皮膚保護(hù)及二核甘酸含量檢測(cè)

1、皮膚保護(hù)中的二核甘酸檢測(cè)skin-protecting dinucleotide examinedkarin cucumel,isp global skin research center,franceraid domloge,isp global skin research center,france 文獻(xiàn)來(lái)源：published january 2008 personal care翻譯：呂曉滕摘要 壓力作為我們生活中的一大要素正在變得越來(lái)越明顯，大量的數(shù)據(jù)表明壓力對(duì)人類(lèi)皮膚的健康和老化有著直接的影響。壓力可能來(lái)自于環(huán)境污染，天氣狀況，吸煙，放射物，重金屬和紫外線(xiàn)等等。 在導(dǎo)致壓力的眾多因素

2、中，紫外線(xiàn)是導(dǎo)致皮膚光老化的主要誘因，這是由于紫外線(xiàn)能夠?qū)ζつw中的膠原，彈性蛋白，黑素細(xì)胞和皮膚的柵欄組織，并引起皮膚褶皺，松弛，不均勻的皮膚斑點(diǎn)，黑斑和皮膚干燥。因此，開(kāi)發(fā)一種能夠?qū)蛊つw老化和和壓力的活性物質(zhì)便成為化妝品行業(yè)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。 位于法國(guó)安蒂波利斯地區(qū)的isp全球皮膚研究中心曾經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種化妝品活性物質(zhì)，該物質(zhì)是通過(guò)生物技術(shù)的方法從一種生活在hypermineral湖中的鹵蟲(chóng)體內(nèi)獲得的，當(dāng)環(huán)境變壞時(shí)，鹵蟲(chóng)進(jìn)入休眠狀態(tài)，在休眠狀態(tài)下鹵蟲(chóng)能夠壓縮并加速形成一種至關(guān)重要的分子，gp4g，這是一種主要用于dna保護(hù)的具有很高潛在勢(shì)能的物質(zhì)，同時(shí)也是一種儲(chǔ)能物質(zhì)。 當(dāng)環(huán)境條件適合時(shí)，鹵

3、蟲(chóng)就會(huì)從休眠中醒來(lái)并萌發(fā)，然后進(jìn)行一種不同于上述途徑的代謝過(guò)程。最終，gp4g轉(zhuǎn)變成為atp。gp4g為鹵蟲(chóng)的生命活動(dòng)提供能量并保證鹵蟲(chóng)的安全與進(jìn)化，本研究的主要目的就是證明gp4g應(yīng)用于皮膚后能夠通過(guò)為肌膚提供能量的方式來(lái)保護(hù)dna，對(duì)抗中波紫外線(xiàn)和皮膚老化以保證大部分的皮膚細(xì)胞出于一個(gè)良好的狀態(tài)。材料與方法 人類(lèi)成纖維細(xì)胞由細(xì)胞培養(yǎng)獲得，皮膚外植體由整容外科獲得，然后，采用了一個(gè)確定皮膚組織的培養(yǎng)方案，hacat細(xì)胞株由美國(guó)菌種保藏中心獲得，人類(lèi)成纖維細(xì)胞用鹵蟲(chóng)提取物處理24小時(shí)，然后暴露在中波紫外光下，24小時(shí)后做一個(gè)mtt溴比色測(cè)試。 培養(yǎng)的皮膚樣品用標(biāo)準(zhǔn)的直接免疫熒光反應(yīng)的方法來(lái)檢測(cè)

4、，用兔子的多克隆抗體抗-hsp-70進(jìn)行熱休克蛋白的研究，老鼠的抗-cd1a細(xì)胞進(jìn)行朗格漢斯細(xì)胞染色檢測(cè)。 用12%的nupage凝膠按照前面提到的方法進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，兔子的抗膠原多克隆抗體抗體與小鼠的單克隆抗體通過(guò)tebu購(gòu)買(mǎi)。 彗星實(shí)驗(yàn)（單細(xì)胞凝膠電泳）是一種能夠檢測(cè)單細(xì)胞中單鏈dna或雙鏈dna斷裂的短距敏感的微電泳技術(shù)，簡(jiǎn)單地說(shuō)，經(jīng)過(guò)處理以后，細(xì)胞最終進(jìn)入了瓊脂糖凝膠并溶解在一種高鹽的去垢劑緩沖液中，在單細(xì)胞凝膠電泳之后，將dna在堿性溶液中變性，然后用碘化丙啶處理。受損細(xì)胞內(nèi)的dna會(huì)向正極移動(dòng)，移動(dòng)的速度與細(xì)胞碎片的數(shù)量呈正比，這樣就會(huì)在凝膠上面形成一道“彗星”。損害評(píng)估通過(guò)一個(gè)

5、能夠幫助探測(cè)dan損傷百分比的軟件來(lái)進(jìn)行。 在人類(lèi)角質(zhì)細(xì)胞接收uvb100mj/cm2照射之前或之后的24h內(nèi)加入鹵蟲(chóng)提取物，加入鹵蟲(chóng)提取物24h之后采用原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)（tunel測(cè)試技術(shù)）進(jìn)行檢測(cè)。 人類(lèi)的hacat細(xì)胞通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)（elisa）技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，hacat細(xì)胞在接受uvb照射24h后加入3%的鹵蟲(chóng)提取物。并通過(guò)il-1，il-8和tmf-的水平來(lái)評(píng)估總細(xì)胞因子。細(xì)胞因子的水平用pg/mg蛋白表示。結(jié)果 為了證明細(xì)胞的新陳代謝被激活，預(yù)先測(cè)定了纖維母細(xì)胞中的atp含量。利用安瑪西亞公司的camp競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)試系統(tǒng)，我們測(cè)得atp的含量比本底水平上升了40%。 gp4g是

6、atp的前體物質(zhì)，并且也被證明具有能夠提供能量的特征。在鹵蟲(chóng)生長(zhǎng)的環(huán)境中，當(dāng)周?chē)沫h(huán)境適合時(shí)，鹵蟲(chóng)從休眠狀態(tài)蘇醒，鹵蟲(chóng)體內(nèi)的gp4g的含量迅速下降，而atp的含量卻上升明顯。gp4g機(jī)制被認(rèn)為是一種能夠使鹵蟲(chóng)在嚴(yán)酷環(huán)境中生存下來(lái)的原因。當(dāng)面臨嚴(yán)酷的環(huán)境時(shí)，鹵蟲(chóng)體內(nèi)開(kāi)始加速形成一種重要的分子-gp4g，其中含有典型的高能磷酸鍵。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在環(huán)境惡劣的條件下，gp4g是由一種能夠?yàn)閍tp的形成提供能量的能量供體，儲(chǔ)存于atp中的能量在環(huán)境適宜時(shí)釋放出來(lái)。因此，gp4g在別的生理?xiàng)l件或在人體細(xì)胞中，能夠激活c-amp依賴(lài)的代謝途徑。表皮和真皮的再生 免疫染色和免疫印跡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在hacat細(xì)

7、胞中絲聚蛋白和角蛋白的含量都有明顯的增加。這項(xiàng)研究顯示鹵蟲(chóng)提取物能夠刺激絲聚蛋白的合成，并因此促進(jìn)表皮的分化。同樣的，我們也證明了，在一些經(jīng)過(guò)纖維原處理的細(xì)胞中，真皮蛋白如纖連蛋白和膠原蛋白也有大幅的增長(zhǎng)。gp4g能夠通過(guò)誘導(dǎo)絲聚蛋白和膠原蛋白的合成來(lái)提高皮膚的柵欄功能，不僅如此，gp4g通過(guò)誘導(dǎo)膠原蛋白和纖維原蛋白的合成，還發(fā)揮著細(xì)胞外基質(zhì)的作用。因此，gp4g同時(shí)為表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞提供保護(hù)。dna的保護(hù) 為了證明gp4g對(duì)dna的保護(hù)，在實(shí)驗(yàn)中我們把角質(zhì)細(xì)胞放在uvb下照射，然后應(yīng)用tunel技術(shù)來(lái)探測(cè)并量化細(xì)胞凋亡。利用tunel技術(shù)原位檢測(cè)dna碎片顯示，在照射前或照射后加入鹵蟲(chóng)提取

8、物的細(xì)胞中，由uvb引發(fā)的細(xì)胞凋亡降低了35%，另外，在紫外照射之前或之后加入鹵蟲(chóng)提取物，可以使dna的保護(hù)率上升至45%，這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果很有意思，并且我們可以拿該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與gp4g在鹵蟲(chóng)體內(nèi)的生物學(xué)作用相比較，事實(shí)上，鹵蟲(chóng)加速體內(nèi)gp4g的合成，主要是因?yàn)間p4g能夠抵御各種嚴(yán)酷的環(huán)境，并保護(hù)其dna和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性。抵御uvb的傷害 前面的實(shí)驗(yàn)顯示，鹵蟲(chóng)提取物能夠保護(hù)dna免受uvb的傷害，基于這樣一個(gè)結(jié)果，我們研究了gp4g對(duì)暴露在uvb照射之下的細(xì)胞的作用。實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象是人類(lèi)皮膚中的纖維母細(xì)胞。首先，細(xì)胞經(jīng)過(guò)鹵蟲(chóng)提取物的預(yù)處理，并證明其生命力提高了20%，在實(shí)驗(yàn)的第二個(gè)階段，對(duì)培

9、養(yǎng)的纖維母細(xì)胞進(jìn)行彗星試驗(yàn)檢測(cè)，并且證明無(wú)論是用低劑量的uvb（30mj）處理，還是高劑量的uvb（60mj和100mj）處理，經(jīng)過(guò)鹵蟲(chóng)提取物處理的細(xì)胞中的dna所受到的傷害都要比未處理的低（見(jiàn)圖表1）。 這個(gè)實(shí)驗(yàn)最終被暴露在高劑量uvb下體外皮膚研究證實(shí)，事實(shí)上，經(jīng)過(guò)（鹵蟲(chóng)提取物）處理的皮膚較好的保持了他們的結(jié)構(gòu)，并且受到uvb的損傷也比較輕（如：很少出現(xiàn)被陽(yáng)光灼傷的細(xì)胞）。另外，cd1a免疫染色的朗格漢斯細(xì)胞顯示，經(jīng)過(guò)（鹵蟲(chóng)提取物）處理的皮膚細(xì)胞并沒(méi)有表現(xiàn)出數(shù)量的下降，也沒(méi)有分布在朗格漢斯細(xì)胞中，然而，對(duì)照組的皮膚卻出現(xiàn)朗格漢斯細(xì)胞大幅下降的現(xiàn)象，并且還出現(xiàn)了細(xì)胞往真皮遷移的現(xiàn)象，這是uv

10、輻射引起免疫抑制的標(biāo)志。 以上的所有實(shí)驗(yàn)都證明gp4g具有能夠幫助細(xì)胞抵御uv輻射的巨大作用。提高抵御壓力的能力 本研究的母的gp4g在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外都具有抵御各種壓力（如耐熱性）的能力。將人類(lèi)的纖維母細(xì)胞在添加了二核甘酸磷酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)的細(xì)胞47培養(yǎng)1h。再將活細(xì)胞mtt染色。而在另外一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，人類(lèi)皮膚細(xì)胞的外植體分為用鹵蟲(chóng)提取物處理的實(shí)驗(yàn)組和用奶油處理的對(duì)照組，然后將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都轉(zhuǎn)移到37這樣一個(gè)應(yīng)力溫度下復(fù)蘇24h。研究表明，經(jīng)過(guò)（鹵蟲(chóng)提取物）處理的細(xì)胞熱休克的回復(fù)率比未經(jīng)處理的要高。在蘇木精-伊紅染色中，經(jīng)過(guò)（鹵蟲(chóng)提取物）處理的細(xì)胞跟對(duì)照組的細(xì)胞相比對(duì)酷熱的環(huán)境具有

11、更強(qiáng)的抵抗力。 與對(duì)照組的皮膚細(xì)胞相比，在酷熱的環(huán)境中，經(jīng)過(guò)處理的皮膚細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的能力，并且受到的熱傷害更輕。其他研究 如果說(shuō)gp4g對(duì)鹵蟲(chóng)本身的細(xì)胞有作用還是可以解釋的話(huà)，那gp4g對(duì)人類(lèi)皮膚細(xì)胞有益，這又該怎么解釋呢？現(xiàn)在已經(jīng)證明gp4g能夠刺激角質(zhì)蛋白和絲蛋白的產(chǎn)生，那這又有一個(gè)問(wèn)題，在gp4g發(fā)揮保護(hù)作用的時(shí)候，他還能刺激其他蛋白的產(chǎn)生嗎？ 我們將關(guān)注的焦點(diǎn)放在熱激蛋白上面，這是一種能夠保護(hù)細(xì)胞免受各種嚴(yán)酷環(huán)境傷害的分子伴侶。簡(jiǎn)單地說(shuō)，熱激蛋白（hsps）與壓力和非壓力條件下的多種生理功能有關(guān)，能夠增強(qiáng)在這種機(jī)制中起重要作用的各種蛋白的作用。hsps包括了hsp7

12、0的兩種類(lèi)型。在生理?xiàng)l件下，hsp70對(duì)蛋白的折疊與組裝，以及細(xì)胞的發(fā)育和分化起著重要作用，而在壓力條件下，hsp70結(jié)合在作為“分子伴侶”結(jié)合在未折疊和去折疊的蛋白分子上。 本研究的主要目的是通過(guò)免疫染色的方法評(píng)估在人類(lèi)的皮膚樣本和皮膚細(xì)胞中hsp70的表達(dá)情況。并且還檢測(cè)了人類(lèi)皮膚細(xì)胞中hsp70的信使rna含量。（結(jié)果證明）無(wú)論是在角質(zhì)細(xì)胞還是在纖維母細(xì)胞中，gp4g都能夠顯著地誘導(dǎo)hsp70的合成。在人類(lèi)皮膚中進(jìn)行的相似研究證明，與對(duì)照組相比，在培養(yǎng)基配方中加入鹵蟲(chóng)提取物可以顯著誘導(dǎo)并增加hsp70蛋白的表達(dá)。在另外的相關(guān)試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)hsp70的mrna含量出現(xiàn)了迅速的增加。事實(shí)上

13、，hsp70的含量在用二核苷酸磷酸處理后3h即上升70%，達(dá)到最大值。 另外，不同的研究都顯示鹵蟲(chóng)提取物在沒(méi)有外界壓力的作用時(shí)可以誘導(dǎo)hsp70的產(chǎn)生。此類(lèi)研究包括用mtt比色法測(cè)定細(xì)胞活性，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力的損失。同樣的，關(guān)于il-1和il-8的研究也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)合成，這預(yù)示著不存在外部壓力。因此，我們注意到有趣的一點(diǎn)是，鹵蟲(chóng)提取物通過(guò)一種非凡的機(jī)制來(lái)起到一種主要的保護(hù)作用：它在沒(méi)有壓力的時(shí)候誘導(dǎo)人類(lèi)皮膚和人類(lèi)細(xì)胞中的hsp70的表達(dá)。細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用 為了進(jìn)一步觀(guān)察鹵蟲(chóng)提取物（在沒(méi)有外界壓力的條件下）誘導(dǎo)hsp70產(chǎn)生的方式，我們通過(guò)研究il-8，il-1以及tnf等細(xì)

14、胞因子的誘導(dǎo)合成來(lái)研究鹵蟲(chóng)提取物的抗炎作用。另外一些研究表明，hsp70能夠在高溫，化學(xué)物質(zhì)，放射性物質(zhì)等抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生的條件下合成。為了了解鹵蟲(chóng)提取物在該途徑中的作用，我們將人類(lèi)hacat角質(zhì)細(xì)胞先用gp4g處理24h，然后用uvb照射，再進(jìn)行elisa（酶聯(lián)免疫反應(yīng)）。有趣的是，在鹵蟲(chóng)提取物誘導(dǎo)的細(xì)胞中，不同時(shí)間點(diǎn)的il-1水平都出現(xiàn)了明顯的下降，而il-8的情形也與此類(lèi)似。同樣的，在用鹵蟲(chóng)提取物處理過(guò)的細(xì)胞中，tnf的含量也出現(xiàn)了明顯的下降。所有這些的明顯下降都是由學(xué)生t測(cè)試得到的。這些研究表明鹵蟲(chóng)提取物，或者更精確的說(shuō)，鹵蟲(chóng)提取物在沒(méi)有外界壓力的條件下誘導(dǎo)人體細(xì)胞產(chǎn)生的hsp70，通

15、過(guò)一種新的，降低細(xì)胞因子反應(yīng)的方式來(lái)治療人類(lèi)皮膚一些炎癥。鹵蟲(chóng)提取物對(duì)類(lèi)維生素a治療皮膚的影響 根據(jù)前面對(duì)鹵蟲(chóng)提取物在各種壓力條件下降低人體細(xì)胞和皮膚中的細(xì)胞因子含量過(guò)程中的作用，我們的興趣轉(zhuǎn)向了gp4g在用全反式維甲酸（atra）處理的皮膚細(xì)胞中的作用。我們知道，維甲酸在各種皮膚病中都有著廣泛的應(yīng)用，本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的維甲酸能夠降低hsp70的含量。這種現(xiàn)象是在應(yīng)用的第一周發(fā)現(xiàn)的，并且隨著時(shí)間的推移越來(lái)越明顯。鹵蟲(chóng)提取物能夠顯著增加經(jīng)過(guò)atra處理過(guò)的細(xì)胞或皮膚樣品中hsp70的含量。另外，前面的數(shù)個(gè)研究成果都顯示atra的局部應(yīng)用可以增加細(xì)胞中的炎癥因子。并研究了鹵蟲(chóng)提取物對(duì)atra和gp

16、4g處理過(guò)的細(xì)胞中il-1的含量的影響。結(jié)果證明atra對(duì)人類(lèi)細(xì)胞和皮膚都具有促炎癥作用，而鹵蟲(chóng)提取物則可以降低這兩者中的炎癥因子。這個(gè)研究證明了gp4g在提高皮膚舒適度上與維甲酸是相互關(guān)聯(lián)的。結(jié)論 人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到皮膚時(shí)間在太陽(yáng)光下曝曬會(huì)帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)，隨著這種認(rèn)識(shí)的普及與增長(zhǎng)，人們重新對(duì)保護(hù)皮膚免受uv的傷害變的重視起來(lái)。如今，人們已經(jīng)知道uv可以損傷細(xì)胞中的dna，可引起光老化并具有致癌作用。在陽(yáng)光下暴曬和其他因素和其他因素可加速皮膚的老化進(jìn)程-這些因素包括吸煙，空氣污染，惡劣的氣候環(huán)境以及現(xiàn)代生活中的各種壓力。 鹵蟲(chóng)提取物通過(guò)其所含有的gp4g和hsp，能夠在很大程度上保護(hù)皮膚。事實(shí)上，鹵蟲(chóng)提取物具有多種保護(hù)功能，其中的一些是由hsp70誘導(dǎo)介導(dǎo)的，能夠緩解細(xì)胞的壓力。除了hsp的細(xì)胞保護(hù)功能之外，鹵蟲(chóng)提取物中的gp4g還具有“細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)激活者”的作用。gp4g，能夠通過(guò)gtp，綁定在g蛋白上，并激活細(xì)胞的新陳代謝。gp4g還富含磷，鳥(niǎo)嘌呤等組成一些重要分子（如，dna,rna,磷脂質(zhì)）的重要元素，磷還是很多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的