溶菌酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫因子的影響海洋科學(xué)畢業(yè)論文

1、本 科 畢 業(yè) 設(shè) 計(jì) (論 文)溶菌酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫因子的影響the effect of lysozyme on non-specificimmune factors of litopenaeusvannamei學(xué) 院： 海洋學(xué)院 專業(yè)班級(jí)： 海洋科學(xué) 海科081 學(xué)生姓名： 學(xué) 號(hào)： 指導(dǎo)教師： 年 月畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）中文摘要溶菌酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫因子的影響摘 要：本試驗(yàn)以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象，研究溶菌酶對(duì)其非特異性免疫因子的作用。實(shí)驗(yàn)中所用的凡納濱對(duì)蝦系連云港本地養(yǎng)殖戶提供，幼蝦買回后，進(jìn)行為期一周的馴養(yǎng)，以求盡快適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。為了詳細(xì)的探討溶菌酶在蝦類非特異性免疫中

2、的作用，選取大小均勻、健康活潑對(duì)蝦，隨機(jī)分為3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組40尾，每組設(shè)3個(gè)平行，飼養(yǎng)于玻璃纖維水槽（48.527.535cm）內(nèi)，鹽度為16，ph為7.7-8.2，日投餌兩次（06:00和18:00 h），過量投餌，投餌2.5 h后從每個(gè)桶收集殘餌、糞便；每天換水約2/3，溶解氧維持在 6.0 mgl-1以上，ph為8.50.3，溫度為220.5，連續(xù)充氣。結(jié)果表明：由圖1可以看出o2-的產(chǎn)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，2添加量組的o2-的產(chǎn)量最高，其次是1和3添加量組，對(duì)照組最低。由圖2可以看出，po活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，第7d后，2添加量組的po活性最高，其次是1和3

3、添加量組，對(duì)照組最低。由圖3可以看出，sod活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，第7d后，sod活性依次為2添加組2添加組3添加組對(duì)照組。由圖4可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組血清蛋白含量均呈先上升，到達(dá)最大值后逐漸下降趨勢(shì)。關(guān)鍵詞：溶菌酶；凡納濱對(duì)蝦；非特異免疫因子；濃度梯度畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）外文摘要the effect of lysozyme on non-specificimmune factors of litopenaeusvannameiabstract: the effect of lysozyme on non-specific immune factors of litopena

4、eus vannamei was conducted. in the experiment, litopenaeus vannamei was provided by lianyungang local farmers, shrimp was domesticated for a week in order to adapt to the laboratory environment. for a detailed investigation of lysozyme on nonspecific immunity function of shrimp, uniform size, health

5、y and lively prawn were selected and randomly divided into 3 experimental groups and 1 control groups, each group of 40 tails, each with 3 parallel. they were housed in a glass fiber tank (48.527.535 cm), the salinity was 16, ph 7.7-8.2. they were fed two times (06:00 and 18:00 h), excessive feeding

6、. after feeding 2.5 h, the bait was collected from each barrel. the water was changed about 2/3 every day, dissolved oxygen was maintained at 6 mg l-1, ph 8.50.3, temperature 22 0.5 , continuous inflating. the results showed that the activity of sod with time prolong assumes the trend of escalation.

7、 figure 1shows the output of o2- with time prolonged upward trend, adding 2% to the o2- group the highest yield, followed by 1% and adding 3% groups, control group were the lowest. from the graph 2 can see, po activity with time prolonged upward trend, after adding 2%7d, group po activity was the hi

8、ghest, followed by 1% and adding 3% groups, control group were the lowest. from the graph 3 can see, sod activity over extended time of upward trend, the7d, sod activities were 2% 2% add 3% add add group group group control group. figure 4shows, with the extension of time, the experimental group and

9、 the control group the serum protein content showed the first rise, reaching maximum values after declining trend.keywords: lysozyme；shrimp；non-specific immune factors；concentration gradient目 錄1 引言12 材料和方法52.1 材料來源52.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和管理52.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)53 結(jié)果64 討論8結(jié)論 10致謝 11參考文獻(xiàn)12圖1 7圖2 71 引言南美白對(duì)蝦（penaeus vannamei boo

10、ne，1931）的學(xué)名為凡納濱對(duì)蝦，屬于節(jié)肢動(dòng)物門（arthropoda）、甲殼綱（crustacea）、十足目（decapoda）、游泳亞目（natantia）、對(duì)蝦科（penaeidae）、對(duì)蝦屬（penaeus）、lito-penaeus亞屬，為廣溫廣鹽性熱帶蝦類。俗稱：白肢蝦（whiteleg shrimp）、白對(duì)蝦（white shrimp），以前的翻譯是萬氏對(duì)蝦，與中國(guó)對(duì)蝦、墨吉對(duì)蝦外形酷似，平均的壽命一般至少能超過32個(gè)月。成體的長(zhǎng)度最長(zhǎng)可達(dá)24厘米，甲殼比較薄，淺青灰色為正常體色，全身不具有斑紋。它的步足常呈白堊狀，所以有白肢蝦之稱。當(dāng)今世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦類之一是南美白對(duì)

11、蝦。南美白對(duì)蝦最初產(chǎn)于南美洲太平洋沿岸海域，中國(guó)科學(xué)院海洋研究所的張偉權(quán)教授率先從美國(guó)引進(jìn)此蝦，并于一九九二年突破了育苗關(guān)，從小試到中試直至在全國(guó)各地推廣養(yǎng)殖。目前我廣西、廣東、海南、福建、浙江、河北、山東等省或自治區(qū)已逐步推廣養(yǎng)殖，天津市漢沽區(qū)楊家泊鎮(zhèn)養(yǎng)殖的南美白對(duì)蝦世界聞名，有“中國(guó)魚蝦之鄉(xiāng)”的美稱，其中屬南美白對(duì)蝦的技術(shù)最為嫻熟。南美白對(duì)蝦的特點(diǎn)之一是肉質(zhì)鮮美，加工出肉率可高達(dá)67%，適溫的范圍廣，可在1832生長(zhǎng)，適鹽的范圍也廣，可在鹽度140條件下生長(zhǎng)，是一種優(yōu)良的淡化養(yǎng)殖品種。南美白對(duì)蝦抗病能力強(qiáng)，生長(zhǎng)快，現(xiàn)在已經(jīng)逐漸成為我國(guó)南方的主要養(yǎng)殖蝦種。我國(guó)南寧、北海、廣州和廈門等地均有蝦

12、苗、蝦無節(jié)幼體或親蝦供貨。11.1 外形特征及生活習(xí)性額角尖端的長(zhǎng)度不超出第1觸角柄的第2節(jié)，其齒式為7-9/1-2；頭胸甲較短，與腹部的比例約為1：3；額角側(cè)溝短，到胃上刺下方即消失；頭胸甲具肝刺及鰓角刺；肝刺明顯；第1觸角有雙鞭，內(nèi)鞭比外鞭纖細(xì)，長(zhǎng)度大致相等，但都短?。s為第1觸角柄長(zhǎng)度的1/3）；第l-3對(duì)步足的上肢十分發(fā)達(dá)，第4-5對(duì)步足無上肢，第5對(duì)步足具雛形外肢；腹部第4-6節(jié)具背脊；尾節(jié)具中央溝，但不具緣側(cè)刺。南美白對(duì)蝦最初產(chǎn)于美洲太平洋沿岸水域，主要分布于秘魯北部至墨西哥灣沿岸，分布最為集中的是厄瓜多爾沿岸。南美白對(duì)蝦具有生長(zhǎng)快、個(gè)體大、抗病力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)需求低等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)飼料蛋白含

13、量要求低，對(duì)水環(huán)境因子變化的適應(yīng)能力較強(qiáng)，出肉率高達(dá)65%以上、離水存活時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是高產(chǎn)養(yǎng)殖集約化的優(yōu)良品種，目前也是世界上三大養(yǎng)殖對(duì)蝦中單產(chǎn)量最高的蝦種。南美白對(duì)蝦體肥殼薄，肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，含肉率高。21.2 凡納濱對(duì)蝦的生物學(xué)特性1.2.1 生態(tài)習(xí)性（1）種群分布：最初的凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)于中南美洲，北到墨西哥，南至智利的太平洋沿岸海域，就是介于北緯32度南緯23度之間，泥質(zhì)的海底。河口附近常聚有很多仔蝦，變成幼蝦后逐步移棲于近岸淺海區(qū)，長(zhǎng)到8-9厘米，便轉(zhuǎn)移深海，棲息與常年水溫在20以上的海域。（2）水溫：為熱帶型種類，人工養(yǎng)殖時(shí)可在16-35（漸變幅度）水溫，但最適的水溫為28-32

14、，當(dāng)水溫長(zhǎng)時(shí)間處于18以下或34以上時(shí)，則蝦體處于緊迫狀態(tài)，免疫力下降，食欲減退甚至停止攝食。（3）鹽度：凡納濱對(duì)蝦對(duì)海水鹽度的適應(yīng)范圍很廣，可容忍的鹽度范圍為0.5-40，但最適鹽度為10-25，在逐漸淡化的情況下可在淡水中生存。在適宜范圍內(nèi)，鹽度越低，則對(duì)蝦生長(zhǎng)越快，但鹽度越高則其肌肉組織內(nèi)的自由氨基酸（free amino acid）含量越高，而自由氨基酸正是造成對(duì)蝦口感鮮美的主因。所以收蝦前的1-2周內(nèi)，漸漸調(diào)高鹽度，有利于提高對(duì)蝦的品質(zhì)。（4）酸堿度（ph）：凡納濱對(duì)蝦對(duì)ph值的適應(yīng)范圍為7.3-9.0，最適ph為7.8-8.6，當(dāng)ph低于7.3時(shí)，其活動(dòng)就受到限制。ph日波動(dòng)不得大

15、于0.5。（5）溶解氧：維系水生生物的最重要因子是水體中的溶解氧，此種對(duì)蝦抗低氧的能力很強(qiáng)，它的最低溶解氧值忍耐度為1.2mg/l。一般在養(yǎng)殖過程中要求d0值大于4mg/l。不同體長(zhǎng)的個(gè)體對(duì)低氧的耐受程度稍有差異，個(gè)體愈小，耐低氧能力愈好。當(dāng)對(duì)蝦蛻殼時(shí)，對(duì)溶解氧的要求非常高，否則便不能順利蛻皮，直至死亡。1.2.2 食性在營(yíng)養(yǎng)需求的方面，對(duì)飼料中蛋白質(zhì)的需求量凡納濱對(duì)蝦在28-32%左右，相對(duì)于斑節(jié)對(duì)蝦的蛋白質(zhì)需求量為35-39%，而日本囊對(duì)蝦的為43-52%，低很多。凡納濱對(duì)蝦在國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖中，因要求單產(chǎn)高，放苗密度較大，對(duì)蝦需要的營(yíng)養(yǎng)基本依賴配合餌料，因此配方中蛋白質(zhì)含量一般都高于28-32%

16、，多數(shù)在40%左右。在環(huán)境為自然狀態(tài)下，凡納濱對(duì)蝦是夜行性動(dòng)物，白天相對(duì)安靜，而夜間則活動(dòng)頻繁，在人工養(yǎng)殖狀況下，白天凡納濱對(duì)蝦仍會(huì)攝食投喂的飼料。研究還表明，投喂方式為一日多餐在生長(zhǎng)速度方面遠(yuǎn)比一日一到兩餐的投喂方式要快得多。夜間投喂量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于白天的投喂量。棲息方式和底質(zhì)的對(duì)蝦，多種肉食性動(dòng)物的食餌是對(duì)蝦。對(duì)蝦在活動(dòng)中遇到敵害時(shí)會(huì)用連續(xù)的彈跳，避開敵害；休息的時(shí)候，在白天它多會(huì)潛入泥沙中，只有觸須和眼留于泥沙外，敵害會(huì)不易發(fā)現(xiàn)它們。潛居的另外一個(gè)生物學(xué)意義是減少能量的消耗和休息。除自身的生理因素外，對(duì)蝦的潛居還受環(huán)境條件的制約，水溫過高、池底污染、溶氧過低對(duì)蝦多不潛居。強(qiáng)光、水溫低和白天易

17、潛居，但潛居不似日本對(duì)蝦非要晝伏夜出，在養(yǎng)成期白天也多出穴覓食物。31.2.3 對(duì)蝦的非特異免疫甲殼動(dòng)物缺乏免疫球蛋白，其體液免疫是依靠血淋巴中的一些非特異性的酶或因子來進(jìn)行的(2001，徐海圣等)。這些體液免疫因子包括誘導(dǎo)和天生的產(chǎn)生的各種生物大分子，主要是血淋巴中的各類抗病毒因子、血凝因子、抗菌因子、識(shí)別因子、凝集素、細(xì)胞激活因子、溶血素及溶菌酶、酚氧化酶等具有免疫活性的酶類。免疫因子的作用在于識(shí)別異物然后通過包囊、沉淀、凝集、溶解等抑制病原體的擴(kuò)散和繁殖；或者干脆將其殺滅并排出體外；發(fā)揮調(diào)理作用，促進(jìn)血細(xì)胞吞噬異物；還可能參與凝固、物質(zhì)吸收、止血與運(yùn)輸及創(chuàng)傷修復(fù)等生理功能。對(duì)蝦的免疫酶主

18、要存在于血淋巴和血細(xì)胞中，目前研究較多的有酸性磷酸酶(acp)、超氧化物歧化酶(sod)、溶菌酶(lsz)、過氧化氫酶(cat)、酚氧化酶及堿性磷酸酶(akp)等(1999，；劉樹青等1998，劉恒等)。普遍認(rèn)為，蝦類體液中含有的溶菌酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、凝集素、過氧化氫酶、堿性磷酸酶以及血細(xì)胞釋放的propo激活系統(tǒng)等體液免疫因子，消滅異物能以不同的途徑，而且能抵御病原體的侵襲。 1.3 溶菌酶簡(jiǎn)介 溶菌酶是一種堿性球蛋白，分子中芳香族氨基酸、酰胺殘基和堿性氨基酸的比例較高，酶的活動(dòng)中心是谷氨酸與天冬氨酸。 溶菌酶是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，稱為包胞壁質(zhì)酶或n-乙酰胞壁質(zhì)

19、聚糖水解酶，它專門地作用于肽多糖分子中n-乙酰胞壁酸與n-乙酰氨基葡萄糖之間的-14鍵，以致破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，使其松馳而失去對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，最終使細(xì)菌溶解死亡。也可以直接破壞革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁，從而達(dá)到殺菌的作用，這主要是由于革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要是由磷酸質(zhì)和胞壁質(zhì)構(gòu)成，其中胞壁質(zhì)是由多肽和雜多糖組成的糖蛋白，這種多糖正是由n-乙酰氨基葡萄糖與n-乙酰胞壁酸之間的-1，4鍵聯(lián)結(jié)的。對(duì)某些革蘭氏陰性菌，如傷寒沙門氏菌，埃希氏大腸桿菌，也會(huì)受到溶菌酶的破壞。溶菌酶是母乳中能保護(hù)嬰兒免遭病毒感染的一種有效成分，它能通過消化道而保持其活性狀態(tài)，溶菌酶還可以使嬰兒腸道中大腸桿菌減少，促進(jìn)雙歧桿菌

20、的增加，還可以有利于蛋白質(zhì)的消化吸收（王境巖，2002）。41.3.1 溶菌酶的應(yīng)用簡(jiǎn)介溶菌酶是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，又稱細(xì)胞壁溶解酶。于本世紀(jì)初人們開始對(duì)溶菌酶研究，英國(guó)細(xì)菌學(xué)家弗萊明在發(fā)現(xiàn)青霉素的前6年(1922年)發(fā)現(xiàn)人的眼淚、唾液中含有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶，因?yàn)樗哂腥芫饔?，所以命名為溶菌酶。此后人們?cè)谌撕蛣?dòng)物的分泌液、多種組織及某些微生物、植物中也發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的存在。隨著不斷深入的研究，發(fā)現(xiàn)溶菌酶不僅有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的種類，并有作用于真菌細(xì)胞壁的種類，同時(shí)對(duì)其作用機(jī)制也有了更深層次的了解。近幾年，人們根據(jù)溶菌酶的溶菌特性，將其應(yīng)用于醫(yī)療、食品防腐及生物工程中，特別是在食

21、品防腐方面，以代替化學(xué)合成的食品防腐劑，具有一定的潛在應(yīng)用價(jià)值（榮曉花等，1999）。51.3.2 水產(chǎn)動(dòng)物溶菌酶的分型 水產(chǎn)動(dòng)物溶菌酶按照其來源可分為三類：i型溶菌酶、g型溶菌酶和c型溶菌酶。大部分溶菌酶屬于c型溶菌酶(如羅氏沼蝦、日本囊對(duì)蝦斑節(jié)對(duì)蝦 、凡納濱對(duì)蝦和 日本沼蝦的溶菌酶)，c型溶菌酶約由一百三十個(gè)氨基酸殘基組成；目前發(fā)現(xiàn)的g型溶菌酶(如鯉魚的溶菌酶)由一百八十五和一百九十五個(gè)氨基酸殘基組成；i型溶菌酶(如海灣扇貝和東方牡蠣的溶菌酶)在進(jìn)化上是一個(gè)獨(dú)立的分支，存在于海洋無脊椎動(dòng)物尤其是雙殼類中（吳曉英等，2002）。61.3.3 水產(chǎn)動(dòng)物溶菌酶的特性 即使在 ph值為中性的水溶液

22、中，該酶也可維持?jǐn)?shù)天而不損失活性。研究發(fā)現(xiàn)，溶菌酶有兩種晶體形式存在，四邊形晶體在溫度高于25時(shí)變得不穩(wěn)定，在3740時(shí)轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的斜方體狀晶體；對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物溶菌酶的活性來說，最理想的條件是 ph 6.07.0，溫度 25，堿和氧化劑對(duì)它起阻遏作用，食鹽起活化作用；它的熱穩(wěn)定性強(qiáng)，粉狀溶菌酶若采用低溫干燥貯存，則幾乎永不變質(zhì)。1.3.4 溶菌酶在飼料中的應(yīng)用 因?yàn)轱暳仙a(chǎn)中長(zhǎng)期使用抗生素而導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物免疫力下降，并在水產(chǎn)品體內(nèi)殘留而危及人類健康，所以飼料行業(yè)急需無害、無毒的添加劑，飼用酶制劑由此應(yīng)運(yùn)而生。這種酶制劑一般情況是直接用作飼料添加劑的水解酶，可使腸道微生物群落改變，促進(jìn)飼料的吸收、消

23、化，提高飼料的利用率，但是這類酶易失活，熱穩(wěn)定性差，因而效果不明顯。但溶菌酶具有可補(bǔ)其不足的以下優(yōu)點(diǎn)： （1）與各種誘發(fā)炎癥的酸性物質(zhì)結(jié)合，致其失活，能增強(qiáng)抗生素和其它藥物的療效，改善組織基質(zhì)的粘多糖代謝，從而達(dá)到消炎、修復(fù)組織的目的； （2）與甘氨酸和聚合磷酸鹽等配合使用，具有良好的防腐作用。在飼料中添加溶菌酶可防止發(fā)生霉變，減少不必要的損耗； （3）熱穩(wěn)定性強(qiáng)，耐酸性，能經(jīng)受飼料制粒的高溫；（4）能改變腸道微生物群，增加腸道有益菌使腸道內(nèi)的胺 、甲酚等有害物減少，增強(qiáng)機(jī)體抗病力，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能； （5）可促進(jìn)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，提高飼料的消化率，最大限度地提高飼料原料的利用率

24、。（6）廣譜抗菌，能破壞革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁，對(duì)革蘭氏陰性菌等也有一定的溶解作用，而水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁亦無肽聚糖，故溶菌酶對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞無毒性作用； （7）與葡萄糖氧化酶有增效作用，且抗酸作用還可通過花生四烯酸的加入得到進(jìn)一步增強(qiáng)； （8）作為機(jī)體非特異免疫因子之一，參與機(jī)體多種免疫反應(yīng)，在機(jī)體正常防御功能和非特異免疫中，具有保持機(jī)體生理平衡的作用。1.3.5 溶菌酶與青霉素作用機(jī)理的比較溶菌酶（lysozyme）又稱胞壁質(zhì)酶（muramidase）或n-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（n-acetylmuramide glycanohydrlase），是一種堿性酶，能水解致病菌中黏多糖。主要通過破壞

25、細(xì)胞壁中的n-乙酰氨基葡糖和n-乙酰胞壁酸之間的-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，造成細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。溶菌酶也可直接結(jié)合帶負(fù)電荷的病毒蛋白，與脫輔基蛋白、rna、dna形成復(fù)鹽，導(dǎo)致病毒失活。所以，該酶具有抗病毒、消炎、抗菌等作用。該酶廣泛存在于人體多種組織中，鳥類和家禽的蛋清、哺乳動(dòng)物的乳汁、淚、血漿、尿、唾液等體液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最為豐富。從雞蛋清中提取分離的溶菌酶是由十八種一百二十九個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的單一肽鏈。它富含堿性氨基酸，有四對(duì)二硫鍵維持酶構(gòu)型，是一種堿性蛋白質(zhì)，其c端為亮氨酸，n端為賴氨酸。可分解黃色八疊球菌、巨大芽孢桿菌

26、、溶壁微球菌等革蘭陽性菌。青霉素抑制繁殖期細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而發(fā)揮殺菌作用，起效快速。對(duì)革蘭氏陽性菌，如肺炎球菌、鏈球菌，敏感的葡萄球菌及革蘭氏陰性球菌，如淋球菌、腦膜炎球菌有較強(qiáng)的抗菌功能。對(duì)梭狀芽胞桿菌、螺旋體、白喉?xiàng)U菌、放線菌以及部分?jǐn)M桿菌亦有抗菌功能。青霉素鉀、鈉鹽口服不吸收，且易被胃酸破壞，所以不宜口服。tl20.5小時(shí)，經(jīng)腎臟排泄。適用于敏感菌所致的急性感染，如：猩紅熱、敗血癥、中耳炎、丹毒、肺炎、膿胸、扁桃體炎、菌血癥、蜂窩織炎、癤、癰、急性乳腺炎、流行性腦膜炎、骨髓炎、回歸熱、鉤端螺旋體病、創(chuàng)傷感染、奮森氏咽峽炎、心內(nèi)膜炎、氣性壞疽、炭疽、淋病、放線菌病等。治療破傷風(fēng)、白喉宜與相

27、應(yīng)的抗毒素聯(lián)用。（鄭清梅等，2004）71.4 飼料添加劑簡(jiǎn)介飼料添加劑是指為了某種特殊需要而添加于飼料內(nèi)的某種或某些微量物質(zhì)。其主要作用是補(bǔ)充配合飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的不足，提高飼料利用率，改善飼料口味，提高適口性，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物正常發(fā)育和加速生長(zhǎng)，改進(jìn)產(chǎn)品品質(zhì)，防治魚、蝦疾病，改善飼料的加工性能，減少飼料貯藏和加工運(yùn)輸過程中營(yíng)養(yǎng)成分的損失。飼料添加劑必須滿足以下條件：（1）不影響水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)飼料的適口性和對(duì)飼料的消化吸收； （2）必須具有確實(shí)的作用，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益和生產(chǎn)效果；（3）維生素、激素、酶等生物活性物質(zhì)不得失效或超過有效期限。（4）長(zhǎng)期使用或在使用期間對(duì)動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生任何毒害作用和不良影響

28、；（5）在動(dòng)物體內(nèi)的殘留量不得超過規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，不得影響動(dòng)物產(chǎn)品的質(zhì)量和危害人體健康；（6）選用的化工原料，其中所含的有毒金屬含量不得超過充許的安全濃度；其他原料不得發(fā)霉變質(zhì)，不得含有毒物質(zhì)；（7）在飼料和動(dòng)物體內(nèi)具有較好看穩(wěn)定性。飼料添加劑的選用要經(jīng)濟(jì)、使用方便、安全，還要注意添加劑的效價(jià)、有效期，以及用法、禁用、配伍禁忌、用量、限用等有關(guān)事項(xiàng)的規(guī)定。1.4.1 溶菌酶作為飼料添加劑的可行性所選用的溶菌酶，系微生物發(fā)酵制得的微生物源溶菌酶，具有修復(fù)機(jī)體損傷組織，抗病毒，增強(qiáng)免疫力，廣譜抗菌消炎，促進(jìn)有益菌增殖等作用；具有生物相容性好，對(duì)組織無毒性，無刺激的特點(diǎn)；穩(wěn)定的抗菌活性，特別是對(duì)一些耐藥性

29、菌株有良好的抑菌作用。溶菌酶作為飼料添加劑的優(yōu)點(diǎn)：（1）抗菌譜廣，防治效果顯著，療效明顯，對(duì)抗生素的耐藥菌株照樣滅殺，細(xì)菌性疾病防治率達(dá)8595%，復(fù)發(fā)率低于5%。與蛋清溶菌酶相比，微生物源溶菌酶的抑菌范圍更廣，效果更好；（2）能夠使動(dòng)物的腸道微生態(tài)環(huán)境維持在最佳狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體消化吸收能力，顯著提高采食量，生長(zhǎng)速度和飼料利用率；（3）具有靶向功能，能富集到目標(biāo)器官，滲透生殖系統(tǒng)的屏障，增強(qiáng)對(duì)頑固疾病的防治效果； （4）加快消化道內(nèi)膜的傷口修復(fù)，增強(qiáng)對(duì)消化道內(nèi)膜的保護(hù)（能消除對(duì)zno的副作用；對(duì)抗球蟲藥有增效作用），有利于產(chǎn)道和外傷的恢復(fù)；（5）不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，長(zhǎng)期使用不用考慮輪換用藥，如果與抗

30、生素配伍使用能使其增效2-8倍； （6）環(huán)保安全，綠色，高效。2 材料和方法2.1 材料來源實(shí)驗(yàn)在淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。所用凡納濱對(duì)蝦購于連云港市贛榆一對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)為9-12cm，體色正常，健康活潑。凡納濱對(duì)蝦幼蝦養(yǎng)在培育池。親蝦培育池，圓形或橢圓形，每池20-40m2，池深1m，水深0.6-0.8m，光照強(qiáng)度100-500lux。暫養(yǎng)馴化10d，海水鹽度為30，溶解氧維持在 6.0 mgl-1以上，ph為8.50.3，溫度為220.5，連續(xù)充氣，每天換水1/3-1/2，并投喂對(duì)蝦配合飼料。2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和管理選取大小均勻、健康活潑對(duì)蝦隨機(jī)分為3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)

31、照組，每組40尾，每組設(shè)3個(gè)平行，飼養(yǎng)于100l pvc桶中。實(shí)驗(yàn)前停食24h，實(shí)驗(yàn)期間，分別投喂四種實(shí)驗(yàn)飼料（表1），日投餌兩次（06:00和18:00h），過量投餌；投餌2.5h后從每個(gè)pvc桶收集殘餌、糞便；每天換水約2/3，溶解氧維持在 6.0 mgl-1以上，ph為8.50.3，溫度為220.5，連續(xù)充氣。2.2.1 對(duì)蝦血清的獲取在試驗(yàn)開始的第1、3、7、12、18、25d每pvc桶取3-5尾對(duì)蝦，取血時(shí)用1ml無菌注射器，按照血淋巴與抗凝劑（0.01m tris-hcl，0.25m 蔗糖，0.1m檸檬酸三鈉；ph 7.6；780moskg-1）1:2的比例，自對(duì)蝦頭胸甲后插入心臟

32、抽取血液，合并置于無菌eppendorf管。所取抗凝血，一部分用于超氧陰離子的測(cè)定；另一部分離心10min（700g. 4）（mikr022r，德國(guó)heyyich公司），所得的上清液一部分用于血清酚氧化酶（po）活力的測(cè)定，另一部分于-20冰箱中保存，用于其它指標(biāo)測(cè)定。2.2.2 非特異性免疫因子的測(cè)定（1）超氧陰離子（superoxida anion, o2-）參考（lee，2003）的方法，并作相應(yīng)修改。在96孔酶標(biāo)板中先加入50l 0.2%多聚賴氨酸（poly-l-lysine，sigma），然后加入100l抗凝血，離心10min（300g. 4），去除上清，加入100ul 1g/l p

33、ma（phorbol myistate acetate, sigma），溫育30min（37），然后加入100l 0.3%nbt（nitroblue tetrazolium, sigma），溫育30min（37），經(jīng)離心10min（560g. 4），去除上清，加入200l 100%甲醇終止反應(yīng)（10min），10min（700g. 4），去除上清，然后用70甲醇洗滌3次，經(jīng)離心去除上清后，于室溫下晾干。待干燥后，加入120l 2mol/lkoh和140l dmso（二甲基亞砜），充分溶解，在酶標(biāo)儀（bio-teksynerge，美國(guó)bio公司）中測(cè)定溶液在波長(zhǎng)630nm的吸光值（od630）。

34、（2）血清酚氧化酶（phenoloxidase, po）活力的測(cè)定以l-dopa為底物，采用改進(jìn)的ashida等方法25-26在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行。把10l血清加入96孔酶標(biāo)板中，然后向各孔中加入200l 0.1 mol/l ph 6.0磷酸鹽緩沖液，最后向各孔中加入10l的l-dopa（sigma公司）（0.01mol/l）在酶標(biāo)儀（bio-teksynerge，美國(guó)bio公司）中振蕩4次，每隔4min讀取490nm處的吸光值，酶活力以試驗(yàn)條件下，od490每分鐘增加0.001為一個(gè)酶活力單位。（3）超氧化物歧化酶（sod）的測(cè)定應(yīng)用酸性磷酸酶檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)），反應(yīng)于

35、96孔酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀測(cè)量各反應(yīng)體在550nm波長(zhǎng)下od值。2.3 攻毒試驗(yàn)為測(cè)定溶菌酶的保護(hù)效果，在試驗(yàn)即將結(jié)束時(shí)每組取20尾蝦，用副溶血弧菌對(duì)試驗(yàn)用蝦進(jìn)行攻毒，經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)確定副溶血弧菌的攻毒濃度為108cells/ml，注射劑量50ul/尾，預(yù)試驗(yàn)證明，攻毒后7d左右對(duì)蝦的死亡趨于穩(wěn)定，故本試驗(yàn)記錄攻毒后7d內(nèi)各組的累計(jì)死亡率，并計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率(relative percent survival, rps):rps=（1免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率）100%2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.4.1 溶菌酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫因子的影響由圖1可以看出o2-的產(chǎn)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，2添加量組

36、的o2-的產(chǎn)量最高，其次是1和3添加量組，對(duì)照組最低。由圖2可以看出，po活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，第7d后，2添加量組的po活性最高，其次是1和3添加量組，對(duì)照組最低。由圖3可以看出，sod活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，第7d后，sod活性依次為2添加組2添加組3添加組對(duì)照組。由圖4可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組血清蛋白含量均呈先上升，到達(dá)最大值后逐漸下降趨勢(shì)。圖1 溶菌酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦超氧陰離子（o2-）產(chǎn)量的影響fig. 1 effects of dietary lysozyme on the o2- of litopenaeus vannamei圖2 溶菌酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦酚氧化酶

37、（po）活性的影響fig. 2 effects of dietary lysozyme on the po of litopenaeus vannamei圖3 溶菌酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦sod活性的影響fig. 3 effects of dietary lysozyme on the sod of litopenaeus vannamei圖4 溶菌酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清蛋白含量的影響fig. 4 effects of dietary lysozyme on the protein concentration in the serum of litopenaeus vannamei 2.4.2 攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

38、攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射副溶血弧菌后8d, 對(duì)照組全部死亡，而試驗(yàn)組死亡率較低。溶菌酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌攻毒的免疫保護(hù)率分別達(dá)到了50、70、45。 圖5 副溶血弧菌攻毒后試驗(yàn)凡納濱對(duì)蝦的累計(jì)死亡率fig. 5 accumulative mortalities(%) of litopenaeus vannamei after challenge with vibrio parahaemolyticus3 結(jié)果本文研究不同溶菌酶濃度水平對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異免疫因子的影響，包括存活率、死亡率，生長(zhǎng)率等幾方面因素。需要說明的是：每組實(shí)驗(yàn)的最終數(shù)值均有波動(dòng)，導(dǎo)致規(guī)律不是很明顯，但此實(shí)驗(yàn)之所以做了三個(gè)

39、實(shí)驗(yàn)組和一組對(duì)照組，目的就是為了減少數(shù)值波動(dòng)情況帶來的影響。通過這幾組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)總結(jié)，以得出溶菌酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異免疫因子影響的范圍和程度。下面就對(duì)這幾方面因素分別進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)過程中，根據(jù)圖表得出的結(jié)論可以明顯看出在蝦的飼喂過程中，由于添加溶菌酶的影響，所以，在3個(gè)實(shí)驗(yàn)組里，相對(duì)1個(gè)對(duì)照組來說，蝦的存活率有極大的提高。4 討論隨著漁業(yè)生產(chǎn)的日益發(fā)展，我國(guó)漁業(yè)結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)向以水產(chǎn)養(yǎng)殖為主，水產(chǎn)養(yǎng)殖將從數(shù)量型轉(zhuǎn)為質(zhì)量型，然而制約養(yǎng)殖生產(chǎn)的問題也日益突出，如水環(huán)境污染、高密度養(yǎng)殖不可避免地將影響?zhàn)B殖對(duì)象的健康，使感染疾病的機(jī)率大大提高，導(dǎo)致養(yǎng)殖病害頻繁發(fā)生，造成大量死亡。目前，防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病主要

40、依靠藥物。但經(jīng)常用藥物防治疾病，病原體很可能對(duì)某些藥物產(chǎn)生抗藥性，致使防治失敗，且藥物在水中積累過多，極易污染水體，造成水體生態(tài)平衡的破壞。所以，通過提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力來抵抗疾病成為研究的熱點(diǎn)。在20世紀(jì)80年代，對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展曾給我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)寫下輝煌的一筆，極大地帶動(dòng)了沿海地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，并帶動(dòng)了沿海地區(qū)育苗、餌料生產(chǎn)、冷藏加工等相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈的同步發(fā)展，它所起到的作用是不可磨滅的?？墒牵M(jìn)入90年代，特別從92年起，由于對(duì)蝦病毒病在全國(guó)各地的蔓延，水產(chǎn)工作者一時(shí)又找不出合適的對(duì)策，導(dǎo)致對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)大傷元?dú)?，?jīng)濟(jì)效益一落千丈。因此，水產(chǎn)工作者們一方面刻苦鉆研對(duì)蝦病毒病，另一方面探索對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)

41、新的替代品種、新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)，于是南美白對(duì)蝦的養(yǎng)殖浮出水面。1988年7月，南美白對(duì)蝦由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所從美國(guó)夏威夷引進(jìn)我國(guó)，1992年8月人工繁殖獲得了初步的成功，1994年通過人工育苗獲得了小批量的蝦苗，1999年深圳天俊實(shí)業(yè)股份有限公司與美國(guó)三高海洋生物技術(shù)公司合作，引進(jìn)美spf南美白對(duì)蝦種蝦和繁育技術(shù)，成功地培育出了spf南美白對(duì)蝦苗。2000年的早期苗的價(jià)格達(dá)到了400600元/萬尾，2001年后逐步降低并基本維持在100元左右/萬尾。成品蝦價(jià)格也由引進(jìn)初期的每斤近百元降至目前的10元左右。南美白對(duì)蝦人工養(yǎng)殖生長(zhǎng)速度快，60天即可達(dá)上市規(guī)格；適鹽范圍廣（040），可以采取純淡水、半咸水、海水多種養(yǎng)殖模式，從自然海區(qū)到淡水池塘均可生長(zhǎng)，從而打破了地域限制，且具耐高溫，抗病力強(qiáng)；食性雜，對(duì)飼料蛋白要求低，35%即可達(dá)生長(zhǎng)所需。是“海蝦淡養(yǎng)”的優(yōu)質(zhì)品種，使其養(yǎng)殖地域范圍擴(kuò)大。養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦，放養(yǎng)蝦苗規(guī)格要在2厘米以上，經(jīng)淡化到零度的種苗，池塘以3-5畝為宜，水深1.5米左右，放苗時(shí)間在5月底、6月初，水溫在20以上，一般養(yǎng)殖條件下，畝放蝦苗2萬尾，并搭養(yǎng)500-100尾花、白鰱，以投喂顆粒飼料為主，定期使用光合細(xì)菌和水質(zhì)調(diào)節(jié)劑，調(diào)控水質(zhì)，預(yù)防蝦病。南美白對(duì)蝦體內(nèi)很重要的一種物質(zhì)就是蝦青素，就是表面紅顏色的成分，蝦青素是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的一種