Alzheimer病的早期診斷和指標(biāo)規(guī)范化研究

1、Alzheimer病的早期診斷和指標(biāo)規(guī)范化研究項(xiàng)目申請(qǐng)書(shū)編寫(xiě)提綱一、立項(xiàng)依據(jù)和目標(biāo)1. 本課題研究意義及同類(lèi)研究工作國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀、知識(shí)產(chǎn)權(quán)狀況與存在問(wèn)題人口老齡化成為一個(gè)全球性現(xiàn)象，在全世界186個(gè)國(guó)家和地區(qū)中，有1/3以上的國(guó)家和地區(qū)已進(jìn)入“老年型”社會(huì)，中國(guó)的某些城市也已進(jìn)入了“老年型”社會(huì)。據(jù)聯(lián)合國(guó)估計(jì)，1950年，全世界60歲以上的老年人約有2億，1970年達(dá)到3億，2000年達(dá)到6億。2020年將達(dá)到10億，2050年，全球?qū)⒂薪?0億的老年人。目前世界絕大多數(shù)老年人口生活在亞洲3.38億，中國(guó)60歲及以上老年人口1.34億，占世界老年人口的21.34%，占亞洲老年人口的39.7%

2、，2050年，亞洲老年人口將增長(zhǎng)到12.27億，中國(guó)老年人口將超過(guò)4億，占全國(guó)總?cè)丝诘?0%，比目前法、德、意、日、英五國(guó)的總?cè)丝谶€要多。隨著人口的老年化，老年人的相關(guān)問(wèn)題將日漸突出，如老年人生活問(wèn)題、醫(yī)療保健和社會(huì)保障問(wèn)題，這些問(wèn)題的有效處理直接關(guān)系到國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定。近年來(lái)多數(shù)調(diào)查結(jié)果顯示，在歐美國(guó)家，60歲以上老年人6%12%發(fā)生癡呆，85歲以上的老人則有20%40%發(fā)生癡呆，其中半數(shù)以上為老年性癡呆。在全球約有超過(guò)2000萬(wàn)的人患有該病，癡呆發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而成倍上升，年齡每增長(zhǎng)5歲，發(fā)病率即增長(zhǎng)一倍。在65歲以上的年齡段中，老年癡呆的發(fā)病率約為5%；超過(guò)85歲，發(fā)病率增加到

3、25%；95歲以上的人群當(dāng)中高達(dá)60%。我國(guó)流行病學(xué)資料表明：55歲以上老人癡呆癥總患病率為2.9%，65歲以上人口中癡呆癥總患病率為5.22%。其中，60-69歲人群中老年癡呆癥的發(fā)病率為2.3%，70-79歲為3.97%，80歲以上為32%。我國(guó)現(xiàn)有65歲以上人口9610萬(wàn)，估算全國(guó)共有各類(lèi)癡呆癥患者500萬(wàn)，老年癡呆占2/3之多，2050年，癡呆患者將增加到2000萬(wàn)，與目前全球癡呆人數(shù)持平。這是中國(guó)未來(lái)幾十年將面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題，醫(yī)務(wù)人員和相關(guān)專(zhuān)業(yè)人員對(duì)這個(gè)問(wèn)題應(yīng)引起高度的重視，在疾病的早期診斷和干預(yù)方面做些深入的研究。阿爾茨海默病(Alzheimers disease, AD)是老年癡呆

4、的最常見(jiàn)原因，它是一種原因不明的、進(jìn)行性的、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，其特征性病理改變?yōu)榇竽X皮層及腦區(qū)的纖維蛋白沉積,即細(xì)胞外間隙的淀粉樣蛋白(-amyloid, A)和細(xì)胞內(nèi)多聚Tau蛋白的沉積,兩者在病理形態(tài)學(xué)上分別表現(xiàn)為老年斑(SP)和神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)。AD患者的最終結(jié)局癡呆，當(dāng)出現(xiàn)明顯癡呆時(shí)，臨床診斷沒(méi)有多大困難，但此時(shí)病情已無(wú)法逆轉(zhuǎn)，失去了治療時(shí)機(jī)。最近有研究者提出從正常老年發(fā)展成AD癡呆是連續(xù)的過(guò)程，紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院Barry Reisberg博士把這個(gè)連續(xù)過(guò)程分為七個(gè)期：Stage 1正常增齡期（normal ageing），Stage 2極輕微認(rèn)知損害期（very mild

5、 cognitive impairment），Stage 3輕微認(rèn)知損害期（mild cognitive impairment），Stage 4中度認(rèn)知損害期（moderate cognitive impairment），Stage 5中等嚴(yán)重認(rèn)知損害期（moderately severe cognitive impairment），Stage 6嚴(yán)重認(rèn)知損害期（severe cognitive impairment）， Stage 7極嚴(yán)重認(rèn)知損害期（very severe cognitive impairment）。正常增齡期，其記憶能力與年齡和教育水平相對(duì)應(yīng)，既無(wú)主觀記憶減退的體驗(yàn)，也無(wú)

6、客觀的認(rèn)知損害；極輕微認(rèn)知損害期，個(gè)體有主觀記憶減退的癥狀，如忘記熟悉的字或人名，或常找不到鑰匙、眼鏡或其它常用物品，朋友、家人或同事還沒(méi)有注意到記憶問(wèn)題，醫(yī)學(xué)檢查無(wú)異常發(fā)現(xiàn)，這些現(xiàn)象可能是增齡相關(guān)改變，也能是AD最早期的癥狀；輕微認(rèn)知損害（MCI）期，有主觀記憶困難，朋友、家人或同事能發(fā)現(xiàn)其記憶缺陷，醫(yī)學(xué)檢查或心理測(cè)試發(fā)現(xiàn)有記憶缺陷的證據(jù)，其它認(rèn)知功能和社會(huì)功能沒(méi)有明顯的缺陷，有這些癥狀的老年人三年后有半數(shù)發(fā)展成AD，許多研究者把MCI看著臨床前期AD；中度認(rèn)知損害期，即臨床早期AD，除記憶損害外，還有其它認(rèn)知功能損害，如執(zhí)行功能、推理能力和計(jì)算能力等方面的損害，IQ70，社會(huì)適應(yīng)能力受損；

7、以后各期認(rèn)知損害更加明顯。Zaudig M認(rèn)為從正常增齡到AD是一個(gè)連續(xù)譜，可以人為地分為幾個(gè)期：正常增齡期、無(wú)癥狀A(yù)D期、主觀記憶減退期、輕度認(rèn)知損害期（輕、中、重）、AD癡呆期，如下圖所示。MCI和AD的關(guān)系雖然沒(méi)有最后定論，但多數(shù)研究者認(rèn)為MCI是正常老化與AD的過(guò)度期，Bozoki A等人研究發(fā)現(xiàn)每年有4%-25%的MCI發(fā)展成癡呆，但多數(shù)隨訪(fǎng)研究發(fā)現(xiàn)每年有10%-15%的MCI發(fā)展成癡呆，所以多數(shù)研究者把MCI看著臨床前期AD。在無(wú)癥狀A(yù)D期，部分病人未經(jīng)特殊治療，可能會(huì)自發(fā)逆轉(zhuǎn)；在主觀記憶減退期和輕度認(rèn)知損害期，經(jīng)合理有效治療，部分病人可能會(huì)逆轉(zhuǎn)；進(jìn)入癡呆期后，即使積極治療，也無(wú)法

8、使病情逆轉(zhuǎn)，但能延緩疾病的進(jìn)程。由此看來(lái)，AD的早期診斷對(duì)指導(dǎo)治療和改變預(yù)后具有重要的意義，也是發(fā)展新治療技術(shù)的基礎(chǔ)。要改變AD患者的結(jié)局，必須在輕度認(rèn)知損害期之前做出診斷，這才是真正意義上的AD早期診斷。AD早期診斷標(biāo)記包括神經(jīng)心理學(xué)標(biāo)記和生物學(xué)標(biāo)記，后者包括遺傳標(biāo)記、影像學(xué)標(biāo)記和神經(jīng)生化標(biāo)記。在神經(jīng)心理學(xué)標(biāo)記方面，主要是測(cè)量新聯(lián)想形成和保持的記憶測(cè)驗(yàn)、反映執(zhí)行功能的神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)，因?yàn)榕c學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞首先受損，以后逐漸波及到控制思維、判斷和行為的神經(jīng)細(xì)胞。在遺傳標(biāo)記方面，目前發(fā)現(xiàn)有四個(gè)基因與AD發(fā)病有關(guān)，其中三個(gè)基因（分別在1、14和21號(hào)染色體上）與早發(fā)AD有關(guān)，載脂蛋白等位基因

9、（APOE-4）與晚發(fā)AD有關(guān)。在影象學(xué)標(biāo)記方面，目前比較多研究認(rèn)為SPECT和PET可以作為AD早期診斷技術(shù)，已發(fā)現(xiàn)早期AD患者存在顳頂區(qū)低灌流，而且血流降低程度與認(rèn)知功能下降程度存在顯著的相關(guān)關(guān)系；AD早期多巴胺系統(tǒng)的調(diào)節(jié)也值得關(guān)注，已發(fā)現(xiàn)海馬、顳葉中D2受體變化與圖片記憶、人名記憶等功能密切相關(guān)；FDG-PET顯像顯示中顳葉在AD早期存在糖代謝速率下降；近年來(lái)正在開(kāi)發(fā)靶向斑塊顯像劑，以期待能在活體腦中直接標(biāo)記顯示AD的特征性病理改變老年斑(SP)和神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)。聯(lián)合應(yīng)用多種顯像劑進(jìn)行活體腦顯像，探討AD機(jī)制，將是AD早期診斷中的重大突破。在神經(jīng)生化標(biāo)記方面，主要是測(cè)量腦脊液和血

10、液中和Tau蛋白，目前認(rèn)為在疾病早期隨著年齡增加，A沉積增加，腦脊液中A1-42降低，但單純檢測(cè)腦脊液中A含量并不能作為AD的診斷指標(biāo)。AD患者腦脊液中Tau蛋白含量增高，與其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及正常人之間有顯著性差異。腦脊液中Tau蛋白檢測(cè)對(duì)AD的診斷具有75%的特異性和93%的靈敏度。上述這些診斷技術(shù)在不同階段的AD患者中診斷的特異性和敏感性，國(guó)內(nèi)外都有研究報(bào)告，結(jié)果差距很大，從30%到90%，有些甚至出現(xiàn)矛盾的結(jié)果。從現(xiàn)有的研究文獻(xiàn)來(lái)看，多數(shù)研究是對(duì)單一指標(biāo)的考查，聯(lián)合多項(xiàng)指標(biāo)的研究不多；橫斷面或短期隨訪(fǎng)研究多，長(zhǎng)期的隨訪(fǎng)研究少；多數(shù)研究的對(duì)象是臨床期AD，對(duì)臨床前期AD的診斷價(jià)值還不清楚

11、。AD早期診斷必須在輕度認(rèn)知損害（MCI）期之前做出，在DSM-和ICD-10都列入了增齡相關(guān)認(rèn)知損害的診斷類(lèi)別，并提出了相應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)：年齡在50歲以上，有AD特征病理改變的物質(zhì)基礎(chǔ)，與年輕時(shí)相比記憶力有明顯的減退，客觀記憶測(cè)驗(yàn)成績(jī)低于年輕成人平均成績(jī)，一般認(rèn)知功能和日常生活能力正常，沒(méi)有癡呆的證據(jù)。多數(shù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有1/3的老年人符合MCI的診斷標(biāo)準(zhǔn)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為MCI是AD的早期，將來(lái)可能發(fā)展成AD癡呆，有研究報(bào)告每年有25%的MCI患者轉(zhuǎn)化為癡呆，大多數(shù)研究報(bào)告每年有10%-15%的MCI患者發(fā)展成AD癡呆，因此及時(shí)診斷和治療MCI對(duì)改變AD的結(jié)局具有重要的意義。本項(xiàng)目擬以MCI為研究對(duì)

12、象，采用縱向研究方法，考查神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)、腦脊液/血漿和Tau蛋白、神經(jīng)核醫(yī)學(xué)顯像技術(shù)（班塊顯像和D2受體顯像）、載脂蛋白等位基因（APOE-4）對(duì)早期AD的診斷特異性和敏感性，以及對(duì)AD癡呆的預(yù)測(cè)價(jià)值。靶向班塊顯像技術(shù)在活體直接顯示AD特征病理改變（老年斑）國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有報(bào)道，有關(guān)多巴胺D2受體與AD的關(guān)系國(guó)內(nèi)也未見(jiàn)報(bào)道。如能開(kāi)展此項(xiàng)目，有望研制出一套客觀、特異、靈敏的早期AD診斷技術(shù)，對(duì)AD預(yù)防、治療和新藥開(kāi)發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義，可望改變AD的結(jié)局，為家庭和社會(huì)做出積極的貢獻(xiàn)。主要參考文獻(xiàn)（1）Burns A, Zaudig M. Mild cognitive impairment in ol

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20、行活體SPECT/PET腦顯像。（3）腦脊液或血漿1-42和磷酸化Tau蛋白對(duì)臨床前期和臨床早期AD的診斷特異性和敏感性，國(guó)內(nèi)外已有研究報(bào)道，但主要針對(duì)AD癡呆病人，本研究主要考查對(duì)MCI的診斷特異性和敏感性，同時(shí)考查對(duì)AD癡呆的預(yù)測(cè)價(jià)值。（4）載脂蛋白等位基因（APOE-4）對(duì)臨床前期和臨床早期AD的診斷特異性和敏感性和對(duì)AD癡呆的預(yù)測(cè)價(jià)值。（5）綜合分析不同診斷技術(shù)聯(lián)合對(duì)臨床前期和臨床早期AD的診斷特異性和敏感性和對(duì)AD癡呆的預(yù)測(cè)價(jià)值。研究目標(biāo)（1）考查正常老年人、MCI（臨床前期AD）和臨床早期AD在各項(xiàng)觀察指標(biāo)上的差異，確定MCI每年轉(zhuǎn)化成AD的概率。（2）通過(guò)對(duì)100名MCI患者的追

21、蹤對(duì)照研究，考查各指標(biāo)和不同指標(biāo)組合對(duì)早期AD的診斷特異性和敏感性和對(duì)AD癡呆的預(yù)測(cè)價(jià)值。（3）建立早期AD的標(biāo)準(zhǔn)化診斷程序。（4）建立預(yù)測(cè)AD癡呆的數(shù)學(xué)模型和鑒別正常老人和早期AD的判別模型。擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題（1）獲得有代表性的同質(zhì)樣本：國(guó)外一些研究結(jié)果不一致，樣本的同質(zhì)性問(wèn)題可能其中原因之一，本研究將嚴(yán)格按MCI的診斷標(biāo)準(zhǔn)和AD的研究診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇樣本，特別強(qiáng)調(diào)AD特征病理改變的物質(zhì)基礎(chǔ)。（2）選擇能反映AD早期認(rèn)知功能改變的神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)，過(guò)去我們?cè)谠鳊g性記憶改變和老年癡呆記憶特征等研究中，發(fā)現(xiàn)多維記憶評(píng)估量表中的某些分測(cè)驗(yàn)（如漢詞配對(duì)學(xué)習(xí)、圖-符配對(duì)學(xué)習(xí)、圖畫(huà)回憶等分測(cè)驗(yàn)）對(duì)正常老年人、A

22、D癡呆和其它類(lèi)型癡呆有鑒別價(jià)值。（3）神經(jīng)核醫(yī)學(xué)分子顯像技術(shù)的建立是本研究的關(guān)鍵技術(shù)，也是本研究的難點(diǎn)，本研究需要的兩種顯像劑(多巴胺D2受體顯像劑131I-epidepride、斑塊顯像劑131I-IMPY)合作單位已研制成功，并擁有放射性藥品使用許可證(四類(lèi))，可在其下屬江原醫(yī)院完成本研究。3本課題的特色和創(chuàng)新之處（與國(guó)內(nèi)外類(lèi)似研究比較）（1）目前AD的生前診斷主要根據(jù)臨床癥狀和間接的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)，確診需要死后病理證據(jù)（老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)），本研究聯(lián)合應(yīng)用多種神經(jīng)核醫(yī)學(xué)活體顯像技術(shù)（尤其是131I-IMPY標(biāo)記SPECT 班塊顯像技術(shù)和131I-epidepride標(biāo)記SPECT多巴胺D2

23、受體顯像技術(shù)）作為AD早期診斷指標(biāo)，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。這些技術(shù)能在活體上直接顯示臨床早期和臨床前期AD的特征性病理改變，具有重要的確診價(jià)值。（2）本項(xiàng)目以AD癡呆的高危人群（MCI）為研究對(duì)象，采用縱向追蹤研究方法考查神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)、血漿和Tau蛋白、APOE-4檢測(cè)對(duì)AD早期診斷和預(yù)測(cè)價(jià)值，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道，國(guó)外縱向追蹤研究也不多。（3）本項(xiàng)目MCI的入組標(biāo)準(zhǔn)比國(guó)外類(lèi)似的研究嚴(yán)格，除記憶輕度減退外，特別強(qiáng)調(diào)AD特征性病理改變的物質(zhì)基礎(chǔ)腦脊液或血漿和Tau蛋白含量異常，排除其它原因（抑郁、腦血管病變等）引起的輕度認(rèn)知損害，所以本項(xiàng)目中MCI是真正意義上的早期AD。4研究工作的預(yù)期結(jié)果、成果提交方式

24、及專(zhuān)利申請(qǐng)狀況。本項(xiàng)研究通過(guò)對(duì)健康老年人和MCI患者的追蹤對(duì)照研究，考查各指標(biāo)和不同指標(biāo)組合對(duì)早期AD的診斷特異性和敏感性和對(duì)AD癡呆的預(yù)測(cè)價(jià)值；建立早期AD的標(biāo)準(zhǔn)化診斷程序；建立預(yù)測(cè)AD癡呆的數(shù)學(xué)模型和鑒別正常老人和早期AD的判別模型。為AD的早期診斷提供敏感的或新的技術(shù)指標(biāo)，對(duì)臨床實(shí)踐（老年癡呆的早期診斷、病理性記憶缺陷和增齡性記憶改變的鑒別、AD的早期治療）都有重要的指導(dǎo)價(jià)值。本研究主要以發(fā)表科學(xué)論文的形式推廣研究成果，預(yù)計(jì)可發(fā)表論文4-5篇，其中在國(guó)外期刊上發(fā)表1-2篇。培養(yǎng)研究生23名。二、研究方法和技術(shù)路線(xiàn)1擬采取的研究實(shí)驗(yàn)方法、步驟、技術(shù)路線(xiàn)及可行性、可靠性論證；研究對(duì)象本項(xiàng)研究

25、的對(duì)象包括健康老年人、MCI患者和老年癡呆患者三組。（1）健康老年人取樣30-50人，入組標(biāo)準(zhǔn)為：年齡在60-70歲之間；目前和過(guò)去無(wú)明顯精神和神經(jīng)系統(tǒng)疾?。粺o(wú)主觀記憶困難、詳細(xì)醫(yī)學(xué)檢查無(wú)記憶缺陷的證據(jù)；標(biāo)準(zhǔn)化記憶測(cè)驗(yàn)的記憶商數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)化智力測(cè)驗(yàn)的IQ在正常范圍；腦脊液或血漿和Tau蛋白含量正常；腦部CT無(wú)異常發(fā)現(xiàn)。（2）MCI組取樣60-100人，入組標(biāo)準(zhǔn)為：年齡在60-70歲之間；目前和過(guò)去無(wú)明顯精神和神經(jīng)系統(tǒng)疾?。挥兄饔^和客觀記憶減退的證據(jù)，日常生活和社會(huì)功能基本正常；標(biāo)準(zhǔn)化記憶測(cè)驗(yàn)成績(jī)低于健康成人1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，標(biāo)準(zhǔn)化智力測(cè)驗(yàn)的IQ在85以上，或MQ低于IQ 15分以上；腦脊液或血漿和Tau

26、蛋白含量異常；腦部CT無(wú)異常發(fā)現(xiàn)。（3）臨床早期AD組取樣30-50人，入組標(biāo)準(zhǔn)為：年齡在60-70歲之間；符合器質(zhì)性精神障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)；記憶和智力全面受損（標(biāo)準(zhǔn)化記憶測(cè)驗(yàn)的記憶商數(shù)在70以下、標(biāo)準(zhǔn)化智力測(cè)驗(yàn)的IQ在50-69之間；腦脊液或血漿和Tau蛋白含量異常；腦部CT證明有腦萎縮；排除其它軀體和腦部疾病及精神疾病所致智能損害或假性癡呆。研究方法（1）神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)：采用項(xiàng)目負(fù)責(zé)人編制的多維記憶評(píng)估量表和龔耀先教授修訂的韋氏成人智力量表對(duì)入組對(duì)象做個(gè)別測(cè)試，健康老年人和MCI組以后每年檢測(cè)一次，觀察動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。（2）腦脊液或血漿1-42和磷酸化Tau蛋白含量測(cè)定：采用雙抗體夾心式酶聯(lián)免疫吸

27、附法（ELISA）進(jìn)行定量測(cè)定。所有對(duì)象入組時(shí)都做檢測(cè)，健康老年人和MCI組以后每年檢測(cè)一次，觀察動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。（3）載脂蛋白等位基因（APOE-4）檢測(cè)：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)APOE基因型，所有對(duì)象入組時(shí)都做檢測(cè)。（4）神經(jīng)核醫(yī)學(xué)顯像：注射適量顯像劑后用SPECT/PET采集腦斷層影像，用腦斷層顯像和圖像重建技術(shù)顯示腦內(nèi)情況，用固定框取連續(xù)3層獲得各局部腦組織的放射性計(jì)數(shù)率，再求出各局部腦組織的放射性濃度。所有對(duì)象入組時(shí)都做檢測(cè)，研究過(guò)程MCI患者發(fā)展成AD癡呆時(shí)檢測(cè)確診，MCI組未出現(xiàn)癡呆者在研究的第三年再測(cè)一次?？尚行苑治觯?）MCI在老年人群中發(fā)生率高（20%-30%），有

28、可靠的被試來(lái)源，最近兩年我們完成了本地區(qū)精神疾病的流行病學(xué)調(diào)查（包括老年癡呆），掌握了本地區(qū)老年人的基本資料。（2）本研究所需的貴重儀器（SPECT）項(xiàng)目申請(qǐng)者或主要研究者所在單位已具備。（3）本項(xiàng)目采用的神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)取自項(xiàng)目負(fù)責(zé)人編制多維記憶評(píng)估量表，已建立了國(guó)內(nèi)常模，具有較高信度和效度，龔耀先教授修訂的韋氏成人智力量表在國(guó)內(nèi)已廣泛應(yīng)用，我們?cè)鴮?duì)老年人、老年癡呆、Parkinson病等進(jìn)行過(guò)一些研究，發(fā)現(xiàn)這些測(cè)驗(yàn)對(duì)老年癡呆具有較好的診斷和鑒別診斷價(jià)值。 （4）神經(jīng)核醫(yī)學(xué)分子顯像是本研究的關(guān)鍵技術(shù)，合作單位（江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所）已研制成功多種國(guó)內(nèi)外先進(jìn)的腦顯像劑(如腦血流灌注顯像劑99 mT

29、c-ECD、多巴胺D2受體顯像劑131I-epidepride、斑塊顯像劑131I-IMPY、代謝顯像劑18F-FDG等)。其下屬江原醫(yī)院有放射性藥品使用許可證(四類(lèi))和相應(yīng)的顯像設(shè)施、醫(yī)技人員，可保證本研究的按時(shí)高質(zhì)完成。（5）本研究涉及的相關(guān)技術(shù)，研究組成員都已掌握，并有多年的相關(guān)研究經(jīng)驗(yàn)。2研究工作的總體安排及進(jìn)度。研究期限：2006年6月-2009年6月，在2007年1月前完成準(zhǔn)備工作和文獻(xiàn)查閱，撰寫(xiě)綜述1-2篇。2007年1月-6月，完成所有研究對(duì)象入組工作和心理、班塊和多巴胺D2受體的活體顯像（SPECT）檢測(cè)工作，2007年7月-12月完成三組研究對(duì)象的生化指標(biāo)的檢測(cè)工作，并對(duì)第

30、一批數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，撰寫(xiě)論文1-2篇。2008年1月-12月，對(duì)健康老年人組和MCI組做一次隨訪(fǎng)，復(fù)測(cè)血漿和Tau蛋白、APOE-4檢測(cè)和神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)。2009年1月-6月，對(duì)健康老年人組和MCI組做第二次隨訪(fǎng)，再次檢查血漿和Tau蛋白、APOE-4檢測(cè)和神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)，復(fù)測(cè)SPECT?？偨Y(jié)資料，撰寫(xiě)論文2-3篇。登記序號(hào)： 項(xiàng)目編號(hào)：中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研項(xiàng)目課題設(shè)計(jì)書(shū)課題名稱(chēng)：痛痹顆粒對(duì)骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞凋亡和增殖的機(jī)理研究申報(bào)單位： 江蘇省中醫(yī)院課題負(fù)責(zé)人： 朱萱萱計(jì)劃年限：郵政編碼： 聯(lián)系電話(huà)： 30306申報(bào)日期：江蘇省中醫(yī)藥局制填寫(xiě)提綱一、立項(xiàng)依據(jù)：與選題直接相關(guān)的國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢(shì)

31、；選題的理論和實(shí)踐依據(jù)；研究目的、意義；本研究達(dá)到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用推廣前景。二、科研假說(shuō)或技術(shù)構(gòu)思，主要研究?jī)?nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)、目標(biāo)（達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)或技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)），技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開(kāi)發(fā)項(xiàng)目應(yīng)說(shuō)明開(kāi)發(fā)規(guī)模。三、研究試驗(yàn)方法及技術(shù)路線(xiàn)（工藝路線(xiàn)）。四、現(xiàn)有工作條件和基礎(chǔ)：開(kāi)展本項(xiàng)研究的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備及應(yīng)用合格實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本條件等；已有工作基礎(chǔ)，預(yù)試驗(yàn)情況。五、計(jì)劃進(jìn)度：根據(jù)總的研究期限、年度計(jì)劃進(jìn)度，分別列出具體的目標(biāo)和進(jìn)度的考核指標(biāo)。六、參加（協(xié)作）單位意見(jiàn)及具體分工（附協(xié)議書(shū)）。七、經(jīng)費(fèi)概算（包括其他部門(mén)的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據(jù)，以

32、及分年度使用計(jì)劃。填寫(xiě)說(shuō)明一、內(nèi)容填寫(xiě)自備附頁(yè)，用紙大小和封頁(yè)一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報(bào)要求上報(bào)。二、填寫(xiě)提綱所列內(nèi)容，要全面詳細(xì)、如實(shí)填寫(xiě)。三、封面上“登記序號(hào)”“項(xiàng)目編號(hào)”請(qǐng)勿填寫(xiě)。1、 立項(xiàng)依據(jù)1.1 研究目的、意義骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）又稱(chēng)退行性關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見(jiàn)于中年以后的慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾患。該病發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而升高，據(jù)調(diào)查，在美國(guó)目前2億多人口中，就有骨關(guān)節(jié)炎4500萬(wàn)，發(fā)病率占總?cè)丝诘?0%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，OA的患病率僅次于心血管疾病，位居第二

33、位。在我國(guó)，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，5564歲的人群中發(fā)病率達(dá)40%，而65歲以上人群的患病率達(dá)60%90%。隨著計(jì)劃生育政策的長(zhǎng)久實(shí)施及經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國(guó)已進(jìn)入老齡化社會(huì)，OA的發(fā)病率還將越來(lái)越高，這不僅嚴(yán)重危害人民的生活、健康，對(duì)社會(huì)也將造成很大負(fù)擔(dān)。同時(shí)世界其他國(guó)家也面臨著同樣的問(wèn)題，因而OA引起了國(guó)際、國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)界的相當(dāng)重視。近年來(lái)對(duì)OA的研究頗多，在發(fā)病機(jī)制、檢測(cè)手段以及治療方法上均取得較大進(jìn)步，但總的來(lái)說(shuō)還缺乏令人滿(mǎn)意的突破性進(jìn)展。西藥治療OA的主要手段是非甾體藥，但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點(diǎn)。雖然中藥治療OA也取得了一些經(jīng)驗(yàn)，但對(duì)其具體的作用機(jī)制有深入研究的卻很少，因此在

34、中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對(duì)療效確切的中藥復(fù)方進(jìn)行深入的機(jī)理研究，使中藥治療OA的療效在國(guó)際先進(jìn)行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。1.2 國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀水平和發(fā)展趨勢(shì)近十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)OA進(jìn)行了較深入地研究，大致歸納如下：1.2.1 流行病學(xué)研究已廣泛開(kāi)展在近100種不同類(lèi)型的關(guān)節(jié)疾病中，OA是影響人類(lèi)健康最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾患之一，沒(méi)有明顯的種族和地域差異，本病的患病率隨年齡增加而增高，故隨著人類(lèi)平均壽命的延長(zhǎng)，患病率也有增高的趨勢(shì)。Felson等報(bào)道70歲以下人群膝OA患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學(xué)膝OA

35、70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為43.7%。Butter等報(bào)道，44歲以下、4559歲、60歲以上人群中，放射血OA 患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國(guó)內(nèi)陳順樂(lè)等隊(duì)13541名鋼鐵工人的調(diào)查結(jié)果顯示，癥狀性O(shè)A患病率2.2%；無(wú)癥狀性O(shè)A患病率53%，其中3039、4049、5059歲患病率各為11%、27%和62%。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計(jì)551例，結(jié)果40歲以下、4049、5059和60歲以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同關(guān)節(jié)OA易感性不同。美國(guó)在衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)中心調(diào)查結(jié)果，OA患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國(guó)內(nèi)陳順樂(lè)

36、等調(diào)查結(jié)果OA是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖OA均以女性較多，且女性骨關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性較男性高。在Framingham的研究中，F(xiàn)elaon等發(fā)現(xiàn)女性體重減少11磅，骨關(guān)節(jié)炎形成的風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)減少50%。 Saase等調(diào)查結(jié)果，膝OA患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據(jù)1994年統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)，骨關(guān)節(jié)炎的消耗為155億美元，約為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我國(guó)雖未作全國(guó)大范圍的普查，但隨著老齡化社會(huì)進(jìn)程的不斷加快，OA的發(fā)病率會(huì)越來(lái)越高，這必將給家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。1.2.2 病因、發(fā)病機(jī)制有了巨大突破目前

37、基礎(chǔ)研究認(rèn)為軟骨的損傷與退變是OA的根本，隨著分子生物學(xué)免疫學(xué)的發(fā)展，近年來(lái)眾多學(xué)者對(duì)OA關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進(jìn)行了大量研究，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，又提出了許多學(xué)說(shuō)，如軟骨下骨內(nèi)高壓學(xué)說(shuō)：由于骨血液動(dòng)力學(xué)的改變，在骨髓腔容積不變的前提下增加內(nèi)容物引起壓力增高，即表現(xiàn)為骨內(nèi)壓力增高。骨內(nèi)高壓持續(xù)增高存在下關(guān)節(jié)滑液pH值下降，成分改變，干擾并破壞了軟骨細(xì)胞的正常代謝導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖分解，軟骨下骨破壞、修復(fù)，最終產(chǎn)生骨性關(guān)節(jié)炎。自由基學(xué)說(shuō)：認(rèn)為自由基對(duì)軟骨細(xì)胞DNA和PG的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細(xì)胞后，引發(fā)膜脂質(zhì)過(guò)氧化，使脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛增多

38、，丙二醛可與DNA發(fā)生交聯(lián)，自由基也可直接攻擊軟骨細(xì)胞DNA即合成DNA所需的酶，使DNA鏈斷裂、堿基損傷從而影響了DNA的合成，也造成前列腺（PG）合成障礙。骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，滑膜、滑液、血管翳內(nèi)常有中性白細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞浸潤(rùn)，其表面受免疫復(fù)合物、補(bǔ)體等作用能釋放大量O2-和H2O2；細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)：細(xì)胞因子對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子（TNF）等在OA中水平明顯增高。IL-1具有刺激軟骨細(xì)胞分泌一氧化氮、前列腺E和IL-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時(shí)IL-1也是軟骨基質(zhì)降解的主要驅(qū)動(dòng)因子；軟骨酶降解學(xué)說(shuō)：OA軟骨細(xì)胞的

39、基質(zhì)降解酶類(lèi)的合成與分泌率明顯增加，并與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。參與降解基質(zhì)大分子的降解酶類(lèi)可以增加達(dá)到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基質(zhì)金屬蛋白酶，尤其是基質(zhì)溶素和膠原酶，參與關(guān)節(jié)軟骨的降解過(guò)程，這些酶類(lèi)可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分，與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1和TNF的作用下，軟骨細(xì)胞以酶原的形式分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，而對(duì)金屬蛋白酶組織抑制劑無(wú)影響，使二者失衡從而增加對(duì)軟骨主要成分型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進(jìn)行性破壞；一氧化氮學(xué)說(shuō)：NO是一種細(xì)胞間信使分子，可介導(dǎo)許多生物學(xué)現(xiàn)象。N

40、OS可催化重要炎性介質(zhì)NO的產(chǎn)生，OA患者血清、滑液中NO含量明顯高于正常。NO可通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時(shí)使軟骨細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細(xì)胞合成軟骨基質(zhì)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞糖酵解，使軟骨破壞。細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進(jìn)與不足則會(huì)引起相關(guān)疾病，在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中軟骨細(xì)胞的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細(xì)胞數(shù)目與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。凋亡小體存在于軟骨細(xì)胞小孔或間隙內(nèi)，其產(chǎn)生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有NTPPH（nucleosid triphosphate pyrop

41、hos phohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細(xì)胞修復(fù)過(guò)程失敗，而逐漸發(fā)展成關(guān)節(jié)軟骨的完全丟失。OA軟骨細(xì)胞凋亡主要通過(guò)兩種相互獨(dú)立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無(wú)關(guān)的途徑,由NO介導(dǎo);另一種是同滑膜炎癥相關(guān)的途徑,由Fas介導(dǎo)。典型的OA不存在明顯的炎癥反應(yīng),此時(shí)軟骨細(xì)胞凋亡以NO途徑為主;當(dāng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時(shí),則通過(guò)as途徑加劇軟骨細(xì)胞凋亡和關(guān)節(jié)破壞。NO通過(guò)兩種方式造成組織及細(xì)胞損傷。一是高濃度的NO能抑制多種與線(xiàn)粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶,從而抑制線(xiàn)粒體呼吸,造成組織損傷;二是NO與超氧化陰離子2-反應(yīng),生成氧化亞硝基陰離子ONOO-,在酸性條件下(如病理?xiàng)l件)迅

42、速分解為OH-和NO2自由基,這兩種自由基具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,可造成組織細(xì)胞損傷。在OA患者中,受損區(qū)軟骨細(xì)胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū)。Fas表達(dá)的結(jié)果與其相符,OA受損區(qū)的Fas表達(dá)遠(yuǎn)高于未受損區(qū),提示Fas表達(dá)可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。除NO途徑和Fas途徑外,還有一些因素可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡、關(guān)節(jié)破壞,如IL-1、IL-8、TNF-、PGE2、Aggrecan G1區(qū)等。1.2.3 治療方面有了不少新方法目前中西醫(yī)治療OA的藥物較多，西藥治療OA主要有三大類(lèi)，第一類(lèi)為快作用藥，即非甾體藥，特點(diǎn)是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對(duì)胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，OA多為老年人，長(zhǎng)期服用此類(lèi)藥尤其不能耐

43、受，且部分藥物價(jià)格不菲，而且由于過(guò)分的鎮(zhèn)痛，導(dǎo)致病人失去警惕過(guò)分運(yùn)動(dòng)，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長(zhǎng)期療效來(lái)看反而不佳，最新觀點(diǎn)認(rèn)為乙酰氨基酚應(yīng)作為治療OA的首選藥，但尚有一定爭(zhēng)議，且同樣存在上述副作用；第二類(lèi)為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，價(jià)格昂貴，臨床上尚未廣泛運(yùn)用；第三類(lèi)為軟骨保護(hù)劑，尚未問(wèn)世。關(guān)節(jié)清理術(shù)、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，適應(yīng)癥較少，費(fèi)用高，創(chuàng)傷大，病人難以接受。中哦藥治療OA的研究取得了可喜的進(jìn)步，但中藥治療仍存在較多共性的問(wèn)題：多屬臨床經(jīng)驗(yàn)，無(wú)對(duì)照組，特別是西藥對(duì)照組觀察，處方不固定。缺乏用客觀的最新的國(guó)際公認(rèn)的、量化的臨床觀察指標(biāo)及療效判斷標(biāo)準(zhǔn)為手段來(lái)尋找治療OA的中藥。未針對(duì)OA發(fā)

44、病機(jī)制進(jìn)行臨床及動(dòng)物試驗(yàn)從生化、免疫、病理、細(xì)胞分子水平來(lái)探討中藥的藥物作用機(jī)理。缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫(yī)認(rèn)為OA屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認(rèn)為其病因與年老體衰、長(zhǎng)期勞損、外感風(fēng)寒濕邪有關(guān)，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)為OA的發(fā)病基礎(chǔ)，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產(chǎn)物。周尊謙等人在傳統(tǒng)中醫(yī)理論基礎(chǔ)上，闡述了膝OA骨內(nèi)高壓血瘀證氧自由基之間的密切關(guān)系；謝林等論述了膝OA與血瘀證之間的內(nèi)在聯(lián)系，旨在為運(yùn)用活血化淤藥治療OA提供理論依據(jù)。治療方面從古到今絕大部分醫(yī)家皆針對(duì)其病因病機(jī)采用益肝腎、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)氣血治其本；散寒通絡(luò)、化痰勝濕治其標(biāo)。獨(dú)活寄生湯是用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)

45、疼痛和腦血管后遺癥的傳統(tǒng)固防，具有補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)之功，臨床常見(jiàn)本方加減治療OA，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關(guān)節(jié)炎24例，有效率為87.5%。陸智報(bào)道用本方加減治療104例，總有效率91.3%。1.2.4 實(shí)驗(yàn)研究方面有了較大的進(jìn)展隨著對(duì)OA發(fā)病機(jī)理的不斷深入認(rèn)識(shí)，對(duì)OA的實(shí)驗(yàn)研究方面也開(kāi)始了向多層次多角度的方向發(fā)展。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗(yàn)，現(xiàn)已使用針對(duì)OA的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并采用相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。目前實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容主要有以下幾個(gè)方面，研究最多的是OA的血液流變學(xué)、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗(yàn)一般均可通過(guò)建立

46、骨關(guān)節(jié)炎的模型來(lái)完成，也可通過(guò)使用其它相似的模型檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)來(lái)進(jìn)行，如可建立急性血淤模型來(lái)檢查血液流變學(xué)指標(biāo)，使用老齡動(dòng)物通過(guò)檢測(cè)體內(nèi)SOD及MDA含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在NO對(duì)OA影響的實(shí)驗(yàn)中，一般采用硝酸還原酶法來(lái)測(cè)定NO含量，運(yùn)用PT-PCR技術(shù)測(cè)定NOS基因表達(dá)。IL-1、IL-6、TNF等細(xì)胞因子、軟骨降解酶尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶、誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎癥的物質(zhì)如纖溶酶原/纖溶酶原激活物和前列腺素PGE2、軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及增殖情況、性激素水平等也越來(lái)越多地被作為檢測(cè)指標(biāo)使用到實(shí)驗(yàn)研究中來(lái)。1.3 選題的理論和實(shí)踐依據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)并無(wú)骨關(guān)節(jié)炎的病名，從歷代文獻(xiàn)來(lái)看本病應(yīng)歸屬于“骨痹”

47、、“痛痹”范疇。我們認(rèn)為OA病人除了肝腎虧虛，寒濕痹阻外，一般OA病人體重超重較多，也即為痰濕偏盛之體，另外脾虛生濕及寒濕痹阻日久濕聚成痰，痰淤交阻是引起膝關(guān)節(jié)腫脹畸形、活動(dòng)受限的重要因素，所謂頑癥怪病皆質(zhì)之于痰淤?；诂F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)OA發(fā)病機(jī)理的深入研究，我們?cè)谘a(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥對(duì)緩解軟骨降解，增加軟骨細(xì)胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于1995年即對(duì)備急千金要方中的獨(dú)活寄生湯進(jìn)行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總結(jié)制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于1999年采用痛痹顆粒的組方治療膝OA，方中以獨(dú)活為君藥，以祛下焦與筋骨間風(fēng)寒濕邪；威靈仙舒筋通絡(luò)止痹痛；

48、淫羊藿、懷牛膝補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，通經(jīng)絡(luò)，其中懷牛膝為引經(jīng)藥；當(dāng)歸養(yǎng)血柔肝、舒筋活血；川芎則通達(dá)四肢關(guān)節(jié)，為血中氣藥；虎杖活血清熱解毒，同時(shí)防諸藥辛燥太過(guò)。諸藥合用共起補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保護(hù)軟骨。通過(guò)36例的臨床研究、觀察，結(jié)果表明本方療效顯著且副作用小。因此有必要對(duì)痛痹顆粒治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制尤其是該方對(duì)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡與增殖機(jī)理做進(jìn)一步的研究，冀能證實(shí)痛痹顆粒的臨床療效，明確其作用機(jī)制，并初步探討本病發(fā)病的可能機(jī)理，為新藥問(wèn)世提供客觀的依據(jù)，所以進(jìn)行設(shè)計(jì)并立題。1.4本研究達(dá)到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會(huì)效益和應(yīng)用推廣前景1.4.1繼承和發(fā)揚(yáng)祖國(guó)醫(yī)學(xué)，保持中醫(yī)特色，以

49、臨床療效為前提，以實(shí)驗(yàn)研究為基礎(chǔ)，制造規(guī)范化大鼠的膝OA模型，從發(fā)病機(jī)理探討本藥的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用可靠地國(guó)際公認(rèn)的方法復(fù)制動(dòng)物模型，并采用最新的檢測(cè)指標(biāo)IL-1、TNF、SOD、MDA、NO等，總之本研究基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)OA發(fā)病機(jī)制的最新研究成果，從生化、免疫等多個(gè)角度多個(gè)層次，系統(tǒng)觀察并進(jìn)行歸納總結(jié)，確保本課題不但可行而且先進(jìn)，冀能填補(bǔ)省內(nèi)外運(yùn)用中藥治療OA的空白，并希望以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步從細(xì)胞水平（包括本藥對(duì)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞凋亡與增殖的影響）研究中藥對(duì)OA的長(zhǎng)久作用及影響，從而達(dá)到擠身國(guó)際先進(jìn)水平的目的，讓中藥真正走向世界。1.4.2目前，中藥治療OA的方法頗多，但大多以臨床療效研究為主，

50、大樣本、規(guī)范化的研究很少，中醫(yī)中藥治療機(jī)理的研究，雖有涉及，但大多分散且存在一定的重復(fù)性，理想的治療藥物尚未問(wèn)世，具有公認(rèn)療效的小兒遷延性腹瀉臨床治療方案尚未確立，其療效評(píng)價(jià)體系尚需研究確定，尤其是缺少中醫(yī)藥治療學(xué)整體研究思路與方法，使中藥復(fù)方治療OA的療效機(jī)理尚未能全面揭示，影響了該領(lǐng)域研究的深入。而痛痹顆粒是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下選用千金要方中獨(dú)活寄生湯進(jìn)行加減所得，并采用可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图白钚碌膰?guó)際公認(rèn)的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，觀察其對(duì)OA的確切療效及作用機(jī)理，這必將對(duì)OA的中醫(yī)理論產(chǎn)生較大影響，同時(shí)對(duì)臨床治療也起到更好的指導(dǎo)作用，從而產(chǎn)生較好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。隨著改革開(kāi)放的形勢(shì)發(fā)展，以及中國(guó)加入W

51、TO與國(guó)際接軌的進(jìn)程的不斷完善，祖國(guó)醫(yī)學(xué)國(guó)際地位不斷的提高，我們將從祖國(guó)醫(yī)學(xué)寶庫(kù)中發(fā)掘出的治療OA的高效藥物與現(xiàn)代新技術(shù)、新方法進(jìn)行研究總結(jié)，從而為人類(lèi)造福，為振興中醫(yī)事業(yè)做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。2.科研假說(shuō)或技術(shù)構(gòu)想：主要內(nèi)容、技術(shù)關(guān)鍵目的，技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開(kāi)發(fā)項(xiàng)目應(yīng)說(shuō)明開(kāi)發(fā)規(guī)模。2.1主要內(nèi)容2.1.1探討OA的病因病機(jī)，提出新見(jiàn)解，發(fā)展中醫(yī)理論。2.1.2運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究，從分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生理生化學(xué)等多方面來(lái)探討“痛痹顆?！敝委熛A的療效機(jī)制及藥理毒理作用。2.2主要技術(shù)關(guān)鍵2.2.1膝OA模型的復(fù)制目前所使用的OA動(dòng)物模型一般可分為兩大類(lèi)，其一是誘發(fā)模型，即通過(guò)各種操

52、作方法如制動(dòng)、手術(shù)、關(guān)節(jié)內(nèi)注藥、關(guān)節(jié)內(nèi)植入軟骨碎片或微粒等誘導(dǎo)OA產(chǎn)生；另一類(lèi)為自發(fā)模型，即不用任何外界干預(yù)，動(dòng)物自發(fā)OA，如C57黑鼠等。在選擇動(dòng)物模型時(shí)一般應(yīng)考慮動(dòng)物的種屬（包括其生活習(xí)性、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)、組織學(xué)及病理學(xué)特征）、不同方法的造模機(jī)制和OA模型的特點(diǎn)，并應(yīng)參照研究目的加以選擇。在誘發(fā)模型中，常用的方法是手術(shù)造成關(guān)節(jié)的應(yīng)力改變及關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入木瓜蛋白酶， 這兩種方法都能復(fù)制出較成功較高的OA模型，且操作較為簡(jiǎn)單。具體的造模機(jī)制在于低應(yīng)力可以造成軟骨厚度減少，SO染色變淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度損傷等變化，木瓜蛋白酶作為一種蛋白水解酶會(huì)引起關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變。在具體的造模過(guò)程中我們選用

53、以上兩種方法來(lái)分別復(fù)制動(dòng)物模型。用于動(dòng)物模型的動(dòng)物一般有狗、兔、鼠等，我們選用大鼠做OA模型，因?yàn)樵撃Ｐ完P(guān)節(jié)軟骨退變的組織學(xué)特征與人類(lèi)相似，且動(dòng)物來(lái)源較廣泛，且經(jīng)濟(jì)。2.2.2關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)基于來(lái)源廣泛，操作可行的原則，目前用于體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞一般均為兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)所得。軟骨需在嚴(yán)格無(wú)菌的條件下分離，經(jīng)過(guò)一系列的漂洗、消化等工作后獲取軟骨細(xì)胞。目前還沒(méi)有專(zhuān)門(mén)用于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液，國(guó)外采用的培養(yǎng)液種類(lèi)繁多，有199、1640、F12、改良Eagle等，國(guó)內(nèi)的有199、1640、DMEM（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用DMEM培養(yǎng)液居多。在培養(yǎng)液中還含有一些輔助添加劑，包括25mmol/L Hepes、1mmol/L 丙酮酸鈉、2mmol/L 谷氨酰胺、50umol/L 二硫基乙醇以及10萬(wàn)單位/L的青霉素和10萬(wàn)單位/L的鏈霉素，P