtMYB33的表達(dá)量，引起花藥敗育，雄性不育并延遲了開花時(shí)間（Achard et al.，2004；Schwab et al.，2005）。Alonso-Peral 等（2010）發(fā)現(xiàn)miR159作為一個(gè)分子開關(guān)可以限制MYB33和MYB65在花藥中表達(dá)。 在水稻中，OsGAMYB表達(dá)也具有

42、花藥特異性，并與miR159表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（Tsuji et al.，2006；Aya et al.，2009）。OsGAMYB的缺失突變體引起花藥和花粉的敗育（Kaneko et al.，2004）。OsGAMYB也可以直接調(diào)控小孢子的發(fā)育（Aya et al.，2009）。最近的研究發(fā)現(xiàn)了miR159與GAMYB在草莓（Fragaria ananassa）中的作用（Csukasi et al.，2012），兩類草莓的miR159家族成員Fa-miR159a和Fa-miR159b與Fa-GAMYB基因在果托的生長(zhǎng)中相互作用，共同應(yīng)答GA內(nèi)源水平的變化。 3.2 miRNA319對(duì)花瓣生長(zhǎng)的調(diào)控

43、 miR319基因家族是由3個(gè)成員（miR319a、miR319b和miR319c）組成。Li等（2011）發(fā)現(xiàn)，擬南芥miR159與miR319有17個(gè)相同的核苷酸，而且這兩個(gè)miRNA是由一個(gè)共同的祖先基因進(jìn)化而來(lái)。然而，miR159和miR319有不同的表達(dá)模式并且作用于不同的基因，所以有不同的作用。miR159作用于幾個(gè)調(diào)控開花和花藥生長(zhǎng)的GAMYB轉(zhuǎn)錄因子，但是miR319作用于調(diào)控葉片和花生長(zhǎng)的TCP轉(zhuǎn)錄因子（Palatnik et al.，2007；Nag et al.，2009）。在花序中過量表達(dá)和沉默miR319a基因，TCP （TEOSINTE BRANCHED/CYCLO

44、IDEA/PCF）類轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平相對(duì)于野生型花序中的mRNA水平表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)和上調(diào)表達(dá)，表明miR319a可能通過結(jié)合并調(diào)節(jié)TCP類轉(zhuǎn)錄因子而在花發(fā)育過程中起作用。其中miR319a功能缺失突變體的花瓣寬度變小，花瓣和雄蕊長(zhǎng)度減?。↘oyama et al.，2007；Nag et al.，2009；Sarvepalli & Nath，2011）。 3.3 miRNA167和miRNA160通過調(diào)控ARFs而控制花器官形成 生長(zhǎng)素應(yīng)答因子ARF（AUXIN RESPONSE FACTORS）通過結(jié)合到植物激素應(yīng)答元件的啟動(dòng)子上從而調(diào)控大量激素應(yīng)答基因（Mockaitis & Est

45、elle，2008）。一些ARF蛋白已經(jīng)被證明調(diào)控花器官的形成，受到miRNAs的調(diào)控（Mallory et al.，2005；Wu & Poethig，2006；Wu et al.，2006；Chapman & Estelle，2009）。在已知的ARF基因中，ARF6和ARF8是miR167的靶基因，ARF10、ARF16和ARF17是miR160的靶基因（Mallory et al.，2005；Wu et al.，2006）。 ARF6和ARF8對(duì)胚珠和花藥的生長(zhǎng)是必要的（Nagpal et al.，2005；Wu & Poethig，2006；Wu et al.，2006）。arf6

46、arf8雙缺失突變體導(dǎo)致了花藥和雌蕊的敗育，如雄蕊變短，花藥不開裂和胚珠珠被敗育。miR167的過表達(dá)導(dǎo)致ARF6和ARF8轉(zhuǎn)錄本水平下降，出現(xiàn)與arf6/arf8雙突變體相似的表型，花藥不開裂，不能釋放花粉。說(shuō)明生長(zhǎng)素應(yīng)答因子ARF6和ARF8基因是miR167的直接靶點(diǎn)，miR167下調(diào)ARF6/ARF8對(duì)花粉發(fā)育很重要。水稻中，在花藥生長(zhǎng)的晚期miR167含量達(dá)到很高水平，證明miR167調(diào)控花藥生長(zhǎng)是保守的（Fujioka et al.，2008）。miR167界定ARF6和ARF8在雄蕊和胚珠中的正確表達(dá)區(qū)域（Wu et al.，2006），確保萼片、花瓣、花藥、雌蕊和胚珠的正常發(fā)育

47、，包括其外在形狀、內(nèi)部細(xì)胞大小、花粉粒萌發(fā)率以及柱頭、胚軸的長(zhǎng)短等性狀（Ru et al.，2006）。 1252 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 試驗(yàn)證明miR160負(fù)調(diào)控ARF10、ARF16和ARF17（Mallory et al.，2005；Liu et al.，2010b）。一個(gè)Ds轉(zhuǎn)座子插入在miR160的3調(diào)控區(qū)域的心皮缺失突變體（floral organs in carpels，foc）導(dǎo)致形成不規(guī)則形狀的花，育性下降（Mallory et al.，2005；Liu et al.，2010b）。在foc突變體中，由于miR160表達(dá)水平下降，導(dǎo)致ARF1、ARF16和ARF17轉(zhuǎn)錄水平

48、比野生型高。 3.4 miRNA169控制植物生殖器官的發(fā)育 被子植物花器官發(fā)育的ABCE模型指出，C功能基因在第3、4輪中表達(dá)，分別決定雄蕊和心皮的特征屬性。C功能基因的表達(dá)活性受到miR169的抑制。Cartolano等（2007）的研究發(fā)現(xiàn)，金魚草的FISTULATA（FIS）基因和矮牽牛的BLIND（BL）基因編碼miR169。FIS和BL將C類基因的活性限制在內(nèi)兩輪花器官而調(diào)控雄蕊和心皮的發(fā)育。FIS和BL的缺失突變體導(dǎo)致在第2輪花器官中出現(xiàn)雄蕊化的花瓣。miR169調(diào)控NF-YA轉(zhuǎn)錄因子基因家族（Jones-Rhoades & Bartel，2004）。由于NF-YA轉(zhuǎn)錄因子可以促

49、進(jìn)C類基因的表達(dá)，miR169被認(rèn)為是通過對(duì)NF-YA轉(zhuǎn)錄后抑制從而抑制C類基因的活性。此外，Zhang 等（2011）發(fā)現(xiàn)miR169的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄植株Sly-miR169c的氣孔開張度減少，降低葉片水分流失，從而增強(qiáng)抗旱性。 miR169的靶基因是NF-YA類轉(zhuǎn)錄因子家族成員（此類轉(zhuǎn)錄因子與C功能基因PLE/pMADS3的CCAAT盒結(jié)合）（Cartolano et al.，2007）。在擬南芥中，盡管miR169也調(diào)控NFYA5基因，卻不能進(jìn)一步抑制C功能基因的活性。由此推測(cè)，miR169主要在金魚草和矮牽牛中通過抑制C功能基因活性維持花的正常發(fā)育。 4 結(jié)論與展望 植物發(fā)育表觀遺傳

50、機(jī)制是表觀遺傳學(xué)的一個(gè)重要分支，近些年來(lái)發(fā)展迅速，成為當(dāng)前植物學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，主要是指在DNA序列未發(fā)生改變的情況下，DNA甲基化、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)、非編碼RNA等因素的改變，使基因功能發(fā)生可遺傳的變化，并最終導(dǎo)致表型變異的遺傳現(xiàn)象。染色質(zhì)的修飾作用對(duì)于獲得穩(wěn)定的基因表達(dá)，進(jìn)而形成長(zhǎng)期的分子記憶很關(guān)鍵。春化途徑對(duì)植物開花時(shí)間的調(diào)節(jié)是通過改變開花抑制基因FLC的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)抑制其表達(dá)而促進(jìn)開花，近期研究發(fā)現(xiàn)lncRNA COOLAIR和COLDAIR在染色質(zhì)重塑方面的作用，為進(jìn)一步研究春化途徑提供新的思路。同時(shí)，miRNAs也參與了對(duì)植物開花時(shí)間以及花器官發(fā)育的調(diào)控。 花發(fā)育是被子植物生命周

51、期中一個(gè)重要的綜合發(fā)育過程，涉及不同發(fā)育方式的轉(zhuǎn)換，包括開花誘導(dǎo)、信號(hào)傳遞、屬性決定、器官發(fā)生，既受環(huán)境因子（如光周期、溫度等）的誘導(dǎo)，又受到自身內(nèi)部因素的調(diào)節(jié)，經(jīng)過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，啟動(dòng)成花決定過程中的控制基因。在復(fù)雜的基因互作網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下，營(yíng)養(yǎng)莖端分生組織（vegetative meristem，VM）轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄐ蚍稚M織（inflorescence meristem，IM），然后在IM的側(cè)翼形成花分生組織（floral meristem，F(xiàn)M），分化出花器官。從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中鑒定出了180多個(gè)參與調(diào)控開花的基因，并確定存在6條調(diào)控開花的信號(hào)途徑：即光周

52、期途徑（photoperiod pathway）、春化途徑（vernalization pathway）、自主途徑（autonomous pathway）、赤霉素途徑（gibberellin pathway）、溫敏途徑（thermosensory pathway）和年齡途徑（aging pathway）（Fornara et al.，2010）。表觀遺傳是開花信號(hào)通路中的重要機(jī)制，對(duì)開花及花器官發(fā)育產(chǎn)生關(guān)鍵調(diào)控作用。miRNAs的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制是植物分子發(fā)育生物研究的重要領(lǐng)域，例如miR172、miR156、miR159參與了開花誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，共同開啟花的發(fā)育過程（圖1）。 6期 李

53、巍等：被子植物開花時(shí)間和花器官發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控研究進(jìn)展 1253 圖1 擬南芥miRNAs調(diào)控成花轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制 帶箭頭的直線表示激活作用，帶垂直短線的直線表示抑制作用。 Fig. 1 The molecular mechanisms of miRNAs regulating floral transition in Arabidopsis Lines with arrowheads represent activation，and with perpendicular bars represent repression. 除了miR156、miR172和miR159，還有其他miRNAs在

54、調(diào)控植物開花時(shí)間上起到重要作用。水稻的miR393靶基因編碼生長(zhǎng)素受體OsTIR1和OsAFB2（Xia et al.，2012）。miR393含量增加不僅顯示出對(duì)生長(zhǎng)素的低敏感性，也可以促進(jìn)植物開花，證明生長(zhǎng)素信號(hào)在開花時(shí)間的作用。miR399和它的靶基因PHOSPHATE2（PHO2）參與調(diào)控植物開花時(shí)間（Kim et al.，2011）。在擬南芥中，在常溫23 和16 時(shí)，miR399過表達(dá)突變體和pho2突變體呈現(xiàn)早花表型，可能是由于TWIN SISTER OF FT（TSF）的大量表達(dá)。近年來(lái)，組蛋白甲基化對(duì)于植物開花時(shí)間的調(diào)控作用受到更多的關(guān)注，Sui等（2013）發(fā)現(xiàn)H3K36甲

55、基化修飾參與了對(duì)水稻開花時(shí)間的調(diào)控。Sun等（2013）通過轉(zhuǎn)基因手段研究發(fā)現(xiàn)蘋果Md-miRNA156h在生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變、開花時(shí)間、育性及種子萌發(fā)等方面的作用。 目前對(duì)植物miRNA等表觀遺傳學(xué)的研究主要局限于幾種模式植物，例如擬南芥、矮牽牛、玉米、金魚草等，應(yīng)該不斷拓寬植物花發(fā)育表觀遺傳學(xué)研究的領(lǐng)域，在園藝作物中進(jìn)行更為深入的研究，了解染色質(zhì)修飾特征和miRNA表達(dá)譜，鑒定與基因表達(dá)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控因子以及維持表觀遺傳狀態(tài)的調(diào)控通路，獲取DNA甲基化修飾、組蛋白修飾以及非編碼RNA等信息，幫助研究者更好地理解表觀遺傳學(xué)在園藝植物花發(fā)育中的作用機(jī)制，并了解這些調(diào)控基因表達(dá)的表觀遺傳機(jī)制如何對(duì)細(xì)胞分化發(fā)揮調(diào)控作用，以期為通過分子生物學(xué)手段調(diào)控園藝植物花期奠定理論基礎(chǔ)。 References Achard P，Herr A，Baulcombe D C，Harberd N P. 2004. Modulation of floral development by a gibberellin-regulat