實(shí)驗(yàn)二植物基因組DNA的分離純化及RAPD擴(kuò)增ppt課件

1、1、植物基因組、植物基因組DNA的分別純化的分別純化一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理 核酸包括核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的形狀存在。真核生物的染色體結(jié)合的形狀存在。真核生物的染色體DNA是雙鏈線性分子，是雙鏈線性分子，原核生物的原核生物的“染色體、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器染色體、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子，有些噬菌體為雙鏈環(huán)狀分子，有些噬菌體DNA有時(shí)為單鏈環(huán)狀分子。有時(shí)為單鏈環(huán)狀分子。95%的真核生物的真核生物DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，其它主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，其它5%為細(xì)胞器為細(xì)胞器DNA，如線粒體、葉綠，如線粒體、葉綠體等。體等。

2、從細(xì)胞中分別得到的從細(xì)胞中分別得到的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA，其中還，其中還含有大量含有大量RNA，即核，即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開(kāi)是技術(shù)的關(guān)鍵。糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開(kāi)是技術(shù)的關(guān)鍵。 鹽溶法是提取鹽溶法是提取DNA的常規(guī)技術(shù)之一。在制備核酸時(shí)，通常的常規(guī)技術(shù)之一。在制備核酸時(shí)，通常是用研磨破壞細(xì)胞壁和是用研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來(lái)。利用細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來(lái)。利用DNA不溶于不溶于0.14mol/L 的的NaCl溶液而溶液而RNA能溶能溶于于0.14mol/L 的的NaCl溶液這一性質(zhì)可以將溶液這一性質(zhì)可以將DNA核蛋白和

3、核蛋白和RNA核核蛋白從樣品破碎細(xì)胞蛋白從樣品破碎細(xì)胞液中分開(kāi)。液中分開(kāi)。 分別得到核蛋白后，還需進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去。分別得到核蛋白后，還需進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去。去除蛋白的方法有去除蛋白的方法有3種：種： 用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化，然后離心除其乳化，然后離心除去變性蛋白質(zhì)。用這種方法處置時(shí)，蛋白質(zhì)停留在水去變性蛋白質(zhì)。用這種方法處置時(shí)，蛋白質(zhì)停留在水相和氯仿相中間，而相和氯仿相中間，而DNA那么溶于上層水相，用兩倍體積那么溶于上層水相，用兩倍體積95%乙醇溶液可乙醇溶液可將將DNA鈉鹽沉淀出來(lái)。鈉鹽沉淀出來(lái)。 用用十二烷基硫酸

4、鈉十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白量變性，從而使等去污劑使蛋白量變性，從而使其與核酸分別，也可其與核酸分別，也可從資料中直接提取出從資料中直接提取出DNA。 用苯酚處置，然后離心用苯酚處置，然后離心分層，一樣可以將分層，一樣可以將DNA與蛋白質(zhì)別分開(kāi)來(lái)。這時(shí)與蛋白質(zhì)別分開(kāi)來(lái)。這時(shí)DNA溶于上層水相，蛋白變?nèi)苡谏蠈铀啵鞍鬃冃院竽敲赐Ａ粼诜訉觾?nèi)，性后那么停留在酚層內(nèi)，吸出上層水相，參與兩倍體積的吸出上層水相，參與兩倍體積的95%乙醇即可得到白乙醇即可得到白色纖維狀色纖維狀DNA沉淀。反復(fù)沉淀。反復(fù)運(yùn)用上述方法多次處置運(yùn)用上述方法多次處置DNA核蛋白溶液，就能將蛋白核蛋白溶液，就能將蛋白等

5、雜質(zhì)較徹底地除去，等雜質(zhì)較徹底地除去，得到較純的得到較純的DNA制品。本實(shí)驗(yàn)采用制品。本實(shí)驗(yàn)采用CTAB法從植物幼苗法從植物幼苗中提取基因組中提取基因組DNA。 為了徹底除去為了徹底除去DNA制品中混雜的制品中混雜的RNA雜質(zhì)，可用雜質(zhì)，可用RNA酶進(jìn)展處置。另外，酶進(jìn)展處置。另外，生物資料中還含有大量的脂肪物質(zhì)和多糖，這些物質(zhì)生物資料中還含有大量的脂肪物質(zhì)和多糖，這些物質(zhì)在用鹽溶液分別核蛋白在用鹽溶液分別核蛋白和用乙醇或異丙醇分級(jí)沉淀時(shí)即可被除去。和用乙醇或異丙醇分級(jí)沉淀時(shí)即可被除去。 核酸純化目的：純化后的核酸樣品中不應(yīng)該核酸純化目的：純化后的核酸樣品中不應(yīng)該存在對(duì)酶有抑存在對(duì)酶有抑制造用

6、的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的重金屬離子；其制造用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的重金屬離子；其它生物大分子物它生物大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖和脂類(lèi)分子的污染應(yīng)降到最低質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖和脂類(lèi)分子的污染應(yīng)降到最低程度；排除程度；排除RNARNA分子污染。分子污染。 操作本卷須知：盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提操作本卷須知：盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程減少各種取過(guò)程減少各種有害要素對(duì)核酸的破壞；減少化學(xué)要素對(duì)核酸的有害要素對(duì)核酸的破壞；減少化學(xué)要素對(duì)核酸的降解，普通降解，普通pH4-pH4-1010；減少物理要素如機(jī)械切力、高溫對(duì)核酸的降；減少物理要素如機(jī)械切力、高溫對(duì)核酸的降解。解。 提取步驟：破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合

7、的蛋提取步驟：破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)、多糖和脂白質(zhì)、多糖和脂類(lèi)分子，去除類(lèi)分子，去除RNARNA，去除鹽類(lèi)、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)。，去除鹽類(lèi)、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)。方案：視詳細(xì)方案：視詳細(xì)的生物資料和待提取的核酸分子特點(diǎn)而定。的生物資料和待提取的核酸分子特點(diǎn)而定。二、儀器設(shè)備二、儀器設(shè)備 高速離心機(jī)、水浴鍋、電子天平、冰箱高速離心機(jī)、水浴鍋、電子天平、冰箱三、資料及試劑三、資料及試劑1. 1. 資料：水稻幼苗資料：水稻幼苗2. 2. 試劑：試劑： 2 2CTABCTAB提取液提取液( (內(nèi)含內(nèi)含2%CTAB2%CTAB、1.4mol/L NaCl1.4mol/L NaCl、25mmol/L ED

8、TA25mmol/L EDTA、0.2%0.2%- -巰巰基乙醇和基乙醇和0.1mol/LTris-HCl0.1mol/LTris-HCl，pH8.0)pH8.0)：?。喝?g CTAB2g CTAB、8.18g NaCl8.18g NaCl、0.74g 0.74g EDTA-Na2.2H2OEDTA-Na2.2H2O，參與，參與10ml 1mol/L10ml 1mol/L的的Tris-HCl(pH8.0)Tris-HCl(pH8.0)和和0.2ml0.2ml- -巰基乙醇，巰基乙醇，加雙蒸水加雙蒸水(ddH2O)(ddH2O)定容到定容到100ml100ml； 氯仿氯仿: :異戊醇異戊醇(2

9、4:1) (24:1) 洗滌緩沖液洗滌緩沖液(70%(70%乙醇，內(nèi)含乙醇，內(nèi)含10mmol/L10mmol/L乙酸銨乙酸銨) )：?。喝?0mL70mL無(wú)水乙醇和無(wú)水乙醇和0.077g0.077g乙酸銨，加雙蒸水定容到乙酸銨，加雙蒸水定容到100ml100ml； 無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醇、70%70%乙醇；乙醇； TE TE緩沖液：內(nèi)含緩沖液：內(nèi)含10 mmol/L Tris-HCl10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L 1 mmol/L EDTAEDTA，pH8.0pH8.0四、操作步驟四、操作步驟 取水稻幼苗，液氮研磨成粉，迅速分裝于取水稻幼苗，液氮研磨成粉，迅速分裝于Eppe

10、ndorf 管管中，參與中，參與0.7ml 60水浴中預(yù)熱的水浴中預(yù)熱的2CTAB提取液和提取液和20 l -巰基乙醇，悄然轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻；巰基乙醇，悄然轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻；樣品于樣品于60溫浴溫浴45min，每，每5min將將Eppendorf管管上下顛倒上下顛倒混勻；混勻；參與等體積氯仿參與等體積氯仿:異戊醇異戊醇(24:1)，悄然顛倒混勻，悄然顛倒混勻，室溫下室溫下放置放置5min，6000g離心離心10min。 上層溶液轉(zhuǎn)入另一個(gè)干凈上層溶液轉(zhuǎn)入另一個(gè)干凈Eppendorf 管中，參與管中，參與等體積等體積的氯仿的氯仿:異戊醇異戊醇(24:1)，混勻，混勻，000g轉(zhuǎn)離心轉(zhuǎn)離心5min；反復(fù)步

11、驟反復(fù)步驟 2-3次，直至無(wú)白色界面物質(zhì)次，直至無(wú)白色界面物質(zhì) ；將上層水相吸入另一干凈的離心管中，參與將上層水相吸入另一干凈的離心管中，參與2/3體積的預(yù)體積的預(yù)冷異丙醇，悄然混勻使核酸沉淀下來(lái)。在冷異丙醇，悄然混勻使核酸沉淀下來(lái)。在-20下放置下放置30min，4、10000g轉(zhuǎn)離心轉(zhuǎn)離心10min，棄上清液；，棄上清液；沉淀用參與沉淀用參與1ml洗滌緩沖液，洗滌緩沖液，10000g離心離心1-2min； 沉淀用無(wú)水乙醇洗沉淀用無(wú)水乙醇洗1次，次， 10000g離心離心1-2min；沉淀置于空氣中沉淀置于空氣中3-5min，晾干后參與，晾干后參與15-20 l無(wú)菌水溶無(wú)菌水溶解；解；DNA

12、含量測(cè)定及電泳檢測(cè)，瓊脂糖濃度為含量測(cè)定及電泳檢測(cè)，瓊脂糖濃度為0.8%。 取取2-5lDNA溶液稀釋至溶液稀釋至100l，于紫外核酸蛋白檢測(cè)儀，于紫外核酸蛋白檢測(cè)儀上上測(cè)定測(cè)定A260、A280和和A320的的OD值，并計(jì)算值，并計(jì)算DNA濃度和得率。濃度和得率。 注：核酸及其衍生物的紫外吸收頂峰在注：核酸及其衍生物的紫外吸收頂峰在260nm，在波長(zhǎng)，在波長(zhǎng)260nm紫外線下，紫外線下，1g/mL的的DNA溶液溶液A260=0.020，1個(gè)個(gè)OD值的光值的光密度相當(dāng)于雙鏈密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為濃度為50g/ml，單鏈，單鏈DNA或或RNA為為40g /ml，單鏈寡核苷酸為，單鏈寡核苷酸為

13、20g/ml。純的。純的DNA的的A260/A280在在1.8左左右。右。一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理 傳統(tǒng)的種子純度鑒定主要有田間鑒定法和實(shí)驗(yàn)室鑒定法。傳統(tǒng)的種子純度鑒定主要有田間鑒定法和實(shí)驗(yàn)室鑒定法。實(shí)驗(yàn)室鑒定種子純度主要根據(jù)種子的物理、化學(xué)及生理特性實(shí)驗(yàn)室鑒定種子純度主要根據(jù)種子的物理、化學(xué)及生理特性等。但隨著生物化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的迅速開(kāi)展，種子純度等。但隨著生物化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的迅速開(kāi)展，種子純度鑒定技術(shù)產(chǎn)生了質(zhì)的飛躍，現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)被鑒定技術(shù)產(chǎn)生了質(zhì)的飛躍，現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)被勝利地引入到種子純度的鑒定中，如蛋白質(zhì)電泳和分子標(biāo)志勝利地引入到種子純度的鑒定中

14、，如蛋白質(zhì)電泳和分子標(biāo)志等。等。 分子標(biāo)志是指以生物大分子的多態(tài)性為根底的遺傳標(biāo)志。廣分子標(biāo)志是指以生物大分子的多態(tài)性為根底的遺傳標(biāo)志。廣義的分子標(biāo)志包括同工酶標(biāo)志和義的分子標(biāo)志包括同工酶標(biāo)志和DNA標(biāo)志，狹義的分子標(biāo)志僅標(biāo)志，狹義的分子標(biāo)志僅指指DNA標(biāo)志。標(biāo)志。DNA標(biāo)志主要有：標(biāo)志主要有：1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism 即限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性即限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性)。它是由于。它是由于核核酸序列不同而呵斥的酸序列不同而呵斥的DNA限制性片斷之間產(chǎn)生等位基因差別的限制性片斷之間產(chǎn)生等位基因差別的結(jié)結(jié)果。果。 2. RAPD

15、 (Random Amplified Polymorphic DNA2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)DNA)。3. 3. AFLP (Amplified Fragment Length PolymorphismAFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度多態(tài)，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度多態(tài)性性) )。4.SAP(Specific Amplified Polymorphism, 4.SAP(Specific Amplified Polymorphism, 特異

16、性擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)特異性擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性性) )。5. 5. 微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNA (Microsatellite Repeats) DNA (Microsatellite Repeats) 也稱(chēng)為簡(jiǎn)單串聯(lián)反復(fù)序列也稱(chēng)為簡(jiǎn)單串聯(lián)反復(fù)序列 (Simple Sequence Repeat(Simple Sequence Repeat簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)SSR)SSR)。6.6.小衛(wèi)星小衛(wèi)星DNA(MinisaTel-lte DNA)DNA(MinisaTel-lte DNA)也也稱(chēng)為數(shù)目可變串聯(lián)反復(fù)序列稱(chēng)為數(shù)目可變串聯(lián)反復(fù)序列(Variable Numbe of Tandem Repeat(Variable Numb

17、e of Tandem Repeat簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)VNYR)VNYR)。 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNARAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)DNA)是是19901990年由美國(guó)科學(xué)家年由美國(guó)科學(xué)家J.G.K.WilliamsJ.G.K.Williams和加利福尼亞生物研討所和加利福尼亞生物研討所J.WelshJ.Welsh指點(diǎn)指點(diǎn)的兩個(gè)小組幾乎同時(shí)開(kāi)展起來(lái)的一種的兩個(gè)小組幾乎同時(shí)開(kāi)展起來(lái)的一種DNADNA指紋技術(shù)，它是以指紋技術(shù)，它是以DNADNA為模板，以為模板，以一一個(gè)隨

18、機(jī)的寡聚核苷酸序列個(gè)隨機(jī)的寡聚核苷酸序列(10(10個(gè)堿基個(gè)堿基) )為引物，經(jīng)過(guò)為引物，經(jīng)過(guò)PCRPCR擴(kuò)增，產(chǎn)生分子量大擴(kuò)增，產(chǎn)生分子量大小不延續(xù)的小不延續(xù)的DNADNA片段，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)片段，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)DNADNA多態(tài)性。多態(tài)性。 DNA DNA多態(tài)性是指多態(tài)性是指DNADNA堿基順序的差別性。這種差別堿基順序的差別性。這種差別性不僅存性不僅存在于不同的植物之間，也存在于同一種植物的不同個(gè)在于不同的植物之間，也存在于同一種植物的不同個(gè)體之間。體之間。由于堿基順序的差別，在不同的種或同一個(gè)種的不同由于堿基順序的差別，在不同的種或同一個(gè)種的不同個(gè)體之個(gè)體之間，它們的

19、基因組間，它們的基因組DNADNA限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的種類(lèi)和數(shù)目限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的種類(lèi)和數(shù)目不同，用不同，用各自各自DNADNA為模板，以一個(gè)隨機(jī)的寡聚核苷酸序列為模板，以一個(gè)隨機(jī)的寡聚核苷酸序列(10(10個(gè)個(gè)堿基堿基) )為引為引物，經(jīng)過(guò)物，經(jīng)過(guò)PCRPCR擴(kuò)增，產(chǎn)生分子量大小不延續(xù)的擴(kuò)增，產(chǎn)生分子量大小不延續(xù)的DNADNA片段，片段，經(jīng)過(guò)瓊經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分別和溴化乙錠染色，在紫外檢測(cè)儀下脂糖凝膠電泳分別和溴化乙錠染色，在紫外檢測(cè)儀下察看，即察看，即可直接看到這種差別，這就是可直接看到這種差別，這就是RAPDRAPD用用于雜交水稻種用用于雜交水稻種子純度鑒子純度鑒定的任務(wù)原理。定的任務(wù)原

20、理。 PCR( PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒错懢酆厦告準(zhǔn)椒错? )，即經(jīng)過(guò)引物延伸核酸的某，即經(jīng)過(guò)引物延伸核酸的某個(gè)區(qū)域而個(gè)區(qū)域而進(jìn)展的反復(fù)雙向進(jìn)展的反復(fù)雙向DNADNA合成。合成。PCRPCR循環(huán)過(guò)程有三種不同的循環(huán)過(guò)程有三種不同的事件發(fā)事件發(fā)生：生：1. 1. 模板變性模板變性92-9692-96；2. 2. 引物退火引物退火37-37-6565；3. 3. 熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶進(jìn)展聚合酶進(jìn)展DNADNA合成合成-延伸延伸7272。94，模板變性，模板變性基因組基因組DNADNA單鏈單鏈DNADNA引物退火引物退火引物與模板靶序列互補(bǔ)雜交引物與模板靶序列互補(bǔ)雜交一段與模板一段與模板DNA

21、DNA互補(bǔ)互補(bǔ)的新鏈的新鏈第二個(gè)循環(huán)結(jié)果第二個(gè)循環(huán)結(jié)果 變性、退火、延伸的循環(huán)過(guò)程變性、退火、延伸的循環(huán)過(guò)程-PCR-PCR擴(kuò)增。在第二個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。在第二個(gè)循環(huán)中，新鏈作為模板參與反響，每完成一個(gè)循環(huán)將使目的中，新鏈作為模板參與反響，每完成一個(gè)循環(huán)將使目的DNADNA擴(kuò)增擴(kuò)增一倍，一倍，25-3525-35個(gè)循環(huán)后，目的個(gè)循環(huán)后，目的DNADNA將到達(dá)將到達(dá)106106倍。瓊脂糖電泳、倍。瓊脂糖電泳、EBEB染色即可得到染色即可得到DNADNA指紋圖譜。指紋圖譜。 PCR PCR反響體系反響體系(25(25l)l)：1010PCR buffer 2.5PCR buffer 2.5l ldNTP

22、 (10mmol/L) 0.5dNTP (10mmol/L) 0.5l l引物引物(15ng) 1.0(15ng) 1.0l lTaq Taq 酶酶 0.5 0.5l l模板模板DNA(DNA(純純DNA15ngDNA15ng，提取，提取DNA100ng) 100ngDNA100ng) 100ngddH2O XddH2O Xl l 反響程序：反響程序： 945min (9430s 361min 945min (9430s 361min 721min) 721min) 725min 4 725min 4保管保管35cycles35cycles一、核酸定量一、核酸定量 在波長(zhǎng)在波長(zhǎng)260nm260

23、nm紫外線下，紫外線下，1OD1OD值的光密度相當(dāng)于雙鏈值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNADNA濃度為濃度為5050g g /ml/ml；單鏈；單鏈DNADNA或或RNARNA為為4040g/mlg/ml；單鏈寡核苷酸為；單鏈寡核苷酸為2020g/mlg/ml。二、分子標(biāo)志種類(lèi)二、分子標(biāo)志種類(lèi)RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism 即限制性片斷即限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性長(zhǎng)度多態(tài)性) )。它是由于核酸序列不同而呵斥的。它是由于核酸序列不同而呵斥的DNADNA限制

24、性片斷之間產(chǎn)生等限制性片斷之間產(chǎn)生等位基因差別的結(jié)果。要檢測(cè)到位基因差別的結(jié)果。要檢測(cè)到RFLPRFLP，在提取核，在提取核DNADNA后用限制性?xún)?nèi)切酶酶后用限制性?xún)?nèi)切酶酶解，酶解后的片斷經(jīng)過(guò)電泳依大小而分開(kāi)，將這些片斷在變性后轉(zhuǎn)移到固解，酶解后的片斷經(jīng)過(guò)電泳依大小而分開(kāi)，將這些片斷在變性后轉(zhuǎn)移到固體支持物如尼龍膜上，然后再器具有放射性標(biāo)志的體支持物如尼龍膜上，然后再器具有放射性標(biāo)志的DNADNA探針進(jìn)展雜交，放探針進(jìn)展雜交，放射性自顯影后得到射性自顯影后得到RFLPRFLP條帶。在察看到一個(gè)條帶。在察看到一個(gè)RFLPRFLP時(shí)，可用檢測(cè)出該時(shí)，可用檢測(cè)出該RFLPRFLP的的探針探針酶的組合

25、追蹤該酶的組合追蹤該RFLPRFLP位點(diǎn)在作圖群體中的遺傳情況。位點(diǎn)在作圖群體中的遺傳情況。RFLPRFLP標(biāo)志的優(yōu)標(biāo)志的優(yōu)點(diǎn)在于它的標(biāo)志數(shù)量較大點(diǎn)在于它的標(biāo)志數(shù)量較大, ,實(shí)際上可以布滿(mǎn)整個(gè)基因組；實(shí)際上可以布滿(mǎn)整個(gè)基因組；其次，它的標(biāo)志呈共顯性，可以區(qū)別純合基因型和雜合基因型，并且標(biāo)志其次，它的標(biāo)志呈共顯性，可以區(qū)別純合基因型和雜合基因型，并且標(biāo)志遵照孟德?tīng)栠z傳規(guī)律；另外，遵照孟德?tīng)栠z傳規(guī)律；另外，RFLPRFLP標(biāo)志可靠性強(qiáng)，不受顯隱性關(guān)系、基因標(biāo)志可靠性強(qiáng)，不受顯隱性關(guān)系、基因互作、下位效應(yīng)、發(fā)育階段、環(huán)境條件以及基因能否表達(dá)的影響。但由于互作、下位效應(yīng)、發(fā)育階段、環(huán)境條件以及基因能否

26、表達(dá)的影響。但由于標(biāo)志技術(shù)復(fù)雜、操作繁瑣、任務(wù)量大、具有放射性的危害，標(biāo)志技術(shù)復(fù)雜、操作繁瑣、任務(wù)量大、具有放射性的危害，DNADNA用用量較大量較大(5(51010) )、純度要求較高、純度要求較高, ,因此限制了它在實(shí)踐中的廣泛運(yùn)用。因此限制了它在實(shí)踐中的廣泛運(yùn)用。利用標(biāo)志利用標(biāo)志, ,可以構(gòu)建連鎖圖譜可以構(gòu)建連鎖圖譜, ,從而可以進(jìn)展區(qū)間定位從而可以進(jìn)展區(qū)間定位, ,可以可以進(jìn)展標(biāo)志輔助挑選，可以對(duì)主效基因進(jìn)展定位和克隆。進(jìn)展標(biāo)志輔助挑選，可以對(duì)主效基因進(jìn)展定位和克隆。2. RAPD (Random 2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, A

27、mplified Polymorphic DNA, 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)DNA)。它是。它是19901990年由美國(guó)科年由美國(guó)科學(xué)家學(xué)家J.G.K.WilliamsJ.G.K.Williams和加利福尼亞生物研討所和加利福尼亞生物研討所J.WelshJ.Welsh指點(diǎn)的兩個(gè)小組幾乎指點(diǎn)的兩個(gè)小組幾乎同時(shí)開(kāi)展起來(lái)的一種同時(shí)開(kāi)展起來(lái)的一種DNADNA指紋技術(shù)，它是以指紋技術(shù)，它是以DNADNA為模板，以一個(gè)隨機(jī)的寡聚為模板，以一個(gè)隨機(jī)的寡聚核苷酸序列核苷酸序列(10(10個(gè)堿基個(gè)堿基) )為引物，經(jīng)過(guò)為引物，經(jīng)過(guò)PCRPCR擴(kuò)增，產(chǎn)生分子量大小不延續(xù)的擴(kuò)增，產(chǎn)生分子量大小不延續(xù)的D

28、NADNA片段，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)片段，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)DNADNA多態(tài)性。普通講多態(tài)性。普通講, ,經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)PCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)擴(kuò)增產(chǎn)生的不延續(xù)的幾個(gè)生的不延續(xù)的幾個(gè)DNADNA產(chǎn)物產(chǎn)物, ,往往是由于不同的遺傳位點(diǎn)而產(chǎn)生往往是由于不同的遺傳位點(diǎn)而產(chǎn)生, ,多態(tài)性的產(chǎn)多態(tài)性的產(chǎn)生是由于突變或重排而呵斥的生是由于突變或重排而呵斥的, ,這些變化可以發(fā)生在引物結(jié)合位點(diǎn)上這些變化可以發(fā)生在引物結(jié)合位點(diǎn)上, ,也可也可以位于引物結(jié)合序列之間。以位于引物結(jié)合序列之間。RAPDRAPD是一種顯性的遺傳標(biāo)志，與是一種顯性的遺傳標(biāo)志，與RFLPRFLP標(biāo)志相比，標(biāo)志相比，其標(biāo)志數(shù)量多其標(biāo)志數(shù)量多

29、, ,標(biāo)志的分辨率高，特異性強(qiáng)，標(biāo)志的分辨率高，特異性強(qiáng)，DNADNA用量較少用量較少(50(50),),對(duì)對(duì)DNADNA的質(zhì)量要求也不及的質(zhì)量要求也不及RFLPRFLP標(biāo)志技術(shù)，同時(shí)標(biāo)志技術(shù)，同時(shí),RFLP,RFLP技術(shù)依賴(lài)于技術(shù)依賴(lài)于PCRPCR技術(shù)技術(shù), ,因此它具因此它具有快速、方便、高效的特點(diǎn)有快速、方便、高效的特點(diǎn), ,因此經(jīng)常被廣泛用于基因的快速定位和遺傳作因此經(jīng)常被廣泛用于基因的快速定位和遺傳作圖。但由于圖。但由于RAPDRAPD受反響條件影響大受反響條件影響大, ,因此檢測(cè)的反復(fù)性較差，會(huì)產(chǎn)生一些假因此檢測(cè)的反復(fù)性較差，會(huì)產(chǎn)生一些假象的多態(tài)性。其次，象的多態(tài)性。其次，RAPD

30、RAPD標(biāo)志為顯性標(biāo)志，不能用來(lái)區(qū)別雜合和純合基因標(biāo)志為顯性標(biāo)志，不能用來(lái)區(qū)別雜合和純合基因型。型。3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度多態(tài)性度多態(tài)性) )。廣義的。廣義的AFLPAFLP是指一切的經(jīng)是指一切的經(jīng)PCRPCR反響產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度的多態(tài)性的反響產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度的多態(tài)性的總總稱(chēng)，而狹義的稱(chēng)，而狹義的AFLPAFLP專(zhuān)指一種基于專(zhuān)指一種基于PCRPCR反響的反響的AFLPAFLP，這是一種選擇性地?cái)U(kuò)增限，這是

31、一種選擇性地?cái)U(kuò)增限制性片段的方法。在操作過(guò)程中，往往先提取核制性片段的方法。在操作過(guò)程中，往往先提取核DNADNA，并用內(nèi)切酶降解，之，并用內(nèi)切酶降解，之后再銜接一個(gè)接頭后再銜接一個(gè)接頭, ,根據(jù)接頭的核苷酸序列和酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物根據(jù)接頭的核苷酸序列和酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物, ,即引物即引物= =接接頭頭+ +酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)+2+23 3個(gè)隨機(jī)的核苷酸，之后再進(jìn)展特異性個(gè)隨機(jī)的核苷酸，之后再進(jìn)展特異性PCRPCR擴(kuò)增，這種技術(shù)擴(kuò)增，這種技術(shù)將將RFLP的隨機(jī)性與專(zhuān)注性擴(kuò)增進(jìn)展巧妙地結(jié)合，又經(jīng)過(guò)不同的內(nèi)切酶以到的隨機(jī)性與專(zhuān)注性擴(kuò)增進(jìn)展巧妙地結(jié)合，又經(jīng)過(guò)不同的內(nèi)切酶以到達(dá)選擇的目的，故又稱(chēng)為選擇性限制

32、片段擴(kuò)增標(biāo)志達(dá)選擇的目的，故又稱(chēng)為選擇性限制片段擴(kuò)增標(biāo)志(Selectine Restriction Fragment Amplification 簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)SRFA)。AFLP標(biāo)志所檢測(cè)的多態(tài)性是酶切位標(biāo)志所檢測(cè)的多態(tài)性是酶切位點(diǎn)的變化或酶切片段間點(diǎn)的變化或酶切片段間DNA序列的插入與缺失，本質(zhì)上與序列的插入與缺失，本質(zhì)上與RFLP一致。與一致。與上上面兩種標(biāo)志技術(shù)相比，由于它結(jié)合面兩種標(biāo)志技術(shù)相比，由于它結(jié)合RAPD與與RFLP的專(zhuān)長(zhǎng)的專(zhuān)長(zhǎng),因此它所提供的基因此它所提供的基因組多態(tài)性信息比因組多態(tài)性信息比RFLP、RAPD多。此外，多。此外，AFLP標(biāo)志穩(wěn)定性強(qiáng)，反復(fù)性標(biāo)志穩(wěn)定性強(qiáng)，反復(fù)性好，自動(dòng)化程度高，標(biāo)志呈顯性或共顯性，對(duì)好，自動(dòng)化程度高，標(biāo)志呈顯性或共顯性，對(duì)DNA的數(shù)量及質(zhì)量要求低，的數(shù)量及質(zhì)量要求低，并且可以經(jīng)過(guò)控制引物的數(shù)目和種類(lèi)來(lái)選擇不同的并且可以經(jīng)過(guò)控制引物的數(shù)目和種類(lèi)來(lái)選擇不同的DNA片段以及擴(kuò)增的片段以及擴(kuò)增的DNA片段的數(shù)目片段的數(shù)目,因此在實(shí)踐運(yùn)用中有著非常好的前景。因此在實(shí)踐運(yùn)用中有著非常好的前景。4SAP(Specific Amplified Poly