遺傳毒性評(píng)價(jià)

1、微核制片技術(shù)及其應(yīng)用微核制片技術(shù)及其應(yīng)用 ( (誘變劑的遺傳毒性評(píng)價(jià)誘變劑的遺傳毒性評(píng)價(jià)) ) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解微核檢測(cè)的原理和毒理遺傳學(xué)意義。了解微核檢測(cè)的原理和毒理遺傳學(xué)意義。2. 掌握蠶豆根尖微核（或細(xì)胞電泳）監(jiān)測(cè)環(huán)境污染的一掌握蠶豆根尖微核（或細(xì)胞電泳）監(jiān)測(cè)環(huán)境污染的一般方法。般方法。3. 學(xué)會(huì)利用微核測(cè)試系統(tǒng)評(píng)價(jià)環(huán)境物質(zhì)的遺傳毒理效應(yīng)。學(xué)會(huì)利用微核測(cè)試系統(tǒng)評(píng)價(jià)環(huán)境物質(zhì)的遺傳毒理效應(yīng)。二、實(shí)驗(yàn)原理（微核技術(shù)）二、實(shí)驗(yàn)原理（微核技術(shù)） 1、微核（、微核（micronuclei,mcn）：）：是真核類(lèi)生物細(xì)胞是真核類(lèi)生物細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn)生的一種游離于主核之外

2、經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn)生的一種游離于主核之外的的異常核結(jié)構(gòu)異常核結(jié)構(gòu)。在。在細(xì)胞間期細(xì)胞間期微核呈圓形或橢圓形，大小微核呈圓形或橢圓形，大小為主核為主核1/3以下以下。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣，也具合成主核一樣，也具合成dna的能力。的能力。微核形態(tài)微核形態(tài) 2、微核的形成機(jī)理、微核的形成機(jī)理：許多：許多理化因素理化因素，如輻射、，如輻射、化學(xué)藥劑等作用于分裂細(xì)胞，化學(xué)藥劑等作用于分裂細(xì)胞，引起染色體斷裂或干引起染色體斷裂或干擾染色體行為擾染色體行為使之在使之在有絲分裂過(guò)程中行動(dòng)滯后有絲分裂過(guò)程中行動(dòng)滯后，末，末期未能進(jìn)入主核，當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入

3、下一次分裂間期時(shí)，期未能進(jìn)入主核，當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時(shí)，便濃縮形成獨(dú)立于主核之外的小核便濃縮形成獨(dú)立于主核之外的小核微核。微核。3 3、微核率的、微核率的大小與用藥劑量或輻射累積效應(yīng)呈正大小與用藥劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，相關(guān)，因此，可因此，可在間期進(jìn)行微核的觀(guān)察和計(jì)數(shù)來(lái)在間期進(jìn)行微核的觀(guān)察和計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)染色體畸變水平，檢測(cè)染色體畸變水平，指示染色體或紡錘體的損指示染色體或紡錘體的損傷程度傷程度微核是常用的遺傳毒理學(xué)指標(biāo)之一。微核是常用的遺傳毒理學(xué)指標(biāo)之一。4 4、微核測(cè)試已用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘、微核測(cè)試已用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期

4、診變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等方面斷等方面微核成因染色體作用于紡錘絲無(wú)著絲點(diǎn)，片或環(huán)整條染色體帶著絲粒的環(huán)和斷片于細(xì)胞分裂末期細(xì)胞質(zhì)中形成微核小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的形成微核的形成微核的形成 70年代初，年代初，matter和和schmid首先用嚙齒類(lèi)動(dòng)物骨髓細(xì)胞微核率首先用嚙齒類(lèi)動(dòng)物骨髓細(xì)胞微核率來(lái)測(cè)定疑有誘變活力的化合物，建立了微核測(cè)定法。此后，微核測(cè)來(lái)測(cè)定疑有誘變活力的化合物，建立了微核測(cè)定法。此后，微核測(cè)定逐漸從動(dòng)物、人擴(kuò)展到植物領(lǐng)域。人和動(dòng)物的微核測(cè)試多用一定定逐漸從動(dòng)物、人擴(kuò)展到植物領(lǐng)域。人和動(dòng)物的微核測(cè)試多用一定培養(yǎng)條件與時(shí)間下的骨髓和外周血細(xì)胞，但細(xì)胞同步化

5、困難，微核培養(yǎng)條件與時(shí)間下的骨髓和外周血細(xì)胞，但細(xì)胞同步化困難，微核率低，約率低，約0.2%。如用高等植物花粉，利用其天然的同步性作微核測(cè)。如用高等植物花粉，利用其天然的同步性作微核測(cè)試材料，效果較好，其中試材料，效果較好，其中70年代末年代末te-hsiu ma用一種原產(chǎn)于美洲的用一種原產(chǎn)于美洲的鴨跖草，建立的四分孢子期微核率計(jì)數(shù)（鴨跖草，建立的四分孢子期微核率計(jì)數(shù)（mcn-in-tetrad）的測(cè)試系）的測(cè)試系統(tǒng)是較好的系統(tǒng)之一。華中師范大學(xué)生物系自統(tǒng)是較好的系統(tǒng)之一。華中師范大學(xué)生物系自1983年開(kāi)始，建立了年開(kāi)始，建立了一套蠶豆根尖微核測(cè)試系統(tǒng)，并首次用于監(jiān)測(cè)水環(huán)境污染，經(jīng)鑒定一套蠶豆

6、根尖微核測(cè)試系統(tǒng)，并首次用于監(jiān)測(cè)水環(huán)境污染，經(jīng)鑒定已列入國(guó)家已列入國(guó)家生物監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范（水環(huán)境部分）生物監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范（水環(huán)境部分）。美國(guó)國(guó)家環(huán)保。美國(guó)國(guó)家環(huán)保局也肯定了蠶豆根尖微核試驗(yàn)在環(huán)境突變性檢測(cè)中的作用，對(duì)許多局也肯定了蠶豆根尖微核試驗(yàn)在環(huán)境突變性檢測(cè)中的作用，對(duì)許多環(huán)境致癌物都作了標(biāo)準(zhǔn)化的試驗(yàn)，建立了龐大的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以推廣。環(huán)境致癌物都作了標(biāo)準(zhǔn)化的試驗(yàn)，建立了龐大的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以推廣。三、實(shí)驗(yàn)用具三、實(shí)驗(yàn)用具1、材料：蠶豆（、材料：蠶豆（vicia faba, 2n=12）干種子）干種子 蠶豆根尖細(xì)胞的染色體大、數(shù)量少，蠶豆根尖細(xì)胞的染色體大、數(shù)量少，dna含量含量高，根尖中含有較多的分

7、裂相細(xì)胞，對(duì)誘變因子反高，根尖中含有較多的分裂相細(xì)胞，對(duì)誘變因子反應(yīng)敏感，且容易觀(guān)察，是理想的遺傳毒理分析材料。應(yīng)敏感，且容易觀(guān)察，是理想的遺傳毒理分析材料。 顯微鏡、培養(yǎng)箱、紫外燈、水浴鍋、剪刀（或刀顯微鏡、培養(yǎng)箱、紫外燈、水浴鍋、剪刀（或刀片）、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、燒杯、濾紙片）、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、燒杯、濾紙等。等。2、實(shí)驗(yàn)儀器及用具、實(shí)驗(yàn)儀器及用具 1mol/l鹽酸、甲醇、冰醋酸、改良苯酚品紅染鹽酸、甲醇、冰醋酸、改良苯酚品紅染液；液； nan3（疊氮鈉）、（疊氮鈉）、ems（甲基磺酸乙酯）、（甲基磺酸乙酯）、des（硫酸二乙酯）等化學(xué)誘變劑等；（硫酸二乙酯）等化學(xué)

8、誘變劑等； 紫外線(xiàn)、微波等物理誘變因子。紫外線(xiàn)、微波等物理誘變因子。3、藥品和試劑、藥品和試劑1、浸種催芽、浸種催芽：25下浸泡下浸泡24h，吸脹后，用河沙作發(fā)芽床，吸脹后，用河沙作發(fā)芽床，25培養(yǎng)箱中催芽培養(yǎng)箱中催芽1224h，初生根長(zhǎng)出，初生根長(zhǎng)出23mm時(shí)，取發(fā)芽良好的時(shí)，取發(fā)芽良好的種子，放入鋪滿(mǎn)濾紙的瓷盤(pán)中，種子，放入鋪滿(mǎn)濾紙的瓷盤(pán)中，25繼續(xù)催芽，大部分根長(zhǎng)至繼續(xù)催芽，大部分根長(zhǎng)至12cm （約（約3648h） 。2、染毒：、染毒：用被檢測(cè)液處理根尖。每處理選用被檢測(cè)液處理根尖。每處理選68粒初生根生長(zhǎng)良粒初生根生長(zhǎng)良好、根長(zhǎng)一致的種子，放入培養(yǎng)皿中，用被檢測(cè)液浸沒(méi)根尖。陽(yáng)性因好、

9、根長(zhǎng)一致的種子，放入培養(yǎng)皿中，用被檢測(cè)液浸沒(méi)根尖。陽(yáng)性因子可采用子可采用nan3和紫外線(xiàn)等，和紫外線(xiàn)等，0.2、 0.4、 0.8mmol/l nan3溶液。紫溶液。紫外線(xiàn)分別處理外線(xiàn)分別處理20、40、60min。另外可取一處污水作被檢液之一。另外可取一處污水作被檢液之一。用自來(lái)水（或蒸餾水）處理作對(duì)照。處理根尖用自來(lái)水（或蒸餾水）處理作對(duì)照。處理根尖1224h。3、根尖細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)：、根尖細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)：處理后的種子用自來(lái)水（或蒸餾水）處理后的種子用自來(lái)水（或蒸餾水）浸洗三次，每次浸洗三次，每次23min。洗凈后置入輔有濕潤(rùn)濾紙的瓷盤(pán)中，。洗凈后置入輔有濕潤(rùn)濾紙的瓷盤(pán)中，25下恢復(fù)培養(yǎng)下恢復(fù)

10、培養(yǎng)2224h。四、實(shí)驗(yàn)操作流程四、實(shí)驗(yàn)操作流程4、根尖細(xì)胞固定并保存：、根尖細(xì)胞固定并保存：切取恢復(fù)后的切取恢復(fù)后的1cm長(zhǎng)的幼根，甲醇：長(zhǎng)的幼根，甲醇：冰醋酸（冰醋酸（3：1）液固定）液固定24h。 置置70%的乙醇中保存于的乙醇中保存于4冰箱中。冰箱中。5、解離：、解離：加入加入1mol/l鹽酸浸沒(méi)幼根鹽酸浸沒(méi)幼根10min，使幼根軟化。解離前，使幼根軟化。解離前后用蒸餾水清洗干凈。后用蒸餾水清洗干凈。6、染色、壓片：、染色、壓片：截取截取12mm長(zhǎng)的根尖置載玻片上，滴一滴染長(zhǎng)的根尖置載玻片上，滴一滴染液，染色液，染色58min，加上蓋玻片，壓片。，加上蓋玻片，壓片。7、鏡檢觀(guān)察、計(jì)數(shù)：

11、、鏡檢觀(guān)察、計(jì)數(shù)：首先在低倍鏡下找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散首先在低倍鏡下找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散均勻，分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀(guān)察。均勻，分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀(guān)察。 每一處理觀(guān)察每一處理觀(guān)察3個(gè)根尖，每個(gè)根尖數(shù)個(gè)根尖，每個(gè)根尖數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其中含微個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其中含微核的細(xì)胞數(shù)，然后平均，即為該處理的核的細(xì)胞數(shù)，然后平均，即為該處理的mcn ，即微核千分率。，即微核千分率。五、結(jié)果與分析五、結(jié)果與分析微核識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)：微核識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)：（1）在主核大小的）在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。以下，并與主核分離的小核。直徑大約是細(xì)胞直徑的直徑大約是細(xì)胞直徑的1/201/5。（2）小

12、核著色與主核相當(dāng)或稍淺。）小核著色與主核相當(dāng)或稍淺。（3）小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則形。）小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則形。處理觀(guān)察的細(xì)胞數(shù) 微核數(shù)總計(jì) 微核nan3 (mmol/l)0.20.40.8紫外線(xiàn)(min)204060蠶豆根尖微核檢測(cè)記錄表蠶豆根尖微核檢測(cè)記錄表注：以小組為單位統(tǒng)計(jì)平均微核千分率。注：以小組為單位統(tǒng)計(jì)平均微核千分率。處理觀(guān)察的細(xì)胞數(shù) 微核數(shù)總計(jì) 微核nan3 (mmol/l)0.20.40.8蒸餾水計(jì)算各測(cè)試樣品（包括對(duì)照）的微核千分率（計(jì)算各測(cè)試樣品（包括對(duì)照）的微核千分率（mcn）：）：樣品污染（中毒）程度的確定：樣品污染（中毒）程度的確定：mcn10，基本

13、沒(méi)有污染（中毒），基本沒(méi)有污染（中毒） ；10mcn18，輕度污染（中毒），輕度污染（中毒） ；18mcn30，中度污染（中毒）；，中度污染（中毒）；mcn30，重度污染，重度污染（中毒）。（中毒）。某樣品或?qū)φ沼^(guān)察到的微核數(shù)某樣品或?qū)φ沼^(guān)察到的微核數(shù)某樣品或?qū)φ沼^(guān)察到的細(xì)胞數(shù)某樣品或?qū)φ沼^(guān)察到的細(xì)胞數(shù)mcn=1000 “污染指數(shù)污染指數(shù)”判別（此方法可避免因?qū)嶒?yàn)條件等因素帶來(lái)的判別（此方法可避免因?qū)嶒?yàn)條件等因素帶來(lái)的mcn本底的波動(dòng)）：本底的波動(dòng)）： 樣品實(shí)測(cè)微核平均千分率樣品實(shí)測(cè)微核平均千分率 對(duì)照平均微核千分率對(duì)照平均微核千分率 0pi1.5，基本沒(méi)有污染；，基本沒(méi)有污染； 1.5pi2，輕度污染；，輕度污染； 2pi3.5，中度污染；，中度