真核基因組DNA的分離純化

1、 真核基因組真核基因組dnadna的分離純化的分離純化 核酸包括核酸包括dnadna、rnarna兩種分子，在細胞中兩種分子，在細胞中都以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。真核生物的染色都以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。真核生物的染色體體dnadna為雙鏈線性分子，原核生物的染色體為雙鏈線性分子，原核生物的染色體dnadna、質(zhì)粒及真核細胞器、質(zhì)粒及真核細胞器dnadna為雙鏈環(huán)狀分子；為雙鏈環(huán)狀分子；有些噬菌體有些噬菌體dnadna為單鏈環(huán)狀分子；為單鏈環(huán)狀分子； 大多數(shù)生物體內(nèi)大多數(shù)生物體內(nèi)rnarna分子均為單鏈線性分子分子均為單鏈線性分子并具有不同的結(jié)構(gòu)特點，如真核生物并具有不同的結(jié)構(gòu)特點，如真核生物

2、mrnamrna分子分子多數(shù)在多數(shù)在3 3端帶有端帶有polyapolya結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 分離純化核酸總的原則：分離純化核酸總的原則： 應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性（完整應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性（完整的一級結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的一級結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本要求）；的最基本要求）； 排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等其他分子的污染的污染 。 無其他核酸分子的污染（如抽提無其他核酸分子的污染（如抽提dnadna分子時應(yīng)去除分子時應(yīng)去除rnarna分子）。分子）。分離核酸分離核酸 應(yīng)注意以下幾點：應(yīng)注意以下幾點： 減少化學(xué)因素對核酸的降解，減少化學(xué)因素對核酸的

3、降解， 減少物理因素對核酸的降解：減少物理因素對核酸的降解： 防止核酸的生物降解：防止核酸的生物降解： 進行核酸分離進行核酸分離時最好新鮮生物組織或細胞樣品，若不時最好新鮮生物組織或細胞樣品，若不能馬上進行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮能馬上進行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮中或中或-70-70冰箱中。冰箱中。核酸提取的主要步驟： 一般為破碎細胞，去除與核酸結(jié)合一般為破碎細胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸去除其他不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除鹽、有機溶劑等雜質(zhì)，最后得到以去除鹽、有機溶劑等雜質(zhì)，最后得到純化的核酸

4、。純化的核酸。一、外周血白細胞一、外周血白細胞dnadna提?。ㄌ崛。╪ainai法）法） 【實驗?zāi)康摹俊緦嶒災(zāi)康摹?掌握掌握nainai法提取外周血白細胞法提取外周血白細胞dnadna的原的原理和方法。理和方法?！緦嶒炘怼?從全血制備白細胞從全血制備白細胞dnadna，可用雙蒸水溶脹紅細胞，可用雙蒸水溶脹紅細胞及白細胞膜，釋放出血紅蛋白及細胞核，使核酸處于及白細胞膜，釋放出血紅蛋白及細胞核，使核酸處于易提取狀態(tài)，加易提取狀態(tài)，加nainai破核膜并使破核膜并使dnadna從核蛋白中解離，從核蛋白中解離，用氯仿用氯仿/ /異戊醇抽提使蛋白質(zhì)沉淀完全（異戊醇去泡異戊醇抽提使蛋白質(zhì)沉淀完全（異戊

5、醇去泡沫），沫），dnadna存在于上層水相中，以存在于上層水相中，以37%37%異丙醇沉淀異丙醇沉淀dnadna，離心棄去異丙醇，并重復(fù)操作一次，即可獲得，離心棄去異丙醇，并重復(fù)操作一次，即可獲得白細胞白細胞dnadna。 【實驗材料】 1、高速離心機。 2、各種所需試劑 【實驗方法】【實驗方法】 1 1取新鮮抗凝血取新鮮抗凝血100 l100 l置置epep管中，離心管中，離心10 000 10 000 r/minr/min1 min1 min。 2 2棄上清，加棄上清，加ddh2o 200 lddh2o 200 l，搖勻，搖勻20 s20 s。 3 3加加6 mol/l nai 200

6、l6 mol/l nai 200 l，緩慢倒置搖勻，緩慢倒置搖勻20 s20 s。 4 4于管內(nèi)加氯仿于管內(nèi)加氯仿/ /異戊醇（異戊醇（24:124:1）400 l400 l，搖勻，搖勻20 s20 s，離心離心12 000 r/min12 000 r/min12 min12 min。 5 5吸取上層水相吸取上層水相360 l360 l置一新置一新epep管中，加純異丙醇管中，加純異丙醇200 l200 l，搖勻，搖勻20 s20 s。 6 6室溫放置室溫放置15 min15 min，離心，離心14 000 r/min14 000 r/min12 min12 min。 7 7小心棄去上清，再加

7、小心棄去上清，再加37%37%異丙醇異丙醇1 ml1 ml（勿搖動），（勿搖動），離心離心14 000 r/min14 000 r/min12 min12 min。 8 8小心棄去異丙醇，晾干。小心棄去異丙醇，晾干。 9 9加加50 l te50 l te緩沖液溶解緩沖液溶解dnadna，以瓊脂糖凝膠電泳鑒，以瓊脂糖凝膠電泳鑒定或定或-20-20保存。保存?！咀⒁馐马椬⒁馐马棥?1 1標本必須新鮮，提取前細胞應(yīng)保持完整。標本必須新鮮，提取前細胞應(yīng)保持完整。所用所用epep管、吸嘴等器物及管、吸嘴等器物及ddh2oddh2o、試劑等應(yīng)、試劑等應(yīng)高壓滅菌，操作盡量在高壓滅菌，操作盡量在4 4以下進行。以下進行。 2 2混勻試劑、吸取上清等操作時應(yīng)避免動作混勻試劑、吸取上清等操作時應(yīng)避免動作劇烈。劇烈。 3 3棄異丙醇時動作應(yīng)輕，切忌甩干，以免棄異丙醇時動作應(yīng)輕，切忌甩干，以免dnadna丟失。丟失。