結(jié)構(gòu)生物學(xué)(生物大分子解析方法)

1、結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究方法和技術(shù)生物大分子要發(fā)揮功能，必須滿足兩個(gè)條件: 第一，凡要發(fā)揮功能和活性的生物大分子必須具有特定的，自身特有，相對穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu); 第二，結(jié)構(gòu)運(yùn)動。任何的破壞促使沒有穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)運(yùn)動，生物大分子是很難發(fā)揮生物功能或活性的。 結(jié)構(gòu)生物學(xué)概念及主要研究方法結(jié)構(gòu)生物學(xué)是通過確定生物大分子三級結(jié)構(gòu)，來研究生物大分子的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，從而探討生物大分子的作用機(jī)制和原理作為研究目的。主要研究方法: X- 射線晶體衍射方法（X- 射線蛋白質(zhì)晶體學(xué)） 多維核磁共振（ NMR ） 電鏡晶體學(xué)和電鏡三維重組方法結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展 60年代 當(dāng)時(shí)的開文迪許實(shí)驗(yàn)室的M.Perutz J.Ken

2、drew 用X-射線晶體衍射技術(shù)獲得了球蛋白的結(jié)構(gòu).由于X射線晶體衍射技術(shù)的應(yīng)用，使我們可以在晶體水平研究大分子的結(jié)構(gòu)，在分子原子基礎(chǔ)上解釋了大分子. 由于他們開創(chuàng)性的工作，Waston ,Crick獲得了1962年的諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),M. Perutz和J.Kendrew獲得了同年的化學(xué)獎(jiǎng). 從那時(shí)起，技術(shù)的發(fā)展就成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)發(fā)展最重要的決定因素。起源：起源：1950s, Waston, Crick 發(fā)現(xiàn)了發(fā)現(xiàn)了 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，建立雙螺旋結(jié)構(gòu)，建立DNA的雙螺旋模型。的雙螺旋模型。60-70年代,在同一實(shí)驗(yàn)室的他們又發(fā)展了電子晶體學(xué)技術(shù)，當(dāng)時(shí)的研究對象主要是有序的,對稱性高的生物體

3、系，如二維的晶體和對稱性很高的三維晶體。 70-80年代，多維核磁共振波譜學(xué)的發(fā)明使得在水溶液中研究生物大分子成為可能,水溶液中的生物大分子更接近于生理狀態(tài).80年代到本世紀(jì)初,冷凍電子顯微鏡的發(fā)明,這種技術(shù)的發(fā)明使我們不僅能夠研究生物大分子在晶體狀態(tài)和溶液狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，而且能夠研究研究復(fù)雜的大分子體系超分子體系，這就是細(xì)胞器和細(xì)胞.可見結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展過程經(jīng)歷了從結(jié)晶到溶液再到大分子體系,超分子體系,如核糖體(ribosome),病毒,溶酶體(lysosome),線粒體等. X- 射線晶體衍射方法X射線單晶衍射技術(shù)是由H. W. 布拉格和W.L. 布拉格父子于1912 年提出和發(fā)展起來的. 此

4、技術(shù)最先用于無機(jī)晶體分析,后來到1953 年,沃森和克里克用于DNA 晶體分析,至60 年代,肯德魯和佩魯茲用于研究血紅蛋白和肌紅蛋白,逐漸成為生物大分子晶體結(jié)構(gòu)研究的重要手段,直至今天仍占據(jù)統(tǒng)治地位。優(yōu)點(diǎn)是分辨率高,達(dá)到原子分辨率,既可研究水溶性蛋白、也可研究膜蛋白和大分子組裝體與復(fù)合體。它能給出生物大分子的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型,確定活性中心的位置和結(jié)構(gòu),從分子水平理解蛋白質(zhì)如何識別和結(jié)合客體分子,如何催化,如何折疊和進(jìn)化等生命的基本過程,進(jìn)而闡明生命現(xiàn)象。如1997 年底,應(yīng)用X 射線單晶衍射方法完成了有關(guān)核小體(nucleosome) 的核心顆粒分辨率為0128nm的精細(xì)空間結(jié)構(gòu)的測定,每個(gè)核

5、小體的盤狀核心含有8個(gè)組蛋白形成的八面體、外繞146 個(gè)堿基對組成的DNA ,這一杰出的成就對了解基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制與修復(fù)的動態(tài)過程都很重要.此外,應(yīng)用X 射線單晶衍射技術(shù)測定蛋白質(zhì)和核酸的晶體結(jié)構(gòu)并結(jié)合分子模擬技術(shù),已經(jīng)為新藥物的設(shè)計(jì)新藥物的設(shè)計(jì)提供了一個(gè)全新的方向,大大縮短了新藥的研制過程. 新藥的設(shè)計(jì)和開發(fā),要求對這些藥物靶標(biāo)( drug target ) 的結(jié)構(gòu)、性能有精確的了解,由于迄今對其了解甚少,現(xiàn)有臨床藥物絕大多數(shù)是通過嘗試篩選獲得的,導(dǎo)致研制一個(gè)新藥常常需十多年,甚至幾十年的時(shí)間.通過對愛滋病病毒(HIV) 蛋白酶的精細(xì)結(jié)構(gòu)測定,并以此為靶標(biāo)設(shè)計(jì)酶的抑制劑作為治療愛滋病的有

6、效藥物獲得巨大成功,已顯著減少愛滋病死亡數(shù)量.為什么要用為什么要用X-X-射線射線d假設(shè)原子的尺度為dl l dl l d只有光源波長與障礙物尺度相當(dāng)，或者光源波長小于障礙物尺度的時(shí)候只有光源波長與障礙物尺度相當(dāng)，或者光源波長小于障礙物尺度的時(shí)候才能探測到障礙物的信息。才能探測到障礙物的信息。X-射線的波長與原子以及化學(xué)鍵的尺度相當(dāng)，都在射線的波長與原子以及化學(xué)鍵的尺度相當(dāng)，都在的數(shù)量級。的數(shù)量級。因此可以因此可以被用來探測蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。被用來探測蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。X-rayProteinCrystal為什么要用衍射為什么要用衍射把光源換成X射線把透鏡換成X射線透鏡到目前為止人類還

7、沒有發(fā)現(xiàn)什么方法能夠讓到目前為止人類還沒有發(fā)現(xiàn)什么方法能夠讓X-射線發(fā)生折射。所以當(dāng)前射線發(fā)生折射。所以當(dāng)前只能通過衍射這種不那么直觀的方法來研究蛋白質(zhì)分子內(nèi)部構(gòu)造。只能通過衍射這種不那么直觀的方法來研究蛋白質(zhì)分子內(nèi)部構(gòu)造。什么是晶體什么是晶體晶體在宏觀上呈現(xiàn)出規(guī)則的幾何形狀NaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNa

8、ClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaClNaCl二維排列三維堆積晶體是一種具有長程、三維分子有序的固體。晶體是一種具有長程、三維分子有序的固體。小孔光柵衍射圖樣)hkl()lzkyhx(2cos| )hkl(F|V1)xyz(hkl如何根據(jù)衍射結(jié)果解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)如何根據(jù)衍射結(jié)果解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)參考 f(x) = A cos(2 x )hkl(i)lzkyhxi( 2exp| )hkl(F|V1)

9、xyz(hkl上式也可表示為：v 為電子密度，xyz 為實(shí)空間坐標(biāo)v V 為晶胞體積v |F(hkl)|2 = I(hkl)，I 代表衍射點(diǎn)的強(qiáng) 度，hkl 為衍射點(diǎn)坐標(biāo)v 代表初始相角hkf(x) = A cos(2x ) = 0 x12340 = /2x12340 = - x1234000對于一束對于一束X-射線射線 f(x) = A cos(2 x )來說，無論它的初始相角是多少，它在接收來說，無論它的初始相角是多少，它在接收屏上所形成的曝光點(diǎn)都是相同的。反之，我們只根據(jù)接收屏上的曝光點(diǎn)也是無法得屏上所形成的曝光點(diǎn)都是相同的。反之，我們只根據(jù)接收屏上的曝光點(diǎn)也是無法得知造成該曝光點(diǎn)的知造

10、成該曝光點(diǎn)的X-射線的初始相角信息的。射線的初始相角信息的。初始相角無法直接測量得到，但它又是求解電子密度時(shí)所必需的信息。這就是初始相角無法直接測量得到，但它又是求解電子密度時(shí)所必需的信息。這就是X-射射線晶體衍射法解析物質(zhì)結(jié)構(gòu)時(shí)所需要解決的核心問題線晶體衍射法解析物質(zhì)結(jié)構(gòu)時(shí)所需要解決的核心問題相位（相角）問題相位（相角）問題。解決相位問題的方法：v 同晶置換法 最原始的方法，包括多對同晶置換法和單對同晶置換法。需要在蛋白質(zhì)晶體中引入重原子，并且要求引入了重原子的晶體與未引入重原子的晶體的晶型基本相同。解析過程需要未引入重原子、引入了重原子，甚至引入了不同重原子的多顆晶體的多套衍射數(shù)據(jù)。v 反

11、常散射法 包括多波長反常散射法和單波長反常散射法。通常需要引入具有較強(qiáng)反常散射能力的原子，如硒原子。不需要多顆晶體但往往需要同一顆晶體在不同波長X-射線照射下的多套衍射數(shù)據(jù)。隨著技術(shù)的進(jìn)步，目前蛋白質(zhì)自身的硫原子也開始被用來作為反常散射源。v 分子置換法 需要同源性較高的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)模型，不需要多顆晶體，不需要多套衍射數(shù)據(jù)，方便快捷，但不能用來解析全新的結(jié)構(gòu)。主要技術(shù)流程圖蛋白質(zhì)結(jié)晶的必要條件蛋白質(zhì)結(jié)晶的必要條件v 蛋白質(zhì)分子必須均一（純化）均一的蛋白質(zhì)分子不均一（不純）的蛋白質(zhì)分子沉淀劑的作用沉淀劑的作用沉淀未飽和成核區(qū)過飽和區(qū)蛋白質(zhì)濃度沉淀劑濃度獲得蛋白質(zhì)晶體的方法獲得蛋白質(zhì)晶體的方法由

12、于蛋白質(zhì)分子體積大，分子表面情況復(fù)雜，極性不明顯，分子間作用力弱等原因，蛋白質(zhì)分子在達(dá)到過飽和的時(shí)候不容易有序排列形成晶體，而是容易隨機(jī)聚合形成沉淀。因此需要針對不同蛋白質(zhì)篩選各自的結(jié)晶條件。蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)：蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)：v 整批結(jié)晶法v 液液擴(kuò)散法v 透析法v 氣相擴(kuò)散法 a. 懸滴法 b. 座滴法 懸滴法懸滴法1m ml 蛋白溶液蛋白溶液1m ml 結(jié)晶溶液結(jié)晶溶液結(jié)晶溶液池結(jié)晶溶液池座滴法座滴法1m ml 蛋白溶液蛋白溶液1m ml結(jié)晶溶液結(jié)晶溶液結(jié)晶溶液池結(jié)晶溶液池?zé)o論是懸滴法還是座滴法，當(dāng)達(dá)到蒸汽平衡的時(shí)候，蛋白質(zhì)所在液滴里的無論是懸滴法還是座滴法，當(dāng)達(dá)到蒸汽平衡的時(shí)候，蛋白質(zhì)所在

13、液滴里的結(jié)晶溶液組分的濃度將會接近于池液的濃度。結(jié)晶溶液組分的濃度將會接近于池液的濃度。結(jié)晶溶液結(jié)晶溶液結(jié)晶溶液成分：v 沉淀劑 通常為不同分子量的聚乙二醇或者高濃度的硫酸銨、氯化鈉等。v 輔助分子 通常為低濃度的鹽v pH緩沖劑例如： Hampton Research Crystal Screen Kit #14 0.2M CaCl2 0.1M HEPES pH7.5 28% (v/v) PEG400Detergents and additives結(jié)晶條件的優(yōu)化結(jié)晶條件的優(yōu)化最初篩選得到的結(jié)晶條件往往不是該蛋白的最佳結(jié)晶條件。此時(shí)的蛋白質(zhì)晶體往往衍射能力很差，甚至沒有衍射。因此一般來說還需要

14、對該蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的方法就是把結(jié)晶溶液中的沉淀劑、輔助分子，結(jié)晶時(shí)的蛋白質(zhì)濃度在原濃度附近做一個(gè)梯度；相應(yīng)地，結(jié)晶溶液中的pH值也要在原值附近做一個(gè)梯度。在把這些梯度排列組合起來，從而找出一個(gè)最佳的結(jié)晶條件。優(yōu)化前優(yōu)化后衍射實(shí)例衍射實(shí)例缺點(diǎn)：樣品必須為晶體（單晶）,但生物大分子結(jié)晶困難,特別是膜蛋白和病毒等分子組裝體結(jié)晶更是困難.其次對于像病毒那樣大的分子組裝體,測量其精細(xì)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜. 原因有二:一是大晶胞含有的原子極多,X射線衍射點(diǎn)極多,常常無法區(qū)分、辨認(rèn)和探測;其二是大晶胞所產(chǎn)生的衍射點(diǎn)強(qiáng)度過弱,特別在高分辨時(shí),無法與背景區(qū)分. 基本原理：核磁共振現(xiàn)象( nuclear

15、magneticresonance spectroscopy ,NMR) 1946 年由哈佛大學(xué)的伯塞( E.M.Purcell) 和斯坦福大學(xué)的布洛赫(F.Bloch) 所領(lǐng)導(dǎo)的2個(gè)小組,用不同的方法在各自的實(shí)驗(yàn)室里觀察到的,伯塞爾使用的實(shí)驗(yàn)方法是吸收法,而布洛赫使用的是感應(yīng)法. 利用物理原理,通過對核磁共振譜線特征參數(shù)的測定來分析物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)。NMR 不破壞被測樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，是一種無損檢測方法。由于不同的原子核吸收不同的電磁波，因而通過測定和分析受測物質(zhì)對電磁波的吸收情況就可以判定它含有哪種原子，原子之間的距離有多大，并據(jù)此分析出它的三維結(jié)構(gòu)。以蛋白質(zhì)為例,它的二級結(jié)構(gòu)如螺旋,折

16、疊、轉(zhuǎn)角、環(huán)形和卷曲等,體現(xiàn)了蛋白質(zhì)分子主鏈原子在三維空間各種不同的排列規(guī)律性. 位于不同二級結(jié)構(gòu)域的原子核間距,原子核間的相互作用以及多肽段的動態(tài)特性,都直接反映蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的特征.這些具有不同結(jié)構(gòu)特征的原子核間距、肽鍵二面角、肽鍵的動態(tài)特性等都具有特征的核磁共振譜線. 因此,我們分析核磁共振譜就可以獲得蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu). 1H,13C,15N是核磁共振檢測的主要對象,各有不同的共振頻率,從而形成核磁共振氫譜、碳譜和氮譜三部分.核磁共振核磁共振(NuclearMagnetic Resonance -NMR)在水溶液中,大約有一半的蛋白質(zhì)鏈呈現(xiàn)出規(guī)則、緊密的三維結(jié)構(gòu) ,而另一半則非常松 。目

17、前,科學(xué)家已經(jīng)利用這一方法繪制出15 %20 %的已知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。最初,核磁共振技術(shù)主要用于核物理研究方面,用它測量各種原子核的磁矩,誤差僅是0. 003 %0. 005 %; 迄今,它已廣泛應(yīng)用于化學(xué)、食品、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域,已成為在這些領(lǐng)域開展研究工作的有力工具,甚至是某些領(lǐng)域(如:化學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、藥物學(xué)等) 常規(guī)分析中不可缺少的手段。1985 年,維特里希( Kurt Wthrich）等人公布了第一次利用NMR 法測定的溶液中蛋白質(zhì)-蛋白酶抑制劑IIA ( proteinase inhibitor IIA) 的結(jié)構(gòu)(如圖4 所示)。1990 年用NMR 測定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有

18、23 個(gè),而到1994 年一年測定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)上升到100個(gè)。1997 年,維特里希應(yīng)用NMR 方法測定的一種蛋白質(zhì)-蛋白感染素(prion protein) 的結(jié)構(gòu)。 核磁共振方法的最大特點(diǎn)是可以直接在溶液中測定自然狀態(tài)下的大分子三維空間結(jié)構(gòu)，其分辨率已接近012nm ,但因?yàn)榇蠓肿恿康纳锓肿拥暮舜殴舱駡D譜非常復(fù)雜,難以解釋,因此它只能測量分子量較小(15-25kDa)的生物分子,至今最大可測定35kDa 的生物分子; 其次在測定中要求樣品是高純度且數(shù)量相對較多,使樣品制備亦有困難;此外,核磁共振只能用于水溶液性的生物樣品,對膜蛋白或病毒等的組裝體、復(fù)合體就無法測定. 另一種方法稱為冷凍

19、電鏡計(jì)算機(jī)三維重構(gòu)方法或單顆粒技術(shù)（Cryo-EM）. 特點(diǎn):急速冷凍(103 -104 Ps) 樣品懸液,樣品被包埋在無定形的非晶態(tài)冰薄膜中,這樣既不損傷樣品,又可使樣品保持著自然狀態(tài),因而樣品制備簡單。 缺點(diǎn)：分辨率稍低. 研究的病毒樣品,目前分辨率接近0.17nm ,預(yù)計(jì)這幾年內(nèi)可達(dá)0.14nm. 核糖體可達(dá)1.10nm ,而離子通道可達(dá)2.10nm. 由于應(yīng)用冷凍電鏡與計(jì)算機(jī)重構(gòu)技術(shù)研究病毒三維結(jié)構(gòu)所需樣品制備簡單,對病毒的大小沒有限制,使其發(fā)展很快,至今已有100 多個(gè)病毒的三維結(jié)構(gòu)被冷凍電鏡計(jì)算機(jī)重構(gòu)方法所闡明,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過X射線晶體學(xué)的30-40種病毒的數(shù)量. 雖然其分辨率還有待提高

20、,但所提供的資料和數(shù)據(jù)對于生命科學(xué)的許多研究來說,已經(jīng)是十分寶貴和重要的依據(jù),甚至已經(jīng)滿足了某些研究的要求. 如果把這種研究方法與用X 射線單晶衍射所獲得的病毒衣殼高分辨三維結(jié)構(gòu)結(jié)合起來那就更有意義了. 冷凍電鏡計(jì)算機(jī)重構(gòu)方法雖然其發(fā)展歷史較晚,但特別有利于病毒、核糖體、離子通道等大的復(fù)合體、組裝體等的結(jié)構(gòu)與功能的研究,是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的新發(fā)展方向. 這些研究既是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的重要內(nèi)容,又是正在走向綜合的重要一步.Cryo-EM structure of prokaryotic 30S Translation Initiation Complex3.6-Angstrom cryoEM structure o