酶工程第18章酶人工模擬

1、第十八章 酶的人工模擬一、模擬酶的理論基礎(chǔ)和策略一、模擬酶的理論基礎(chǔ)和策略二、模擬酶的分類二、模擬酶的分類三、抗體酶三、抗體酶四、印跡酶四、印跡酶五、五、模擬天然酶催化機理的各個方面模擬天然酶催化機理的各個方面 一、模擬酶的理論基礎(chǔ)和策略 酶是高效的催化劑，它的應(yīng)用日趨廣泛。由酶是高效的催化劑，它的應(yīng)用日趨廣泛。由于酶容易受到多種物理、化學(xué)因素的影響而變性于酶容易受到多種物理、化學(xué)因素的影響而變性失活，所以不能用酶廣泛取代工業(yè)催化劑。模擬失活，所以不能用酶廣泛取代工業(yè)催化劑。模擬酶是人工合成的高分子化合物，它模擬酶的結(jié)構(gòu)酶是人工合成的高分子化合物，它模擬酶的結(jié)構(gòu)和催化特性，并且能耐較惡劣的環(huán)境

2、，活性穩(wěn)定和催化特性，并且能耐較惡劣的環(huán)境，活性穩(wěn)定而持久。而持久。 1. 1. 模擬酶的概念模擬酶的概念研制模擬酶的基礎(chǔ) 20世紀世紀70年代以來，由于對蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)、年代以來，由于對蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)、X射線衍射技術(shù)及光譜技術(shù)的發(fā)展，人們對許多射線衍射技術(shù)及光譜技術(shù)的發(fā)展，人們對許多酶的結(jié)構(gòu)有了較深入的了解，對酶的結(jié)構(gòu)及其作酶的結(jié)構(gòu)有了較深入的了解，對酶的結(jié)構(gòu)及其作用機理能夠在分子水平上作出解釋。動力學(xué)方法用機理能夠在分子水平上作出解釋。動力學(xué)方法的發(fā)展以及對酶活性中心、酶抑制劑復(fù)合物和催的發(fā)展以及對酶活性中心、酶抑制劑復(fù)合物和催化反應(yīng)過渡態(tài)等結(jié)構(gòu)的描述，促進了對酶作用機化反應(yīng)過渡態(tài)等結(jié)構(gòu)的描述

3、，促進了對酶作用機制的研究，從而為人工模擬酶的發(fā)展提供了理論制的研究，從而為人工模擬酶的發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)?；A(chǔ)。 模擬酶的概念 模擬酶就是根據(jù)對酶催化作用起主導(dǎo)作用的因模擬酶就是根據(jù)對酶催化作用起主導(dǎo)作用的因素，利用有機化學(xué)、生物化學(xué)等方法設(shè)計和合成一素，利用有機化學(xué)、生物化學(xué)等方法設(shè)計和合成一些較天然酶簡單的非蛋白質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子，在些較天然酶簡單的非蛋白質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子，在分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及微環(huán)境分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及微環(huán)境等結(jié)構(gòu)特征，以及酶作用機理和立體化學(xué)特性，以等結(jié)構(gòu)特征，以及酶作用機理和立體化學(xué)特性，以這些分子作為模型來模擬酶對其底物的結(jié)合

4、和催化這些分子作為模型來模擬酶對其底物的結(jié)合和催化過程，以求模擬酶保留酶的高效性和專一性，克服過程，以求模擬酶保留酶的高效性和專一性，克服其穩(wěn)定性差等缺點。其穩(wěn)定性差等缺點。 “主客體”化學(xué) Pederson和和Cram報道了一系列光學(xué)活性冠醚的報道了一系列光學(xué)活性冠醚的合成方法。這些冠醚可以作為主體而與伯銨鹽客體合成方法。這些冠醚可以作為主體而與伯銨鹽客體形成復(fù)合物。形成復(fù)合物。Cram把主體與客體通過配位鍵或其他把主體與客體通過配位鍵或其他次級鍵形成穩(wěn)定復(fù)合物的化學(xué)領(lǐng)域稱為次級鍵形成穩(wěn)定復(fù)合物的化學(xué)領(lǐng)域稱為“主客體主客體”化學(xué)（化學(xué)（host-guest chemistry）。主客體化學(xué)的

5、基）。主客體化學(xué)的基本意義來源于酶與底物的相互作用，體現(xiàn)為主體和本意義來源于酶與底物的相互作用，體現(xiàn)為主體和客體在結(jié)合部位的空間及電子排列的互補，這種主客體在結(jié)合部位的空間及電子排列的互補，這種主客體互補與酶和它的底物結(jié)合情況相似?？腕w互補與酶和它的底物結(jié)合情況相似。 超分子化學(xué) 另一位法國的著名科學(xué)家另一位法國的著名科學(xué)家LehnLehn也在這方面作出了也在這方面作出了非凡的貢獻，他在研究穴醚及大環(huán)化合物與配體絡(luò)合非凡的貢獻，他在研究穴醚及大環(huán)化合物與配體絡(luò)合過程中，提出了超分子化學(xué)（過程中，提出了超分子化學(xué)（supermolecular chemistry）的概念，并在此理論指導(dǎo)下，合成了

6、更為）的概念，并在此理論指導(dǎo)下，合成了更為復(fù)雜的主體分子。他提出，超分子的形成源于底物和復(fù)雜的主體分子。他提出，超分子的形成源于底物和受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價鍵的作用。當(dāng)受體受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價鍵的作用。當(dāng)受體與絡(luò)合離子或分子結(jié)合成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的實體，與絡(luò)合離子或分子結(jié)合成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的實體，即形成了即形成了“超分子超分子”，它兼具分子識別、催化和選擇，它兼具分子識別、催化和選擇性輸出的功能。性輸出的功能。 1987年諾貝爾化學(xué)獎獲得者 由于由于Cram、Pederson和和Lehn在合成與天然蛋在合成與天然蛋白質(zhì)功能一樣的有機化合物方面取得了開拓性成果，白質(zhì)功能一

7、樣的有機化合物方面取得了開拓性成果，他們獲得了他們獲得了19871987年的諾貝爾化學(xué)獎。年的諾貝爾化學(xué)獎。 Cram Pederson Lehn 模擬酶設(shè)計的前提 在設(shè)計模擬酶之前，應(yīng)當(dāng)對酶的結(jié)構(gòu)和酶學(xué)在設(shè)計模擬酶之前，應(yīng)當(dāng)對酶的結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)有深入的了解：性質(zhì)有深入的了解： 酶活性中心底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)；酶活性中心底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)； 酶的專一性及其與底物結(jié)合的方式與能力；酶的專一性及其與底物結(jié)合的方式與能力； 反應(yīng)的動力學(xué)及各中間物的知識。反應(yīng)的動力學(xué)及各中間物的知識。 模擬酶設(shè)計時應(yīng)考慮的因素 設(shè)計模擬酶時應(yīng)考慮如下因素：非共價鍵相互設(shè)計模擬酶時應(yīng)考慮如下因素：非共價鍵相互作用是生物酶柔韌

8、性、可變性和專一性的基礎(chǔ)，故作用是生物酶柔韌性、可變性和專一性的基礎(chǔ)，故模擬酶應(yīng)為底物提供良好的微環(huán)境，便于底物、特模擬酶應(yīng)為底物提供良好的微環(huán)境，便于底物、特別是反應(yīng)的過渡態(tài)中間物以離子鍵、氫鍵等結(jié)合；別是反應(yīng)的過渡態(tài)中間物以離子鍵、氫鍵等結(jié)合；催化基團必須相對于結(jié)合點盡可能同底物的反應(yīng)基催化基團必須相對于結(jié)合點盡可能同底物的反應(yīng)基團接近，以促使反應(yīng)定向發(fā)生；模擬酶應(yīng)有足夠的團接近，以促使反應(yīng)定向發(fā)生；模擬酶應(yīng)有足夠的水溶性，并在接近生理條件下保持其催化活性。水溶性，并在接近生理條件下保持其催化活性。 二、模擬酶的分類模擬酶可分為：模擬酶可分為： 主客體酶模型，包括環(huán)糊精、冠醚、穴醚、主客體

9、酶模型，包括環(huán)糊精、冠醚、穴醚、雜環(huán)大環(huán)化合物和卟啉類等；雜環(huán)大環(huán)化合物和卟啉類等； 膠束酶模型；膠束酶模型； 肽酶；肽酶； 抗體酶；抗體酶； 分子印跡酶；分子印跡酶； 半合成酶；半合成酶； 雜合酶；雜合酶； 進化酶。進化酶。 1主客體酶模型 環(huán)糊精（環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）是由多個葡萄糖以）是由多個葡萄糖以1,4糖苷鍵連接而成的一類環(huán)狀低聚糖，可以糖苷鍵連接而成的一類環(huán)狀低聚糖，可以含有含有6、7、8個葡萄糖單位。它們均是略呈錐形的圓個葡萄糖單位。它們均是略呈錐形的圓筒，其伯羥基和仲羥基分別位于圓筒較小和較大的筒，其伯羥基和仲羥基分別位于圓筒較小和較大的開口端。這樣，開口端。

10、這樣，CD分子外側(cè)是親水的，其羥基可與分子外側(cè)是親水的，其羥基可與多種客體形成氫鍵；其內(nèi)側(cè)是多種客體形成氫鍵；其內(nèi)側(cè)是C3、C5上的氫原子和上的氫原子和糖苷氧原子組成的空腔，這個空腔具有疏水性，能糖苷氧原子組成的空腔，這個空腔具有疏水性，能夠包接多種客體分子，類似于酶對底物的結(jié)合。在夠包接多種客體分子，類似于酶對底物的結(jié)合。在CD分子的兩面引入催化基團，就可能具有酶的結(jié)合分子的兩面引入催化基團，就可能具有酶的結(jié)合底物和催化反應(yīng)的作用。底物和催化反應(yīng)的作用。 （1 1）環(huán)糊精酶模型）環(huán)糊精酶模型 環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)A水解酶的模擬 胰凝乳蛋白酶是一種蛋白水解酶。它的活胰凝乳蛋白酶是一種蛋白水解酶。它的活

11、性部位有性部位有His的咪唑基、的咪唑基、Asp的羧基及的羧基及Ser的羥基組成的羥基組成電荷中繼系統(tǒng)，參與催化底物的水解反應(yīng)。電荷中繼系統(tǒng)，參與催化底物的水解反應(yīng)。Bender等在環(huán)糊精上引入這三種基團，成功地制備出了模等在環(huán)糊精上引入這三種基團，成功地制備出了模擬酶擬酶Benzyme（圖中的（圖中的A），此酶催化對叔丁基），此酶催化對叔丁基苯基乙酸酯水解比天然酶快一倍以上。苯基乙酸酯水解比天然酶快一倍以上。Rama等人將等人將咪唑基的咪唑基的N直接與直接與CD的的C3相連，所得的模擬酶（圖相連，所得的模擬酶（圖中的中的B）催化對叔丁基苯基乙酸酯水解比天然酶快一）催化對叔丁基苯基乙酸酯水解比

12、天然酶快一個數(shù)量級。個數(shù)量級。 以環(huán)糊精為主體的模擬水解酶 A B C水解酶的模擬 Breslow在環(huán)糊精模擬酶領(lǐng)域做了大量而出色的在環(huán)糊精模擬酶領(lǐng)域做了大量而出色的工作，他認為模擬酶增加催化效率的關(guān)鍵是要增加工作，他認為模擬酶增加催化效率的關(guān)鍵是要增加環(huán)糊精對底物過渡態(tài)的結(jié)合能力，最簡單的辦法是環(huán)糊精對底物過渡態(tài)的結(jié)合能力，最簡單的辦法是修飾底物來增加底物同修飾底物來增加底物同CD的結(jié)合，從而可能增加的結(jié)合，從而可能增加CD對底物過渡態(tài)的結(jié)合，他們設(shè)計了一系列以二茂鐵、對底物過渡態(tài)的結(jié)合，他們設(shè)計了一系列以二茂鐵、金剛烷為結(jié)合位點的硝基苯酯（圖中的金剛烷為結(jié)合位點的硝基苯酯（圖中的C），以）

13、，以CD為催化劑可以加速這些酯水解達為催化劑可以加速這些酯水解達105106倍。倍。 B核糖核酸酶的模擬 核糖核酸酶有核糖核酸酶有2個個His咪唑基及咪唑基及1個質(zhì)子化的賴氨個質(zhì)子化的賴氨酸氨基處于活性中心，這酸氨基處于活性中心，這2個咪唑基在催化反應(yīng)中交個咪唑基在催化反應(yīng)中交替起著廣義酸堿的作用。替起著廣義酸堿的作用。Breslow等人設(shè)計合成了兩等人設(shè)計合成了兩種環(huán)糊精種環(huán)糊精A和和B模擬酶來催化環(huán)狀磷酸二酯的水解，模擬酶來催化環(huán)狀磷酸二酯的水解，A催化催化生成生成，而，而B催化催化生成生成。這里環(huán)糊精底物。這里環(huán)糊精底物復(fù)合物的幾何形狀和催化基團的位置對被水解鍵的選復(fù)合物的幾何形狀和催化

14、基團的位置對被水解鍵的選擇性起了決定性的作用。這兩種模擬酶的最適擇性起了決定性的作用。這兩種模擬酶的最適pH都在都在6左右，說明這兩個咪唑基也是分別以廣義酸堿參與左右，說明這兩個咪唑基也是分別以廣義酸堿參與催化的，與天然酶的催化機理一致。催化的，與天然酶的催化機理一致。 以環(huán)糊精為主體的模擬核糖核酸酶C轉(zhuǎn)氨酶的模擬 磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺是許多涉及氨基酸反磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺是許多涉及氨基酸反應(yīng)的輔酶，其中最重要的是轉(zhuǎn)氨酶催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)。應(yīng)的輔酶，其中最重要的是轉(zhuǎn)氨酶催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)。吡哆醛本身也有催化此反應(yīng)的作用，但由于它本身吡哆醛本身也有催化此反應(yīng)的作用，但由于它本身無底物結(jié)合部位，反應(yīng)速

15、度遠不如轉(zhuǎn)氨酶催化時快。無底物結(jié)合部位，反應(yīng)速度遠不如轉(zhuǎn)氨酶催化時快。在環(huán)糊精上連接吡哆胺（在環(huán)糊精上連接吡哆胺（A），它催化苯并咪唑基酮），它催化苯并咪唑基酮酸轉(zhuǎn)氨基的速度比吡哆胺單獨催化時快酸轉(zhuǎn)氨基的速度比吡哆胺單獨催化時快200倍，產(chǎn)物倍，產(chǎn)物中中D型和型和L型異構(gòu)體的含量不同，說明該模擬酶具有型異構(gòu)體的含量不同，說明該模擬酶具有一定的立體選擇性。一定的立體選擇性。Tabushi等將催化基團乙二胺引等將催化基團乙二胺引入吡哆胺基環(huán)糊精（入吡哆胺基環(huán)糊精（B），使得反應(yīng)加速了），使得反應(yīng)加速了2000倍以倍以上。上。 以環(huán)糊精為主體的模擬轉(zhuǎn)氨酶D含核糖的環(huán)糊精酶模型 Han等合成了一系列含

16、核糖的環(huán)糊精酶模型，等合成了一系列含核糖的環(huán)糊精酶模型，它兼具核酸酶、連接酶、磷酸酯酶和磷酸化酶的活它兼具核酸酶、連接酶、磷酸酯酶和磷酸化酶的活性。核糖中的鄰二羥基對催化起著關(guān)鍵的作用。性。核糖中的鄰二羥基對催化起著關(guān)鍵的作用。 R0 R1 R3 R12E橋聯(lián)環(huán)糊精酶模型 橋聯(lián)橋聯(lián)CD是近年發(fā)展起來的一類新型酶模型，它是近年發(fā)展起來的一類新型酶模型，它的兩個的兩個CD及橋基上的功能基構(gòu)成了具有協(xié)同包接和及橋基上的功能基構(gòu)成了具有協(xié)同包接和多重識別功能的催化活性中心，能更好地模擬酶對多重識別功能的催化活性中心，能更好地模擬酶對底物的識別和催化作用。底物的識別和催化作用。Matsui等將乙二胺偶聯(lián)

17、到等將乙二胺偶聯(lián)到CD上，然后與銅鹽作用形成橋聯(lián)環(huán)糊精，它催化糠上，然后與銅鹽作用形成橋聯(lián)環(huán)糊精，它催化糠偶姻氧化成糠偶酰的反偶姻氧化成糠偶酰的反應(yīng)應(yīng)，比沒有催化劑時大，比沒有催化劑時大20倍。倍。圖中圖中A的兩個的兩個CD協(xié)同包接糠偶姻的兩個呋喃環(huán)，同協(xié)同包接糠偶姻的兩個呋喃環(huán)，同時糠偶姻的烯醇負離子通過與橋基銅離子的靜電或時糠偶姻的烯醇負離子通過與橋基銅離子的靜電或配配位作用得以穩(wěn)定，從而加速了反應(yīng)。位作用得以穩(wěn)定，從而加速了反應(yīng)。 橋聯(lián) CD 酶模型橋聯(lián)CD水解酶模型 Breslow近年來在橋聯(lián)近年來在橋聯(lián)CD方面做了較多工作，方面做了較多工作，不僅報道了一系列橋聯(lián)不僅報道了一系列橋聯(lián)C

18、D的合成方法及其疏水結(jié)的合成方法及其疏水結(jié)合能力，還成功地將圖中的合能力，還成功地將圖中的C用于催化雙疏水基酯用于催化雙疏水基酯的水解反應(yīng)。底物被兩個的水解反應(yīng)。底物被兩個CD包接后，配位于橋基包接后，配位于橋基的的Cu2+ 正好處于底物的酯基附近，有利于正好處于底物的酯基附近，有利于OH對對酯基的進攻。其催化速率比無催化劑時提高了酯基的進攻。其催化速率比無催化劑時提高了2.2105倍。倍。 橋聯(lián)CD胡蘿卜素氧化酶模型 French等合成了含卟啉的橋聯(lián)等合成了含卟啉的橋聯(lián)CD，它可以，它可以選擇性地氧化選擇性地氧化C15=C15鍵。他們的設(shè)計思路是：鍵。他們的設(shè)計思路是： 合成的橋聯(lián)合成的橋聯(lián)

19、CD對底物胡蘿卜素的結(jié)合遠大于對底物胡蘿卜素的結(jié)合遠大于對產(chǎn)物視黃醛的結(jié)合，這樣避免了產(chǎn)物抑制；對產(chǎn)物視黃醛的結(jié)合，這樣避免了產(chǎn)物抑制； 引入能催化雙鍵反應(yīng)的金屬卟啉作為活性中引入能催化雙鍵反應(yīng)的金屬卟啉作為活性中心。心。 橋聯(lián)CD胡蘿卜素氧化酶模型胡蘿卜素胡蘿卜素視黃醛視黃醛四橋聯(lián)CD酶模型 細胞色素是一類含血紅素輔基的電子傳遞蛋細胞色素是一類含血紅素輔基的電子傳遞蛋白質(zhì)的總稱，它們參與氧化還原反應(yīng)。白質(zhì)的總稱，它們參與氧化還原反應(yīng)。Breslow等等合成的四橋聯(lián)環(huán)糊精模擬合成的四橋聯(lián)環(huán)糊精模擬P-450酶模型，是將酶模型，是將P-450酶活性中心的金屬卟啉分子與酶活性中心的金屬卟啉分子與4

20、個環(huán)糊精分子個環(huán)糊精分子相連，構(gòu)成了既具有底物結(jié)合部位又有催化基團相連，構(gòu)成了既具有底物結(jié)合部位又有催化基團的小分子酶模型。的小分子酶模型。 四橋聯(lián)環(huán)糊精模擬P-450酶模型底物的修飾 為了使該模擬酶催化甾體分子的羥基化，先給為了使該模擬酶催化甾體分子的羥基化，先給底物引入能與環(huán)糊精特異結(jié)合的叔丁基苯。在四橋底物引入能與環(huán)糊精特異結(jié)合的叔丁基苯。在四橋聯(lián)環(huán)糊精模擬聯(lián)環(huán)糊精模擬P-450酶模型催化下，此底物能被亞碘酶模型催化下，此底物能被亞碘?；剑；剑≒hIO）氧化，在）氧化，在C6位羥基化。此反應(yīng)表位羥基化。此反應(yīng)表現(xiàn)出相當(dāng)高的立體特異性?，F(xiàn)出相當(dāng)高的立體特異性。 在在C6位羥基上引入第

21、位羥基上引入第3個叔丁基苯，這樣個叔丁基苯，這樣3個叔個叔丁基苯與酶模型中的丁基苯與酶模型中的3個環(huán)糊精形成個環(huán)糊精形成3點結(jié)合復(fù)合物，點結(jié)合復(fù)合物，可以催化甾體可以催化甾體C9位氧化成羥基。由于羥基化后的甾位氧化成羥基。由于羥基化后的甾體可轉(zhuǎn)化成重要的藥物中間體，因此該酶模型具有體可轉(zhuǎn)化成重要的藥物中間體，因此該酶模型具有很大的應(yīng)用潛力。很大的應(yīng)用潛力。 四橋聯(lián)CD 模擬酶催化的甾體羥基化反應(yīng)（二）合成的主客體酶模型 除了使用天然存在的主體來構(gòu)建模擬酶外，除了使用天然存在的主體來構(gòu)建模擬酶外，人們還合成了冠醚、穴醚、人們還合成了冠醚、穴醚、環(huán)番環(huán)番、杯芳烴等大環(huán)、杯芳烴等大環(huán)多齒化合物來構(gòu)建

22、酶模型。多齒化合物來構(gòu)建酶模型。 冠醚冠醚 穴醚穴醚 杯芳烴杯芳烴 環(huán)番和杯芳烴的結(jié)構(gòu)特點 環(huán)番（環(huán)番（cyclophane）和杯芳烴（）和杯芳烴（calixarene）是）是一類具有共同的結(jié)構(gòu)和功能特征的芳香主體化合物，一類具有共同的結(jié)構(gòu)和功能特征的芳香主體化合物，它們通常擁有兩個或兩個以上的芳香環(huán)，通過亞甲它們通常擁有兩個或兩個以上的芳香環(huán)，通過亞甲基或醚氧鏈連接成空間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由芳香環(huán)構(gòu)成基或醚氧鏈連接成空間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由芳香環(huán)構(gòu)成的疏水空腔具有適當(dāng)?shù)某叽?，可以與另外一些小分的疏水空腔具有適當(dāng)?shù)某叽纾梢耘c另外一些小分子通過非共價鍵結(jié)合。為了使這類芳香主體化合物子通過非共價鍵結(jié)合。為了

23、使這類芳香主體化合物在水溶液中具有一定的溶解度，一般在其外層引入在水溶液中具有一定的溶解度，一般在其外層引入一些親水性基團。一些親水性基團。 三種不同大小的杯芳烴杯（杯（4）芳烴）芳烴 杯（杯（6）芳烴）芳烴 杯（杯（8）芳烴）芳烴 杯（6）芳烴的杯狀結(jié)構(gòu)杯芳烴與杯芳烴與C60的包合物的直接觀察的包合物的直接觀察 環(huán)番結(jié)構(gòu)式以冠醚為主體的模擬酶 日本學(xué)者日本學(xué)者Koga等采用冠醚為主體，合成了等采用冠醚為主體，合成了帶有巰基的仿酶模型，利用此酶可在分子內(nèi)實行帶有巰基的仿酶模型，利用此酶可在分子內(nèi)實行“準雙分子反應(yīng)準雙分子反應(yīng)”以合成多肽。此模型具有結(jié)合以合成多肽。此模型具有結(jié)合兩個氨基酸的能力

24、。兩個氨基酸的能力。 以冠醚為主體的模擬酶 Lehn等人合成了一種優(yōu)異的穴狀配體等人合成了一種優(yōu)異的穴狀配體24冠冠N6O2。它能利用靜電引力和氫鍵結(jié)合多聚。它能利用靜電引力和氫鍵結(jié)合多聚磷酸陰離子。研究表明此模擬酶在磷酸陰離子。研究表明此模擬酶在pH2.58.5之之間可明顯水解間可明顯水解ATP生成生成ADP或或AMP，在催化過，在催化過程中形成磷酰胺中間體。在程中形成磷酰胺中間體。在pH7時可加速時可加速ATP水水解解500倍。倍。 杯芳烴作為催化劑的優(yōu)點 在第一代和第二代超分子化合物中，冠醚在溶液在第一代和第二代超分子化合物中，冠醚在溶液中通常表現(xiàn)為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而不是穴狀結(jié)構(gòu)，不能為底中通

25、常表現(xiàn)為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而不是穴狀結(jié)構(gòu)，不能為底物提供有效的結(jié)合空腔；環(huán)糊精是一類半天然產(chǎn)物，物提供有效的結(jié)合空腔；環(huán)糊精是一類半天然產(chǎn)物，其空腔骨架過于剛性，對底物的結(jié)合能力受到一定限其空腔骨架過于剛性，對底物的結(jié)合能力受到一定限制。杯芳烴是完全通過實驗室合成的大環(huán)化合物，與制。杯芳烴是完全通過實驗室合成的大環(huán)化合物，與冠醚和環(huán)糊精相比具有內(nèi)在優(yōu)勢：其疏水的空穴可通冠醚和環(huán)糊精相比具有內(nèi)在優(yōu)勢：其疏水的空穴可通過簡單地改變單元數(shù)目而調(diào)節(jié)尺寸、構(gòu)象易變并可受過簡單地改變單元數(shù)目而調(diào)節(jié)尺寸、構(gòu)象易變并可受到調(diào)控、邊緣可以引入功能基團進行修飾和衍生化。到調(diào)控、邊緣可以引入功能基團進行修飾和衍生化。因此，

26、杯芳烴及其衍生物已經(jīng)被成功地用作催化劑和因此，杯芳烴及其衍生物已經(jīng)被成功地用作催化劑和模擬酶。模擬酶。 杯芳烴的催化活性舉例 Taniguchi和和Nomura研究了杯芳烴研究了杯芳烴159對苯酚與對苯酚與二氯甲烷的二氯甲烷的Willimson成醚反應(yīng)的催化作用，在催成醚反應(yīng)的催化作用，在催化劑存在的情況下，反應(yīng)化劑存在的情況下，反應(yīng)24小時后轉(zhuǎn)化率為小時后轉(zhuǎn)化率為100%，而沒有催化劑時的轉(zhuǎn)化率僅有而沒有催化劑時的轉(zhuǎn)化率僅有0.3%。 杯芳烴杯芳烴159叔丁基叔丁基杯芳烴159催化的Wiilimson成醚反應(yīng)酶催化1 1-芐基-1,41,4-二氫煙酰胺的加水反應(yīng) 酶催化酶催化1-芐基芐基-1

27、,4-二氫煙酰胺的加水反應(yīng)如下，二氫煙酰胺的加水反應(yīng)如下，酶為底物提供質(zhì)子，同時以帶負電荷的基團穩(wěn)定生酶為底物提供質(zhì)子，同時以帶負電荷的基團穩(wěn)定生成的正電荷中間體。成的正電荷中間體。 杯芳烴模擬酶 杯芳烴杯芳烴162下端的羧基可以為此反應(yīng)提供質(zhì)子，下端的羧基可以為此反應(yīng)提供質(zhì)子，上端的磺酸負離子穩(wěn)定正電荷中間體，從而使第一上端的磺酸負離子穩(wěn)定正電荷中間體，從而使第一步（限速步驟）加快而催化反應(yīng)。杯芳烴步（限速步驟）加快而催化反應(yīng)。杯芳烴163也能加也能加速上述反應(yīng)，但比杯芳烴速上述反應(yīng)，但比杯芳烴162效果差，可能是因為羧效果差，可能是因為羧酸與磺酸相比不易形成負離子，對正電荷的穩(wěn)定作酸與磺酸

28、相比不易形成負離子，對正電荷的穩(wěn)定作用較差。用較差。 杯芳烴季銨鹽164164的水解酶活性 杯芳烴季銨鹽杯芳烴季銨鹽164能催化十二烷基對硝基苯酯的能催化十二烷基對硝基苯酯的水解。杯芳烴季銨鹽水解。杯芳烴季銨鹽164對乙酸酯的甲醇解在沒有金對乙酸酯的甲醇解在沒有金屬離子存在時反應(yīng)極慢，但加入少量屬離子存在時反應(yīng)極慢，但加入少量Ba2+后可以使后可以使反應(yīng)加速一百萬倍以上，效率已與轉(zhuǎn)?；赶喈?dāng)。反應(yīng)加速一百萬倍以上，效率已與轉(zhuǎn)?；赶喈?dāng)。其原因是主客體配合物中的其原因是主客體配合物中的Ba2+能穩(wěn)定親核加成能穩(wěn)定親核加成時產(chǎn)生的負離子中間體。使親核加成限速步驟的反時產(chǎn)生的負離子中間體。使親核加成

29、限速步驟的反應(yīng)速率顯著提高。應(yīng)速率顯著提高。 杯芳烴165165的水解酶活性 杯芳烴杯芳烴165在被在被Ba2+活化后，在中等強度的堿性活化后，在中等強度的堿性條件下能作為有效的?；D(zhuǎn)移催化劑，它可使對硝條件下能作為有效的酰化轉(zhuǎn)移催化劑，它可使對硝基苯基乙酸酯（基苯基乙酸酯（pNPOAc）的水解速度增加）的水解速度增加10倍。倍。 核酸模擬酶 Reinhoudt等合成了一系列吡啶基修飾的杯等合成了一系列吡啶基修飾的杯4芳烴鋅配合物（芳烴鋅配合物（166）和咪唑基修飾的杯）和咪唑基修飾的杯4芳烴銅芳烴銅配合物（配合物（167），將它們作為核酸模擬酶。這些化），將它們作為核酸模擬酶。這些化合物在合

30、適的合物在合適的pH下可以顯著催化下可以顯著催化RNA模型底物模型底物2-羥基丙基羥基丙基-對硝基苯基磷酸二酯的環(huán)化反應(yīng)，其中對硝基苯基磷酸二酯的環(huán)化反應(yīng)，其中166使反應(yīng)加速使反應(yīng)加速2300倍，倍，167使反應(yīng)加速使反應(yīng)加速10000倍，倍，大于所有其他核酸模擬酶對該底物的催化活性。大于所有其他核酸模擬酶對該底物的催化活性。 杯芳烴166166和167167的結(jié)構(gòu)式杯芳烴166166和167167的催化機理2 2膠束模擬酶膠束的結(jié)構(gòu)膠束的結(jié)構(gòu) 球狀球狀 板層狀板層狀 圓柱狀圓柱狀模擬水解酶的膠束酶模型 在水溶液中，酶分子中有疏水的微環(huán)境，模在水溶液中，酶分子中有疏水的微環(huán)境，模擬酶在這種微

31、環(huán)境中的化學(xué)反應(yīng)的特殊性質(zhì)，也擬酶在這種微環(huán)境中的化學(xué)反應(yīng)的特殊性質(zhì)，也是模擬酶的一個重要方面。有人利用組氨酸的衍是模擬酶的一個重要方面。有人利用組氨酸的衍生物十四酰組氨酸與十六烷基三甲基溴化銨組生物十四酰組氨酸與十六烷基三甲基溴化銨組成兩種分子的混合微膠束，來催化乙酸對硝基苯成兩種分子的混合微膠束，來催化乙酸對硝基苯酯的水解，其速率比用組氨酸催化增加了酯的水解，其速率比用組氨酸催化增加了100倍。倍。 氧肟酸和肟在膠束模擬酶中的作用 在膠束模擬酶中常用氧肟酸和肟代替羥基來在膠束模擬酶中常用氧肟酸和肟代替羥基來研究氧負離子的親核反應(yīng)。它們催化乙酸對硝基研究氧負離子的親核反應(yīng)。它們催化乙酸對硝基

32、苯酯水解的速度常數(shù)比在非膠束中提高近萬倍。苯酯水解的速度常數(shù)比在非膠束中提高近萬倍。如用氧肟酸與十六烷基三甲基溴化銨一起催化酮如用氧肟酸與十六烷基三甲基溴化銨一起催化酮醇的去質(zhì)子反應(yīng)，其反應(yīng)速度提高醇的去質(zhì)子反應(yīng)，其反應(yīng)速度提高300020000倍，倍，是是OH催化的催化的60300倍。倍。 肟肟 氧肟酸氧肟酸（2）輔酶的膠束酶模型 將疏水性維生素將疏水性維生素B6長鏈衍生物與陽離子膠束長鏈衍生物與陽離子膠束混合，在形成的體系中加入混合，在形成的體系中加入Cu2+，可將酮酸轉(zhuǎn)化，可將酮酸轉(zhuǎn)化為氨基酸，有效地模擬了以維生素為氨基酸，有效地模擬了以維生素B6為輔酶的轉(zhuǎn)為輔酶的轉(zhuǎn)氨基作用。氨基作用。

33、 吡哆醛的長鏈衍生物可以使絲氨酸和吲哚合吡哆醛的長鏈衍生物可以使絲氨酸和吲哚合成色氨酸。成色氨酸。（3）金屬膠束酶模型 金屬膠束是指帶疏水基團的金屬配合物單獨金屬膠束是指帶疏水基團的金屬配合物單獨或與其他表面活性劑共同形成的膠束體系。其作或與其他表面活性劑共同形成的膠束體系。其作用是模擬金屬酶的活性中心和疏水性的微環(huán)境。用是模擬金屬酶的活性中心和疏水性的微環(huán)境。這種體系目前已經(jīng)取得了引人注目的成績，特別這種體系目前已經(jīng)取得了引人注目的成績，特別是在模擬羧肽酶是在模擬羧肽酶A、堿性磷酸酶、氧化酶、轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、氧化酶、轉(zhuǎn)氨酶等方面取得了很大的成功。將金屬酶的簡單模型等方面取得了很大的成功。

34、將金屬酶的簡單模型引入膠束體系，利用金屬離子的特殊作用催化水引入膠束體系，利用金屬離子的特殊作用催化水解反應(yīng)，而膠束所具有的疏水性微環(huán)境則對底物解反應(yīng)，而膠束所具有的疏水性微環(huán)境則對底物起包接作用。起包接作用。 金屬膠束水解酶 Tonellato等人以等人以吡啶甲酸對硝基苯酯吡啶甲酸對硝基苯酯（PNPP）為底物，研究了不同表面活性劑配體在）為底物，研究了不同表面活性劑配體在Cu2+或或Zn2+存在時催化存在時催化PNPP水解的能力，發(fā)現(xiàn)水解的能力，發(fā)現(xiàn)Cu2+、Zn2+的存在可使的存在可使PNPP的水解速度顯著增大，的水解速度顯著增大，當(dāng)當(dāng)Cu2+與相應(yīng)的表面活性劑形成與相應(yīng)的表面活性劑形成1

35、:1配合物時，水配合物時，水解反應(yīng)速度達到最大。解反應(yīng)速度達到最大。 3肽酶 肽酶（肽酶（pepzyme）是模擬天然酶活性部位而人）是模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。工合成的具有催化活性的多肽。 根據(jù)化學(xué)和晶體圖像數(shù)據(jù)提供的主要活性部根據(jù)化學(xué)和晶體圖像數(shù)據(jù)提供的主要活性部位氨基酸殘基的序列位置和分隔距離，將構(gòu)成酶位氨基酸殘基的序列位置和分隔距離，將構(gòu)成酶活性部位的殘基以適當(dāng)?shù)目臻g位置和取向通過肽活性部位的殘基以適當(dāng)?shù)目臻g位置和取向通過肽鍵相連，而分隔距離則用無側(cè)鏈取代的甘氨酸或鍵相連，而分隔距離則用無側(cè)鏈取代的甘氨酸或半胱氨酸調(diào)節(jié)。半胱氨酸調(diào)節(jié)。模擬蛋白酶的肽酶 Atassi

36、和和Manshouri設(shè)計合成的兩個設(shè)計合成的兩個29肽肽ChPepz和和TrPepz分別模擬了分別模擬了胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性部位，二者水解蛋白的活性分別與其模擬的的活性部位，二者水解蛋白的活性分別與其模擬的酶相同。在水解酶相同。在水解2個或個或2個以上串聯(lián)的賴氨酸和精氨個以上串聯(lián)的賴氨酸和精氨酸殘基的肽鍵時酸殘基的肽鍵時TrPepz比胰蛋白酶的活性更強。對比胰蛋白酶的活性更強。對于苯甲酰酪氨酸乙酯的水解，于苯甲酰酪氨酸乙酯的水解，ChPepz比比胰凝乳胰凝乳蛋白酶的活性稍低，而蛋白酶的活性稍低，而TrPepz則無活性。對于對甲則無活性。對于對甲苯磺酰精氨酸甲酯的

37、水解，苯磺酰精氨酸甲酯的水解，TrPepz比胰蛋白酶的活比胰蛋白酶的活性稍低，而性稍低，而ChPepz則無活性。則無活性。 4半合成酶 半合成酶是以天然蛋白質(zhì)或酶為母體，用化半合成酶是以天然蛋白質(zhì)或酶為母體，用化學(xué)或生物學(xué)方法引進適當(dāng)?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F，學(xué)或生物學(xué)方法引進適當(dāng)?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F，或改變其結(jié)構(gòu)從而形成一種新的或改變其結(jié)構(gòu)從而形成一種新的“人工酶人工酶”。 Bender等首次成功地將枯草桿菌蛋白酶活性等首次成功地將枯草桿菌蛋白酶活性部位的絲氨酸殘基，經(jīng)苯甲基磺酰氟特異性活化部位的絲氨酸殘基，經(jīng)苯甲基磺酰氟特異性活化后，再用巰基化合物取代，將絲氨酸轉(zhuǎn)化為半胱后，再用巰基化合物取代

38、，將絲氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸。雖然產(chǎn)生的巰基化枯草桿菌蛋白酶對肽或氨酸。雖然產(chǎn)生的巰基化枯草桿菌蛋白酶對肽或酯沒有水解活性，但能水解高度活化的底物（如酯沒有水解活性，但能水解高度活化的底物（如硝基苯酯等）。硝基苯酯等）。 半合成酶 Hilvert等利用類似的方法，將枯草桿菌蛋白等利用類似的方法，將枯草桿菌蛋白酶結(jié)合部位的特異性酶結(jié)合部位的特異性Ser轉(zhuǎn)變?yōu)槲腚装彼幔D(zhuǎn)變?yōu)槲腚装彼?，此硒化枯草桿菌蛋白酶既表現(xiàn)出轉(zhuǎn)氨酶活性，又此硒化枯草桿菌蛋白酶既表現(xiàn)出轉(zhuǎn)氨酶活性，又表現(xiàn)出含硒谷胱甘肽過氧化物酶的活性。表現(xiàn)出含硒谷胱甘肽過氧化物酶的活性。 利用半合成酶的方法不但可以制造新酶，還利用半合成酶的方

39、法不但可以制造新酶，還可以獲得關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和催化活性間關(guān)系的詳可以獲得關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和催化活性間關(guān)系的詳細信息，為構(gòu)建高效人工酶打下基礎(chǔ)。細信息，為構(gòu)建高效人工酶打下基礎(chǔ)。 三、抗體酶1 1抗體酶的原理及發(fā)展簡述抗體酶的原理及發(fā)展簡述 盡管科學(xué)家們在模擬酶方面作了大量的工作，但盡管科學(xué)家們在模擬酶方面作了大量的工作，但人工合成的模擬酶仍然與天然酶的催化效率相差很遠，人工合成的模擬酶仍然與天然酶的催化效率相差很遠，并且反應(yīng)類型也極為有限，多數(shù)為水解酶的模擬。由并且反應(yīng)類型也極為有限，多數(shù)為水解酶的模擬。由于逐漸認識到催化過程中關(guān)鍵的一步是于逐漸認識到催化過程中關(guān)鍵的一步是酶與底物過渡酶與底物過

40、渡態(tài)中間物的緊密結(jié)合態(tài)中間物的緊密結(jié)合，聯(lián)想到抗原導(dǎo)致生物體內(nèi)抗體，聯(lián)想到抗原導(dǎo)致生物體內(nèi)抗體的合成以及的合成以及抗原抗體的緊密結(jié)合抗原抗體的緊密結(jié)合，如果用某些人工合，如果用某些人工合成的小分子底物過渡態(tài)中間物的類似物作為半抗原，成的小分子底物過渡態(tài)中間物的類似物作為半抗原，誘導(dǎo)生物體合成相應(yīng)的抗體，這種抗體可能會有催化誘導(dǎo)生物體合成相應(yīng)的抗體，這種抗體可能會有催化該小分子底物發(fā)生反應(yīng)的活性。并將這種生物催化劑該小分子底物發(fā)生反應(yīng)的活性。并將這種生物催化劑稱為抗體酶稱為抗體酶( (abzyme) )。 抗體酶的特點 抗體酶技術(shù)是化學(xué)和生物學(xué)的研究成果在抗體酶技術(shù)是化學(xué)和生物學(xué)的研究成果在分子

41、水平交叉滲透的產(chǎn)物，是抗體的極其多樣分子水平交叉滲透的產(chǎn)物，是抗體的極其多樣性和酶分子的巨大催化能力結(jié)合在一起的蛋白性和酶分子的巨大催化能力結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)分子設(shè)計的新方法。構(gòu)制抗體酶的目的在于質(zhì)分子設(shè)計的新方法。構(gòu)制抗體酶的目的在于拓寬酶催化的應(yīng)用范圍，產(chǎn)生能催化生物體內(nèi)拓寬酶催化的應(yīng)用范圍，產(chǎn)生能催化生物體內(nèi)不存在的反應(yīng)的酶。不存在的反應(yīng)的酶。 抗體酶研制的歷史 1946年，年，Linus Pauling闡明了酶催化的實闡明了酶催化的實質(zhì)，同時指出，穩(wěn)定的反應(yīng)過渡態(tài)類似物可以質(zhì)，同時指出，穩(wěn)定的反應(yīng)過渡態(tài)類似物可以競爭性地抑制酶活性。酶之所以具有催化活力，競爭性地抑制酶活性。酶之所以具有

42、催化活力，是因為它和反應(yīng)物的過渡態(tài)（底物激態(tài)）發(fā)生是因為它和反應(yīng)物的過渡態(tài)（底物激態(tài)）發(fā)生特異性結(jié)合，而不是與反應(yīng)的底物基態(tài)發(fā)生特特異性結(jié)合，而不是與反應(yīng)的底物基態(tài)發(fā)生特異性結(jié)合。異性結(jié)合。 抗體酶研制的歷史 酶產(chǎn)生的生物局限性是酶催化高效性無法普酶產(chǎn)生的生物局限性是酶催化高效性無法普遍化的限制因素，突破限制就能人為地控制酶的遍化的限制因素，突破限制就能人為地控制酶的產(chǎn)生。高等動物的免疫系統(tǒng)為我們提供了可以利產(chǎn)生。高等動物的免疫系統(tǒng)為我們提供了可以利用的工具。用的工具。1969年，年，Jencks提出通過免疫誘導(dǎo)產(chǎn)提出通過免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生抗底物激態(tài)的抗體，該抗體具有類似酶的催化生抗底物激態(tài)的抗體，

43、該抗體具有類似酶的催化活性。這個抗體酶設(shè)想的提出，有可能為任何一活性。這個抗體酶設(shè)想的提出，有可能為任何一個化學(xué)反應(yīng)構(gòu)制一個專一性的酶。個化學(xué)反應(yīng)構(gòu)制一個專一性的酶。 抗體酶研制的歷史 在抗體酶研制中主要遇到兩個問題：在抗體酶研制中主要遇到兩個問題：底物底物激態(tài)瞬間存在，無法提取。根據(jù)競爭性抑制現(xiàn)象，激態(tài)瞬間存在，無法提取。根據(jù)競爭性抑制現(xiàn)象，可以通過化學(xué)方法合成底物過渡態(tài)的穩(wěn)定性類似可以通過化學(xué)方法合成底物過渡態(tài)的穩(wěn)定性類似物作為半抗原；物作為半抗原；抗原在分子量上有一定的要求?？乖诜肿恿可嫌幸欢ǖ囊?。由于抗原決定簇的多樣性，得到的抗體是多克隆由于抗原決定簇的多樣性，得到的抗體是多克隆的

44、，其中真正需要的抗體酶含量小。的，其中真正需要的抗體酶含量小。1975年，年，Kohler和和Milstein發(fā)明了單克隆技術(shù)，使抗體酶發(fā)明了單克隆技術(shù)，使抗體酶的獲得成為可能。的獲得成為可能。 抗體酶研制的歷史 還可以將能與底物結(jié)合的無酶活性的抗體還可以將能與底物結(jié)合的無酶活性的抗體通過人工的方法引入催化基團，使之變成有催通過人工的方法引入催化基團，使之變成有催化活性的抗體酶。化活性的抗體酶。 目前已經(jīng)構(gòu)制了催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)、酯水目前已經(jīng)構(gòu)制了催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)、酯水解和酰胺水解反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、光誘導(dǎo)聚解和酰胺水解反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、光誘導(dǎo)聚合和光裂解反應(yīng)、金屬螯合反應(yīng)、重排反應(yīng)的合和光裂

45、解反應(yīng)、金屬螯合反應(yīng)、重排反應(yīng)的抗體酶?？贵w酶。 2 2抗體酶的制備方法（1）穩(wěn)定過渡態(tài)法）穩(wěn)定過渡態(tài)法 迄今為止，大多數(shù)抗體酶是通過理論設(shè)計合迄今為止，大多數(shù)抗體酶是通過理論設(shè)計合適的、與反應(yīng)過渡態(tài)中間物結(jié)構(gòu)類似的穩(wěn)定化合適的、與反應(yīng)過渡態(tài)中間物結(jié)構(gòu)類似的穩(wěn)定化合物作為半抗原，免疫動物后產(chǎn)生針對此半抗原的物作為半抗原，免疫動物后產(chǎn)生針對此半抗原的抗體來獲得。抗體來獲得。 抗體酶舉例 Shultz小組利用與底物扭曲構(gòu)象相似的扭曲卟小組利用與底物扭曲構(gòu)象相似的扭曲卟啉作半抗原，制備的抗體可催化卟啉金屬螯合反應(yīng)。啉作半抗原，制備的抗體可催化卟啉金屬螯合反應(yīng)。亞鐵螯合酶是血紅素生物合成途徑中的末端酶

46、，可亞鐵螯合酶是血紅素生物合成途徑中的末端酶，可催化亞鐵離子插入到原卟啉中。催化亞鐵離子插入到原卟啉中。N甲基原卟啉由甲基原卟啉由于內(nèi)部甲基取代而呈扭曲結(jié)構(gòu)，它是此酶的有效抑于內(nèi)部甲基取代而呈扭曲結(jié)構(gòu)，它是此酶的有效抑制劑，也與酶催化的卟啉金屬螯合反應(yīng)的過渡態(tài)中制劑，也與酶催化的卟啉金屬螯合反應(yīng)的過渡態(tài)中間物結(jié)構(gòu)類似。由于甲基卟啉的抗體可催化平面結(jié)間物結(jié)構(gòu)類似。由于甲基卟啉的抗體可催化平面結(jié)構(gòu)原卟啉的金屬螯合反應(yīng)，這也證明了該反應(yīng)存在構(gòu)原卟啉的金屬螯合反應(yīng)，這也證明了該反應(yīng)存在扭曲的過渡態(tài)中間物。扭曲的過渡態(tài)中間物。 亞鐵螯合抗體酶的誘導(dǎo)物過渡態(tài)類似物過渡態(tài)類似物 底物底物 產(chǎn)物產(chǎn)物 抗體酶舉

47、例 Napper等用一個環(huán)化的磷酸酯作為底物過渡等用一個環(huán)化的磷酸酯作為底物過渡態(tài)類似物，使動物免疫得到單克隆抗體態(tài)類似物，使動物免疫得到單克隆抗體24B11，發(fā)現(xiàn)該抗體可催化外消旋的羥基羧酸酯分子內(nèi)環(huán)發(fā)現(xiàn)該抗體可催化外消旋的羥基羧酸酯分子內(nèi)環(huán)化形成內(nèi)酯，使反應(yīng)加速化形成內(nèi)酯，使反應(yīng)加速167倍，而且首次觀察倍，而且首次觀察到抗體酶催化反應(yīng)的專一性。反應(yīng)產(chǎn)物中一種對到抗體酶催化反應(yīng)的專一性。反應(yīng)產(chǎn)物中一種對映體的含量比另一種高出映體的含量比另一種高出94%。 磷酸內(nèi)酯抗體酶的誘導(dǎo)物（2 2）抗體與半抗原互補法 抗體與其抗原的相互作用是相當(dāng)精確的，抗抗體與其抗原的相互作用是相當(dāng)精確的，抗體常含有

48、與抗原結(jié)合的特異功能基團。帶正電荷體常含有與抗原結(jié)合的特異功能基團。帶正電荷的抗原常能誘導(dǎo)出結(jié)合部位帶負電荷的抗體，反的抗原常能誘導(dǎo)出結(jié)合部位帶負電荷的抗體，反之亦然。利用這個特點，可在抗體的抗原結(jié)合部之亦然。利用這個特點，可在抗體的抗原結(jié)合部位引入特定的帶電荷基團作為催化基團。位引入特定的帶電荷基團作為催化基團。 抗體酶舉例 Shokat等利用抗體與半抗原之間的電荷互補性，等利用抗體與半抗原之間的電荷互補性，用帶正電荷的半抗原（用帶正電荷的半抗原（H1）制備抗體，此抗體能催）制備抗體，此抗體能催化化消除反應(yīng)。其中一株單克隆抗體消除反應(yīng)。其中一株單克隆抗體43D43D3可加速反應(yīng)可加速反應(yīng)10

49、5倍。分析其反應(yīng)動力學(xué)發(fā)現(xiàn)，倍。分析其反應(yīng)動力學(xué)發(fā)現(xiàn)，kcat為為pH依賴性的，通過滴定證明這個位于抗原結(jié)合部依賴性的，通過滴定證明這個位于抗原結(jié)合部位的可解離基團的位的可解離基團的pKa值為值為6.2，是抗原結(jié)合部位的，是抗原結(jié)合部位的谷氨酸谷氨酸羧基。在疏水環(huán)境中谷氨酸側(cè)鏈羧基的酸羧基。在疏水環(huán)境中谷氨酸側(cè)鏈羧基的酸性減弱，一般以堿的形式起催化作用。性減弱，一般以堿的形式起催化作用。 消除抗體酶的誘導(dǎo)物H1（3）熵阱法 另一種設(shè)計半抗原的方法是利用抗體結(jié)合能另一種設(shè)計半抗原的方法是利用抗體結(jié)合能克服反應(yīng)熵壘?？贵w結(jié)合能被用來凍結(jié)轉(zhuǎn)動和翻克服反應(yīng)熵壘?？贵w結(jié)合能被用來凍結(jié)轉(zhuǎn)動和翻轉(zhuǎn)自由度，這

50、種自由度的限制是形成活化復(fù)合物轉(zhuǎn)自由度，這種自由度的限制是形成活化復(fù)合物所必需的。所必需的。 抗體酶舉例 用抗體作為熵阱非常成功的例子是抗體催化用抗體作為熵阱非常成功的例子是抗體催化的狄爾斯阿德耳（的狄爾斯阿德耳（Diels-Alder反應(yīng)）。反應(yīng)）。Diels-Alder環(huán)加成反應(yīng)是眾多形成環(huán)加成反應(yīng)是眾多形成CC鍵反應(yīng)中的一鍵反應(yīng)中的一種，是需要經(jīng)過高度有序及熵不利的過渡態(tài)的反種，是需要經(jīng)過高度有序及熵不利的過渡態(tài)的反應(yīng)。應(yīng)。 Hilvert等用穩(wěn)定的三環(huán)狀半抗原誘導(dǎo)的抗體等用穩(wěn)定的三環(huán)狀半抗原誘導(dǎo)的抗體可催化起始加合物的生成，然后立即排出可催化起始加合物的生成，然后立即排出SO2，產(chǎn)生二

51、氫苯鄰二甲酰亞胺。產(chǎn)生二氫苯鄰二甲酰亞胺。 環(huán)加成抗體酶的誘導(dǎo)物抗體酶舉例 Jackson等合成一個有椅式構(gòu)象的氧雜雙環(huán)化等合成一個有椅式構(gòu)象的氧雜雙環(huán)化合物來模擬由分支酸生成預(yù)苯酸這樣一個克萊森合物來模擬由分支酸生成預(yù)苯酸這樣一個克萊森重排反應(yīng)的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，用此雙環(huán)半抗原誘導(dǎo)的重排反應(yīng)的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，用此雙環(huán)半抗原誘導(dǎo)的抗體催化，可使重排反應(yīng)加速抗體催化，可使重排反應(yīng)加速104倍。倍。 分支酸分支酸預(yù)苯酸預(yù)苯酸（4）多底物類似法 很多酶的催化作用要有輔因子參與，這些輔很多酶的催化作用要有輔因子參與，這些輔因子包括金屬離子、血紅素、各種維生素輔酶等，因子包括金屬離子、血紅素、各種維生素輔酶等，因

52、此，將輔因子引入到抗體結(jié)合部位將會大大地因此，將輔因子引入到抗體結(jié)合部位將會大大地擴大抗體催化的范圍。用多底物類似物對動物進擴大抗體催化的范圍。用多底物類似物對動物進行一次免疫，可產(chǎn)生既有輔因子結(jié)合部位，又有行一次免疫，可產(chǎn)生既有輔因子結(jié)合部位，又有底物結(jié)合部位的抗體。小心設(shè)計半抗原可確保輔底物結(jié)合部位的抗體。小心設(shè)計半抗原可確保輔因子和底物的正確定向。因子和底物的正確定向。 抗體酶舉例 將三亞乙基四胺將三亞乙基四胺Co（三價）連接到肽底物上作（三價）連接到肽底物上作為半抗原，使動物免疫后產(chǎn)生抗體。此抗體的結(jié)合為半抗原，使動物免疫后產(chǎn)生抗體。此抗體的結(jié)合部位能與肽底物、三亞乙基四胺及部位能與肽

53、底物、三亞乙基四胺及Zn2+結(jié)合，結(jié)合，Zn2+的開放配位部位的開放配位部位可將可將OH傳遞到底傳遞到底物的待水解肽鍵的羰物的待水解肽鍵的羰基碳上，促進肽鍵水基碳上，促進肽鍵水解，可加速反應(yīng)解，可加速反應(yīng)105倍。倍。（5 5）抗體結(jié)合部位修飾法 通過對抗體的修飾，在抗體的抗原結(jié)合部位引通過對抗體的修飾，在抗體的抗原結(jié)合部位引入催化基團是增加催化效率的又一途徑，引入功能入催化基團是增加催化效率的又一途徑，引入功能基團的方法一般有兩種，即選擇性化學(xué)修飾法和基基團的方法一般有兩種，即選擇性化學(xué)修飾法和基因工程定點突變法。因工程定點突變法。 親和標記是將催化基團引入到抗體結(jié)合部位的親和標記是將催化基

54、團引入到抗體結(jié)合部位的有效方法。一般先用可裂解親和試劑與抗體作用，有效方法。一般先用可裂解親和試劑與抗體作用，然后再用二硫蘇糖醇處理，在抗體的結(jié)合部位附近然后再用二硫蘇糖醇處理，在抗體的結(jié)合部位附近引入巰基，用此巰基作為錨可以很方便地引入其他引入巰基，用此巰基作為錨可以很方便地引入其他化學(xué)功能基團（如咪唑）。化學(xué)功能基團（如咪唑）。抗體酶舉例 吉林大學(xué)羅貴民教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組開發(fā)了一吉林大學(xué)羅貴民教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組開發(fā)了一種用單克隆抗體制備含硒抗體酶的方法?？贵w可變種用單克隆抗體制備含硒抗體酶的方法?？贵w可變區(qū)一般含有數(shù)個絲氨酸殘基，而絲氨酸的羥基可用區(qū)一般含有數(shù)個絲氨酸殘基，而絲氨酸的羥基可

55、用苯甲磺酰氟活化，再經(jīng)硒化氫處理后，轉(zhuǎn)變成硒代苯甲磺酰氟活化，再經(jīng)硒化氫處理后，轉(zhuǎn)變成硒代半胱氨酸，而硒代半胱氨酸是谷胱甘肽過氧化物酶半胱氨酸，而硒代半胱氨酸是谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性中心的催化基團。他們用谷胱甘肽二）活性中心的催化基團。他們用谷胱甘肽二硝基酚（硝基酚（GSHDNP）及其甲酯、乙酯分別作為半）及其甲酯、乙酯分別作為半抗原得到抗體，再用上述方法引入硒代半胱氨酸，抗原得到抗體，再用上述方法引入硒代半胱氨酸，得到的抗體酶分別為天然兔肝得到的抗體酶分別為天然兔肝GPX活性的活性的1/5、1.6倍和倍和8.5倍。倍。 谷胱甘肽過氧化物抗體酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 這些結(jié)果說明，這些結(jié)果

56、說明，3種含硒抗體酶活性不同的主要種含硒抗體酶活性不同的主要原因與抗體活性中心的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，半抗原的結(jié)構(gòu)原因與抗體活性中心的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，半抗原的結(jié)構(gòu)不同，產(chǎn)生的抗體活性部位的結(jié)構(gòu)必定不同。調(diào)節(jié)半不同，產(chǎn)生的抗體活性部位的結(jié)構(gòu)必定不同。調(diào)節(jié)半抗原的結(jié)構(gòu)，實際上是在調(diào)整抗體活性部位的空間結(jié)抗原的結(jié)構(gòu)，實際上是在調(diào)整抗體活性部位的空間結(jié)構(gòu)，使其中的催化基團處于更有利于發(fā)揮催化作用的構(gòu)，使其中的催化基團處于更有利于發(fā)揮催化作用的微環(huán)境中，因而能產(chǎn)生活性高于天然酶的抗體酶。微環(huán)境中，因而能產(chǎn)生活性高于天然酶的抗體酶。 通過基因工程的方法，在抗體的結(jié)合部位引入催通過基因工程的方法，在抗體的結(jié)合部位引入

57、催化氨基酸殘基，也能大大提高抗體酶的活性?；被釟埢材艽蟠筇岣呖贵w酶的活性。 抗體的抗原結(jié)合部位引入催化基團的方法（6）抗體庫法 抗體庫法即用基因克隆技術(shù)將全套抗體重鏈抗體庫法即用基因克隆技術(shù)將全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因克隆出來，重組到原核表達載和輕鏈可變區(qū)基因克隆出來，重組到原核表達載體，通過大腸桿菌直接表達有功能的抗體分子片體，通過大腸桿菌直接表達有功能的抗體分子片段段Fab，從中篩選出特異性的可變區(qū)基因。，從中篩選出特異性的可變區(qū)基因。 從抗體庫中可用各種抗原篩選出相應(yīng)的抗體從抗體庫中可用各種抗原篩選出相應(yīng)的抗體基因。若用底物過渡態(tài)類似物作抗原，可篩選出基因。若用底物過渡態(tài)類似物

58、作抗原，可篩選出有催化活性的抗體基因。將篩選出的克隆大量培有催化活性的抗體基因。將篩選出的克隆大量培養(yǎng)，可得到大量的抗體酶。養(yǎng)，可得到大量的抗體酶。3 3提高抗體酶催化活性的因素（1）抗體酶的結(jié)構(gòu)）抗體酶的結(jié)構(gòu) 1969年，年，Pattern等在用底物過渡態(tài)類似物膦酸等在用底物過渡態(tài)類似物膦酸硝基苯酯作為半抗原，免疫動物產(chǎn)生催化酯水解的抗硝基苯酯作為半抗原，免疫動物產(chǎn)生催化酯水解的抗體酶的研究中發(fā)現(xiàn)，在免疫過程中發(fā)生了體細胞突變，體酶的研究中發(fā)現(xiàn)，在免疫過程中發(fā)生了體細胞突變，有有9個堿基發(fā)生了突變。因突變引起的抗體結(jié)構(gòu)變化個堿基發(fā)生了突變。因突變引起的抗體結(jié)構(gòu)變化為半抗原創(chuàng)造了一個良好的結(jié)合

59、區(qū)，使抗原抗體之間為半抗原創(chuàng)造了一個良好的結(jié)合區(qū)，使抗原抗體之間的親和力增加了的親和力增加了14000倍，抗體的催化活性也因此提倍，抗體的催化活性也因此提高了高了100倍。這一重要發(fā)現(xiàn)表明，選擇對抗原具有較倍。這一重要發(fā)現(xiàn)表明，選擇對抗原具有較高親和力的抗體酶，其催化活性也會提高。因此，可高親和力的抗體酶，其催化活性也會提高。因此，可用更長時間免疫或直接通過誘變的方法來提高抗體酶用更長時間免疫或直接通過誘變的方法來提高抗體酶的親和力，從而提高其催化活性。的親和力，從而提高其催化活性。 （2 2）半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)方式 半抗原與載體蛋白之間的臂長和偶聯(lián)方式都會半抗原與載體蛋白之間的臂長和偶聯(lián)

60、方式都會影響抗體酶的活性。偶聯(lián)方式不同，所得的抗原價影響抗體酶的活性。偶聯(lián)方式不同，所得的抗原價（半抗原密度）不同，會影響抗原的免疫原性。載（半抗原密度）不同，會影響抗原的免疫原性。載體蛋白與半抗原的不同基團偶聯(lián)產(chǎn)生的抗體酶，活體蛋白與半抗原的不同基團偶聯(lián)產(chǎn)生的抗體酶，活性也會有顯著差異。性也會有顯著差異。Landry等通過載體蛋白與半抗等通過載體蛋白與半抗原不同基團的偶聯(lián)，合成了原不同基團的偶聯(lián)，合成了3種抗原，經(jīng)免疫動物種抗原，經(jīng)免疫動物獲得了獲得了9種單克隆抗體。研究表明，這種單克隆抗體。研究表明，這3種抗原產(chǎn)生種抗原產(chǎn)生的抗體酶催化活力顯著不同。的抗體酶催化活力顯著不同。 （3）異源免