氣相色譜基本原理

1、分流 /不分流進(jìn)樣選至氣相色譜方法及應(yīng)用一、進(jìn)樣口結(jié)構(gòu)分流 /不分流進(jìn)樣口是毛細(xì)管GC 最常用的進(jìn)樣口，它既可用作分流進(jìn)樣，也可用作不分流進(jìn)樣口圖4-2 是典型的分流 /不分流進(jìn)樣口示意圖。從結(jié)構(gòu)上看，分流/不分流進(jìn)樣口與填充柱進(jìn)樣有明顯的不同，一是前者有分流氣出口及其控制裝置，二是除了進(jìn)樣口前有一個(gè)控制閥外，在分流氣路上還有一個(gè)柱前壓調(diào)節(jié)閥，二是二者使用的襯管結(jié)構(gòu)不同。而分流進(jìn)樣和不分流進(jìn)樣在操作參數(shù)的設(shè)置，對(duì)樣品的要求以及襯管結(jié)構(gòu)方面也有很大區(qū)別，下面分別討論之。二、分流進(jìn)樣(一 )載氣流路和襯管選擇分流進(jìn)樣時(shí)載氣流路如圖4-2a 所示。進(jìn)入進(jìn)樣口的載氣總流量由一個(gè)總流量閥控制，而后載氣分

2、成兩部分: 一是隔墊吹掃氣(1 3mL/min) ，二是進(jìn)入汽化室的載氣。進(jìn)入汽化室的載氣與樣品氣體混合后又分為兩部分：大部分經(jīng)分流出口放空，小部分進(jìn)樣色譜柱。以總流量為 104 m1/min 為例，如果隔墊吹掃氣流設(shè)置為3m1/min ，則另 101mL/min進(jìn)入汽化室。當(dāng)分流流量為100mL/min時(shí)。柱內(nèi)流量為lml/min ，這時(shí)分流比為100:1 。注意。此儀器設(shè)計(jì)將柱前壓調(diào)節(jié)閥置于分流氣路上，這就可在總流量不變的情況下，改變柱前壓。 柱前壓越高，柱流速越大，分析速度越快。而要在柱前壓不變(柱流速不變 )的條件下改變分流比，則必須調(diào)節(jié)總流最?？偭髁吭酱螅至鞅仍酱?。分流進(jìn)樣口可采用

3、多種襯管，用于分流進(jìn)樣的襯管大都不是直通的，管內(nèi)有縮徑處或者燒結(jié)板，或者有玻瑞珠，或者填充有玻璃毛。這主要是為了增大.與樣品接觸的比表面，保證樣品完全汽化 .減小分流歧視見下面關(guān)于分流歧視問(wèn)題的討論)。同時(shí)也是為了防止固體顆粒和不揮發(fā)的樣品組分進(jìn)入色譜柱。注意，填充物應(yīng)位于襯管的中間，即溫度最高的地方，也是注射器針尖所到達(dá)的地方，這樣對(duì)提高汽化效率， 減少注射器針尖對(duì)樣品的歧視更為有效。另外，玻璃毛活性較大，不適合于分析極性化合物。此時(shí)可用經(jīng)硅烷化處理的石英玻璃毛。襯管的上端常用“O”形硅橡膠環(huán)密封。用一段時(shí)間后該環(huán)會(huì)老化而造成漏氣。故要及時(shí)更換。當(dāng)進(jìn)樣口溫度超過(guò)400 時(shí)，最好采用石墨密封環(huán)

4、。(二 )樣品的適用性分流進(jìn)樣適合于大部分可揮發(fā)樣品，包括液體和氣體樣品，特別是對(duì)一些化學(xué)試劑(如將劑 )的分折。 因?yàn)槠渲幸恍┙M分會(huì)在主峰前流出。而且樣品不能稀釋、故分流進(jìn)樣住往是理想的選擇。 此外，在毛細(xì)管GC 的方法開發(fā)過(guò)程中，如果對(duì)樣品的組成不很清楚。也應(yīng)首先采用分流進(jìn)樣口對(duì)于一些相對(duì)“臟” 的樣品，更應(yīng)采用分流進(jìn)樣，因?yàn)榉至鬟M(jìn)樣時(shí)大部分樣品被放空， 只有一小部分樣品進(jìn)入色譜柱，這在很大程度上防止了柱污染。只是在分流進(jìn)樣不能滿足分析要求時(shí)（靈敏度太低），才考慮其他進(jìn)樣方式，如不分流進(jìn)樣和柱上進(jìn)_ 樣等?？傊?分流進(jìn)樣的適用范圍寬，靈話性很大。 分流比可調(diào)范圍廣，故成為毛細(xì)管GC 的首

5、選進(jìn)樣方式。三) 操作參數(shù)設(shè)置1.溫度進(jìn)樣口溫度應(yīng)接近于或等于樣品中最重組分的沸點(diǎn)，以保證樣品快速汽化，減小初始譜帶寬度。但溢度太高有使樣品組分分解的可能性。對(duì)于個(gè)未知的新樣品?？蓪⑦M(jìn)樣口溫度設(shè)置為300 度進(jìn)行試驗(yàn)。2.載氣流速常用毛細(xì)管GC 所用柱內(nèi)載氣線流速為：氦氣30 50cm/s ，氮?dú)?20 40cm/s ，氫氣 40 60cm/s 。實(shí)際流速可通過(guò)測(cè)定死時(shí)間來(lái)計(jì)算，通過(guò)調(diào)節(jié)柱前從來(lái)控制。對(duì)于分流進(jìn)樣，還要測(cè)定隔墊吹掃氣流量和分流流量，前者一般為2 3mL/min ，后者則要依據(jù)樣品情況 (如待側(cè)組分濃度等 )、進(jìn)樣量大小和分析要求來(lái)改變。常用分流比范圍為 20:1 200:1 ，

6、樣品濃度大或進(jìn)樣量大時(shí)，分流比可相應(yīng)增大，反之則減小。用大口徑柱時(shí)分流比小一些(或采用不分流進(jìn)樣 )。用微徑柱作快速 GC 分析時(shí)，分流比要求很大(如 1000:1 或更高 )。另一方面，分流比小時(shí)， 分流歧視 (見下面關(guān)于分流歧視問(wèn)題的討論)效應(yīng)可能小一些， 但初始譜帶 (主要是溶劑譜帶 )寬度要大一些。必要時(shí)可采用聚焦技術(shù)。而分流比大時(shí)，初始譜帶寬度小，但分流歧視效應(yīng)可能會(huì)增大。所以，在實(shí)際工作中應(yīng)據(jù)樣品情況和分析要求選擇一個(gè)合適的折衷點(diǎn)。3.進(jìn)樣量和進(jìn)樣速度分流進(jìn)樣的進(jìn)樣量一般不超過(guò)2L, 最好控制在0.5 L 以下，因?yàn)橐r管的容積有限，液體汽化時(shí)體積要膨脹數(shù)百倍(見表4-1) 。當(dāng)然。

7、進(jìn)樣量還和分流比是相關(guān)的，分流比大時(shí)，進(jìn)樣量可大一些。 至于進(jìn)樣速度應(yīng)當(dāng)越快越好，一是防止不均勻汽化，二是保持窄的初始譜帶寬度。因此，快速自動(dòng)進(jìn)樣往往比手動(dòng)進(jìn)樣的效果好。(四 )分流歧視問(wèn)題所謂分流歧視是指在一定分流比條件下，不同樣品組分的實(shí)際分流比是不同的，這就會(huì)造成進(jìn)入色譜柱的樣品組成不同于原來(lái)的樣品組成，從而影響定是分析的準(zhǔn)確度。因此，采用分流進(jìn)樣時(shí)必須注意這個(gè)問(wèn)題。那么，是什么因素造成分流歧視的呢？不均勻汽化是分流歧視的上要原因之一，即由于樣品中各組分的極性不同，沸點(diǎn)各異， 因而汽化速度各不相同。 理論上講， 只要汽化溫度足夠高，就能使樣品的全部組分迅速汽化。只要汽化室內(nèi)樣品處于均相氣

8、體狀態(tài)，分流歧視就是可以忽略的。 然而，實(shí)際上樣品在汽化室是處于一種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)， 即必須隨載氣流動(dòng)。 從汽化室汽化到進(jìn)入色譜柱的時(shí)間很短(以秒計(jì) )，沸點(diǎn)不同的組分到達(dá)分流點(diǎn)時(shí)，汽化狀態(tài)可能不完全相同。 這樣，由于分流流最遠(yuǎn)大于柱內(nèi)流量，汽化不太完全的組分就比完全汽化的組分可能多分流掉一些樣品。造成分流歧視的另外一個(gè)原因是不同樣品組分在載氣中的擴(kuò)散速度不同。而擴(kuò)散速度與溫度是成正比的。 所以。盡量使樣品快速汽化是消除分流歧視的重要措施，包括采用較高的汽化溫度，也包括使用合適的襯管。分流比的大小也會(huì)影響分流歧視口一般地講，分流比越大，越有可能造成分流歧視口所以，在樣品濃度和柱容量允許的條件下，分流

9、比小一些有利。至于分流比的測(cè)定定是很簡(jiǎn)單的，只要在分流出口用皂膜流量計(jì)測(cè)定分流流量，再測(cè)定柱內(nèi)流量 ( 因?yàn)橹鶅?nèi)流量很小，用皂膜流量計(jì)測(cè)定時(shí)誤差較大，故常用測(cè)定死時(shí)間的辦法進(jìn)行流量計(jì)算 )。二者之比即為分流比。嚴(yán)格地講， 兩個(gè)流量值應(yīng)校正到相同的溫度和壓力條件下， 才能獲得準(zhǔn)確的分流比。 實(shí)際工作中人們更關(guān)心的是分流比的重現(xiàn)性， 分流比則常用整數(shù)之比表示， 故一般不需要很準(zhǔn)確地測(cè)定。具體分析中要消除分流歧視， 還應(yīng)注意色譜柱的初始溫度盡可能高一些。 這樣，汽化溫度和柱箱溫度之差就會(huì)小一些， 因而樣品在汽化室經(jīng)歷的溫度梯度就會(huì)小一些， 可避免汽化后的樣品發(fā)生部分冷凝。 最后一個(gè)問(wèn)題是色譜柱的安裝

10、， 一是要保證柱入口端超過(guò)了分流點(diǎn)。 二是保證柱入口端處于汽化室襯管的中央，即汽化室內(nèi)色譜柱與襯管是同軸的 ( 參看上一章有關(guān)色譜柱安裝的內(nèi)容 )。盡管分流進(jìn)樣有歧視間題，但它仍然是毛細(xì)管GC 中最常用的進(jìn)樣方式。在實(shí)際工作中。 分流歧視是很難完全消除的，但只要操作是重現(xiàn)的，一定程度的歧視是重現(xiàn)的。就可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品的校準(zhǔn)來(lái)消除歧視效應(yīng)對(duì)定量精度的影響另一方面。 由于分流進(jìn)樣給檢測(cè)靈敏度提出了更高的要求， 而當(dāng)樣品濃度太低時(shí)。 分流進(jìn)樣并不總是合適的選擇。除了進(jìn)行樣品預(yù)處理 (如濃縮 )外。讀者很容易想到不分流進(jìn)樣。既然分流進(jìn)樣是因?yàn)橹萘啃　?樣品濃度高而不得不采用的方法。 那么低濃度樣品采

11、用不分流進(jìn)樣，以提高檢測(cè)靈敏度就是理所當(dāng)然的選擇了。三、不分流進(jìn)樣(一 ) 載氣流路和襯管選擇不分流進(jìn)樣與分流進(jìn)樣采用同一個(gè)進(jìn)樣口， 顧名思義， 不分流進(jìn)樣就是將分流氣路的電磁閥關(guān)閉 圖 4-2(b) ，讓樣品全部進(jìn)入色潛柱。這樣做的好處是顯而易見的，既可提高分析靈敏度，又能消除分流歧視的影響。 然而，在實(shí)際工作中、不分流進(jìn)樣的應(yīng)用遠(yuǎn)沒(méi)有分流進(jìn)樣普遍，只是在分流進(jìn)樣不能滿足分析要求時(shí) (主要是靈敏度要求 )，才考慮使用不分流進(jìn)樣。這是因?yàn)椴环至鬟M(jìn)樣的操作條件優(yōu)化較為復(fù)雜。 對(duì)操作技術(shù)的要求高。 其中一個(gè)最突出的問(wèn)題是樣品初始譜帶較寬 (樣品汽化后的體積相對(duì)于柱內(nèi)載氣流量太大 )。汽化的樣品中溶

12、劑是大量的， 不可能瞬間進(jìn)入色譜柱， 結(jié)果溶劑峰就會(huì)嚴(yán)重拖尾， 使早流出組分的峰被掩蓋在溶劑拖尾峰中 如圖 4-3(a) 所示 ，從而使分析變得困難，甚至不可能。有人也將這一現(xiàn)象叫做溶劑效應(yīng)。消除這種溶劑效應(yīng)可從幾個(gè)方面考慮，但就載氣的流路來(lái)說(shuō)，主要是采用所謂瞬間不分流技術(shù)。即進(jìn)樣開始時(shí)關(guān)閉分流電磁閥，使系統(tǒng)處于不分流狀態(tài)圖 4-2(b) 。待大部分汽化的樣品進(jìn)入色醉柱后，開啟分流閥，使系統(tǒng)處于分流狀態(tài)圖 4-2(a) 。這樣，汽化室內(nèi)殘留的溶劑氣體 (當(dāng)然包括一小部分樣品組分)就很快從分流出口放空，從而在很大程度上消除了溶劑拖尾 如圖 4-2(b) 所示 。分流狀態(tài)一直持續(xù)到分析結(jié)束，注射下

13、一個(gè)樣品時(shí)再關(guān)閉分流閥。所以我們說(shuō)，不分流進(jìn)樣并不是絕對(duì)不分流，而是分流與不分流的結(jié)合。這里，確定一個(gè)瞬間不分流時(shí)間 (從進(jìn)樣到開啟分流閥的時(shí)間)往往是分析成敗的關(guān)鍵。原則上講，這一時(shí)間應(yīng)足夠長(zhǎng)。以保證絕大部分樣品進(jìn)人色譜柱，避免分流歧視的影響；同時(shí)又要盡可能短， 以最大限度地消除溶劑搶尾、使早流出峰的分析更為準(zhǔn)確。這顯然是有矛盾的。在實(shí)際工作中，常常是根據(jù)樣品的具體情況(如溶劑沸點(diǎn)、 待測(cè)組分沸點(diǎn)和濃度等 )或操作條件來(lái)確定一個(gè)優(yōu)化的折衷點(diǎn)。研究結(jié)果表明，這一時(shí)間值一般在30 80S 之間。文獻(xiàn)報(bào)道多采用0.75min ，即從進(jìn)樣到開啟分流閥的時(shí)問(wèn)為0.75min ，通常能保證 95% 以上

14、的樣品進(jìn)入色譜柱，本節(jié)后而將介紹如何用實(shí)驗(yàn)方法確定優(yōu)化的不分流時(shí)間。襯管的尺寸是影響不分流進(jìn)樣性能的另一個(gè)重要因素。為了使樣品在汽化室盡可能少地稀釋，從而減小初始譜帶寬度，襯管的容積小一些有利，一般為0.25 1mL ，且最好使用直通式襯管。 當(dāng)用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣時(shí)，因進(jìn)樣速度快，樣品揮發(fā)快，故建議采用容積稍大一些的直通式襯管。 對(duì)于干凈樣品，襯管內(nèi)可不填充玻璃毛，對(duì)于相對(duì)臟的樣品，則需要填充玻瑞或石英毛， 以保證分析的重現(xiàn)性并保護(hù)色譜柱不被污染。但要注意， 由于不分流進(jìn)樣時(shí)樣品在汽化室滯留的時(shí)間比分流進(jìn)樣時(shí)長(zhǎng)，熱不穩(wěn)定化合物的分解可能性也大，故襯管和其中填充的石英毛都必須經(jīng)硅烷化處理，且要及時(shí)

15、清洗，更換和重新硅烷化。(二 )樣品的適用性不分流進(jìn)樣具有明顯高于分流進(jìn)樣的靈敏度，它通常用于環(huán)境分析(如水和大氣中痕量污染物的檢測(cè) )、食品中的農(nóng)藥殘留監(jiān)測(cè)，以及臨床和藥物分析等。這些藥品往往都比較臟，所以樣品的預(yù)處理是保護(hù)色譜柱所必須注意的問(wèn)題。此外，待測(cè)痕量組分如果在溶劑拖尾處出蜂，還可采用溶劑聚焦的方法來(lái)提高分析靈敏度。不分流進(jìn)樣對(duì)樣品溶劑有較嚴(yán)格的要求。因?yàn)檫M(jìn)樣口溫度、色譜柱初始溫度、瞬間不分流的時(shí)間和進(jìn)樣體積都與溶劑沸點(diǎn)有關(guān)。一般地講， 使用高沸點(diǎn)溶劑比低沸點(diǎn)溶劑有利，因?yàn)槿軇┓悬c(diǎn)高時(shí)， 容易實(shí)現(xiàn)溶劑聚焦，且可使用較高的色譜柱初始溫度，還可降低注射器針尖歧視以及汽化室的壓力突變。表

16、 4-2 列出了常見的溶劑及其沸點(diǎn)和實(shí)現(xiàn)溶劑聚焦宜采用的色譜柱初始溫度。另一方面， 洛劑的極性一定要與樣品的極性相匹配，且要保證溶劑在所有被測(cè)樣品組分之前出峰， 否則早流出的峰就會(huì)被溶劑的大峰掩蓋。同時(shí)，溶劑還要與固定相匹配，才能實(shí)現(xiàn)有效的溶劑聚焦。必要時(shí)可采用保留間隙管來(lái)達(dá)到聚焦的目的。對(duì)于高沸點(diǎn)痕量組分的分析，不分流進(jìn)樣就容易多了。此時(shí)可以不考慮溶劑的沸點(diǎn)，因?yàn)橛兄芏ㄏ嗑劢咕屯耆鼙ＷC窄的初始譜帶，采用高的初始柱溫還可縮短分析時(shí)間。事實(shí)上， 不分流進(jìn)樣應(yīng)是分析高沸點(diǎn)痕最組分的首選方法。(三 )操作參數(shù)設(shè)置(1) 進(jìn)樣口溫度 進(jìn)樣口溫度的設(shè)置可以比分流進(jìn)樣時(shí)稍低一些，因?yàn)椴环至鬟M(jìn)樣時(shí)樣品在汽

17、化室滯留時(shí)問(wèn)長(zhǎng)，汽化速度稍慢一些不會(huì)影響分離結(jié)果，還可通過(guò)溶劑聚焦和/或固定相聚焦來(lái)補(bǔ)償汽化速度慢的問(wèn)題。不過(guò)，進(jìn)樣口溫度的低限是能保證待測(cè)組分在瞬間不分流時(shí)完全汽化，否則，過(guò)低的進(jìn)樣口溫度會(huì)造成高沸點(diǎn)組分的損失，影響分析靈敏度和重現(xiàn)性。當(dāng)然，過(guò)高的溫度又會(huì)造成樣品的分解。因此，要根據(jù)樣品的具體情況優(yōu)化進(jìn)樣口溫度。而當(dāng)改變進(jìn)樣口溫度后，又必須重新優(yōu)化設(shè)置瞬間不分流時(shí)間 :.(2) 載氣流速 從減小初始譜帶寬度的角度考慮，不分流進(jìn)樣的載氣流速應(yīng)當(dāng)高一些，其上限應(yīng)以保證分離度為準(zhǔn)。分流出口的流量 (開啟分流閥后 )一般為 30 60mL/min 。只要開啟分流閥的時(shí)間設(shè)置正確，分流出口流最在此范圍

18、內(nèi)變化對(duì)分析結(jié)果的影響很小。(3) 進(jìn)樣量和進(jìn)樣速度 進(jìn)樣量一般不超過(guò) 2L 。進(jìn)樣量大時(shí)應(yīng)選用容積大的襯管， 否則會(huì)發(fā)生樣品倒灌。進(jìn)樣速度則應(yīng)快一些， 最好用自動(dòng)進(jìn)樣器。 若采用手動(dòng)進(jìn)樣， 進(jìn)樣速度的重現(xiàn)性會(huì)影響分析結(jié)果。(4) 瞬間不分流時(shí)間的實(shí)驗(yàn)確定方法如前文所述， 瞬間不分流時(shí)間(也有人叫分流延遲時(shí)間、溶劑吹掃時(shí)間 )的確定依賴于樣品和溶劑的性質(zhì)，襯管的容積、進(jìn)樣最，進(jìn)樣速度以及載氣流速。所以這一時(shí)問(wèn)的確定應(yīng)在其余所有條件都確定之后進(jìn)行。下面介紹一個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)確定方法。首先將這一時(shí)間設(shè)置長(zhǎng)一些擇一個(gè)待測(cè)組分的峰面積(90 120s) ，以保證全部樣品組分進(jìn)入色譜柱。對(duì)樣品進(jìn)行分析之后，

19、選(該峰的k 值應(yīng)大于5) 作為測(cè)定指標(biāo)，該峰面積值就代表100 的樣品進(jìn)入了色譜柱。然后逐步縮短不分流時(shí)間(如 70, 50, 30s) 分別進(jìn)樣分析，計(jì)算同一組分在不同溶劑吹掃時(shí)間條件下的峰面積與第一次分析的峰面積之比，直到此比值小于0.95, 此時(shí)的不分流時(shí)間為最短時(shí)間。最后，再進(jìn)一步微調(diào)不分流時(shí)，使同一組分的峰面積達(dá)到第一次分析時(shí)峰面積的95%-99 ，此時(shí)的吹掃時(shí)間即為最佳條件。對(duì)于高沸點(diǎn)樣品， 不分流時(shí)間長(zhǎng)一些有利于提高分析靈敏度。而不影響測(cè)定準(zhǔn)確度；對(duì)于低沸點(diǎn)樣品。則要盡可能使不分流時(shí)間短一些，最大限度地消除溶劑拖尾，以保證分析準(zhǔn)確度。對(duì)于熱不穩(wěn)定的化合物，最好用下節(jié)將要介紹的冷

20、柱上進(jìn)樣技術(shù)。什么叫內(nèi)標(biāo)法 ? 怎樣選擇內(nèi)標(biāo)物 ?內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí)，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰(shuí)和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標(biāo)法時(shí)， 在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)， 它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的峰面積與相對(duì)響應(yīng)值， 即可求出待測(cè)組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)， 內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。理想地說(shuō)，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一個(gè)能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準(zhǔn)確、 已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組

21、分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì) (如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應(yīng)特征， 最好是被分析物質(zhì)的一個(gè)同系物。當(dāng)然，在色譜分析條什下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。 需要指出的是， 在少數(shù)情況下， 分析人員可能比較關(guān)心化臺(tái)物在一個(gè)復(fù)雜過(guò)程中所得到的回收率， 此時(shí)，他可以使用一種在這種過(guò)程中很容易被完全回收的化臺(tái)物作內(nèi)標(biāo)，來(lái)測(cè)定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說(shuō)的選擇原則。在使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，有哪些因素會(huì)影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分的峰高或峰面積的比值?影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生

22、的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時(shí)出現(xiàn)。化學(xué)方面的因素包括：1、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好；2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，3、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。對(duì)于一個(gè)比較成熟的方法來(lái)說(shuō)，色譜方面的問(wèn)題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上常見的一些問(wèn)題 (如滲漏 )對(duì)絕對(duì)面積的影響比較大，對(duì)面積比的影響則要小一些，但如果絕對(duì)面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個(gè)重要的色譜問(wèn)題存在，比如進(jìn)樣量改變太大， 樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之間有很大的差別，檢測(cè)器非線性等。 進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變， 這樣才不致于造成檢測(cè)器和積分裝置飽和。如果認(rèn)為方法比較可靠，而色譜固看來(lái)也是正常的話， 應(yīng)著重檢查積分裝置和

23、設(shè)置、 斜率和峰寬定位。 對(duì)積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對(duì)恒定，在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意什么?在用內(nèi)標(biāo)法做色話定量分析時(shí)，先配制一定重量比的被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析，測(cè)量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)際樣品分析時(shí)所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用的條件一致，因此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等)，還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，各點(diǎn)并不完全落在直線上，此時(shí)應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏差，在使用過(guò)程中應(yīng)定期進(jìn)行單點(diǎn)校正，若所得值與平均值的偏差

24、小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在鉸短時(shí)期內(nèi)即產(chǎn)生變動(dòng)，則不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。一、內(nèi)標(biāo)法什么叫內(nèi)標(biāo)法 ?怎樣選擇內(nèi)標(biāo)物 ?內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí)，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰(shuí)和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標(biāo)法時(shí)， 在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)， 它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的峰面積與相對(duì)響應(yīng)值，即可求出待測(cè)組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)， 內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。理想地說(shuō)， 內(nèi)標(biāo)物應(yīng)

25、當(dāng)是一個(gè)能得到純樣的己知化合物， 這樣它能以準(zhǔn)確、 已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等 ) 、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分析物質(zhì)的一個(gè)同系物。當(dāng)然，在色譜分析條什下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較關(guān)心化臺(tái)物在一個(gè)復(fù)雜過(guò)程中所得到的回收率，此時(shí)，他可以使用一種在這種過(guò)程中很容易被完全回收的化臺(tái)物作內(nèi)標(biāo)，來(lái)測(cè)定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說(shuō)的選擇原則。在使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，有哪些因素會(huì)影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分的峰高或峰面積的比值?影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分

26、峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、面的三類。由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時(shí)出現(xiàn)。化學(xué)方面的因素包括：1、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好；2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，3、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。色譜方面的和儀器方對(duì)于一個(gè)比較成熟的方法來(lái)說(shuō)， 色譜方面的問(wèn)題發(fā)生的可能性更大一些， 色譜上常見的一些問(wèn)題 (如滲漏 )對(duì)絕對(duì)面積的影響比較大，對(duì)面積比的影響則要小一些，但如果絕對(duì)面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個(gè)重要的色譜問(wèn)題存在，比如進(jìn)樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之間有很大的差別，檢測(cè)器非線性等。進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測(cè)器

27、和積分裝置飽和。如果認(rèn)為方法比較可靠，而色譜固看來(lái)也是正常的話，應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置、斜率和峰寬定位。 對(duì)積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變， 而峰高比保持相對(duì)恒定在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意什么?在用內(nèi)標(biāo)法做色話定量分析時(shí)，先配制一定重量比的被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析，測(cè)量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)際樣品分析時(shí)所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用的條件一致，因此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等)，還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，各點(diǎn)并不完全落在直線上，此時(shí)應(yīng)求出面積比和重量比

28、的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏差，在使用過(guò)程中應(yīng)定期進(jìn)行單點(diǎn)校正，若所得值與平均值的偏差小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在鉸短時(shí)期內(nèi)即產(chǎn)生變動(dòng)，則不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。二、外標(biāo)法用待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì)，以對(duì)照物質(zhì)和樣品中待測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。 此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。工作曲線法是用對(duì)照物質(zhì)配制一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。 在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對(duì)照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測(cè)組分的信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，或用回歸方程計(jì)算， 工作曲線法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說(shuō)明存在系

29、統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時(shí)，可用外標(biāo)一點(diǎn)法(直接比較法 )定量。外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對(duì)照品溶液對(duì)比測(cè)定樣品溶液中i 組分的含量。 將對(duì)照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣，測(cè)得峰面積的平均值，用下式計(jì)算樣品中i 組分的量：W A(W) (A)式中 W 與 A 分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含i 組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W)及(A) 分別代表在對(duì)照品溶液進(jìn)樣體積中含純品 i 組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標(biāo)法方法簡(jiǎn)便，不需用校正因子， 不論樣品中其他組分是否出峰， 均可對(duì)待測(cè)組分定量。 但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響。 此外，為了降低外標(biāo)一點(diǎn)法的實(shí)驗(yàn)誤差， 應(yīng)盡量使配制

30、的對(duì)照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。外標(biāo)法externalstandardmethod色譜分析中的一種定量方法，它不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測(cè)樣品中， 而是在與被測(cè)樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測(cè)定，把得到的色譜峰面積與被測(cè)組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測(cè)組分的含量。外標(biāo)物與被測(cè)組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度，分析時(shí)外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測(cè)物濃度相接近，以利于定量分析的準(zhǔn)確性。三、定量分析中怎樣選擇內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法(來(lái)源：藥物分析網(wǎng)）選一與欲測(cè)組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標(biāo)物（當(dāng)然是樣品中沒(méi)有的組分），然后配制欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣得相對(duì)校正因子。再將內(nèi)標(biāo)物加入欲測(cè)組分的樣品中，進(jìn)

31、樣后測(cè)得欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的定量參數(shù)。用內(nèi)標(biāo)法公式計(jì)算即可。內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中，根據(jù)被測(cè)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來(lái)計(jì)算被測(cè)組分的含量。選擇內(nèi)標(biāo)物有 4 個(gè)要求： 1.內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離； 3.加入內(nèi)標(biāo)物的量應(yīng)接近于被測(cè)組分；4.色譜峰的位置應(yīng)與被測(cè)組分的色譜峰的位置相近，或在幾個(gè)被測(cè)組分色譜峰中間。內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，由于通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分的峰面積的相對(duì)值來(lái)進(jìn)行計(jì)算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)是操作程序

32、較為麻煩，每次分析時(shí)內(nèi)標(biāo)物和試樣都要準(zhǔn)確稱量， 有時(shí)尋找合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難。外標(biāo)法簡(jiǎn)便， 但進(jìn)樣量要求十分準(zhǔn)確，要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的操作條件下進(jìn)行，否則造成分析誤差， 得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對(duì)著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問(wèn)題，我想簡(jiǎn)單而有效進(jìn)行定量分析來(lái)滿足要求才是最重要的1、以前做過(guò)很多醫(yī)藥、 農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒(méi)有自動(dòng)進(jìn)樣器，用外標(biāo)法定量， 確實(shí)重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差，結(jié)果經(jīng)常受到搞合成同事的質(zhì)疑。其實(shí)，仔細(xì)分析原因不一定就是外標(biāo)法不適合這種定量分析，首先我們的

33、實(shí)驗(yàn)室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當(dāng)（能否使樣品盡可能的汽化） 、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對(duì)稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒(méi)有其它色譜峰的干擾、選用什么進(jìn)樣方式（如快速進(jìn)樣還是熱針進(jìn)樣）等等因素的影響都需要考慮， 如果這些因素都考慮了， 按照 GMP 方法驗(yàn)證對(duì)于精密度的要求，同一樣品進(jìn) 6 針以上的 RSD 和配制 6 個(gè)樣品的定量結(jié)果 RSD 都能滿足小于1.5% 的要求，那么這個(gè)方法用外標(biāo)法就是完全適用的，但是前面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談?wù)撨@個(gè)方法是否適用就有失偏頗了。在做過(guò)的許多出口產(chǎn)品的定量分

34、析方法當(dāng)中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗(yàn)證過(guò)的方法，內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都有 （他們用的都是自動(dòng)進(jìn)樣）精密度都能滿足 RSD 小于 1.5% 的要求，當(dāng)一個(gè)方法能夠滿足測(cè)試要求的時(shí)候，無(wú)論內(nèi)標(biāo)外標(biāo)，都是可行的，當(dāng)然有一個(gè)分析成本和分析時(shí)間的問(wèn)題，內(nèi)標(biāo)的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當(dāng)然要比外標(biāo)要高和麻煩一些了。而有些時(shí)候， 可能受你實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響，達(dá)不到一定的要求，而還必須進(jìn)行定量分析，有時(shí)外標(biāo)的結(jié)果可能就要差一些，這時(shí)， 你可能就要考慮用內(nèi)標(biāo)法了，可以排除手動(dòng)進(jìn)樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時(shí)內(nèi)標(biāo)可能就顯示出它的優(yōu)勢(shì)來(lái)了。2、上面已經(jīng)提到當(dāng)做方法驗(yàn)

35、證的時(shí)候，當(dāng)同一樣品配制6 個(gè)樣品溶液用所選用的外標(biāo)法進(jìn)行定量的時(shí)候，RSD 都滿足 1.5% 的要求時(shí)，也分為兩種情況，小于1% 和大于 1% 小于 1.5% 。如果 RSD 的結(jié)果小于1% ，那這個(gè)方法就沒(méi)有什么可以懷疑的了；如果RSD 的結(jié)果大于 1% 而在1.5% 略低一些的范圍活動(dòng)時(shí)，這個(gè)方法的可行性就將受到質(zhì)疑，畢竟這是方法驗(yàn)證，你就要考慮上面1 所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSD 還是在 1.5% 附近，就要嘗試內(nèi)標(biāo)了，如果內(nèi)標(biāo)結(jié)果的RSD 很好，就證明你的這個(gè)方法受實(shí)驗(yàn)條件的影響很大，只能用內(nèi)標(biāo)了， 或者干脆將原方法做大的變動(dòng)，再嘗試用外標(biāo)法測(cè)試。3、而

36、對(duì)于微量分析，比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等，根據(jù)不同的限量標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多，RSD 有時(shí)可以允許達(dá)到10% 甚至更高，這時(shí)可能外標(biāo)法有更大的應(yīng)用空間4、單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，個(gè)人認(rèn)為還是內(nèi)標(biāo)優(yōu)于外標(biāo)。曾經(jīng)做過(guò)一個(gè)中間體二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺為內(nèi)標(biāo)，RTX-5amine （堿改性） 15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析，將配制好的控制溶液（含有內(nèi)標(biāo)物）自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)6 針，目的物（二氨基丙醇）與內(nèi)標(biāo)物（二乙醇胺）峰面積比率的RSD 為 0.18% ，而只對(duì)這六針樣品的目的物峰（二氨基丙醇）面積求RSD ，結(jié)果

37、為0.71% ，通過(guò)這一實(shí)例的結(jié)果大家就會(huì)發(fā)現(xiàn)到底哪個(gè)方法精密度更好了，當(dāng)然是內(nèi)標(biāo)更好了。當(dāng)然這個(gè)化合物的檢測(cè)方法最后根據(jù)上面的驗(yàn)證數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)定量都是可以的，實(shí)驗(yàn)室可以自由選擇。但內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)精密度結(jié)果的差異是顯然存在的事實(shí)。結(jié)論： 應(yīng)用外標(biāo)法能夠滿足要求，首選還是外標(biāo)法了，畢竟簡(jiǎn)單而省事。對(duì)于精密度要求比較高、 結(jié)果準(zhǔn)確度會(huì)產(chǎn)生重大影響、實(shí)驗(yàn)室條件不是很理想的等等條件下，用內(nèi)標(biāo)法還是必要的。 無(wú)論應(yīng)用那種方法，方法的驗(yàn)證和確認(rèn)都是很重要的，只要是按照程序經(jīng)過(guò)驗(yàn)證和確認(rèn)的方法，都有其應(yīng)用的空間的。氫火焰離子化檢測(cè)器1958 年 Mewillan和 Harley 等分別研制成功氫火焰離子化檢

38、側(cè)器（ FID ），它是典型的破壞性、質(zhì)量型檢測(cè)器， 是以氫氣和空氣燃燒生成的火焰為能源，當(dāng)有機(jī)化合物進(jìn)入以氫氣和氧氣燃燒的火焰， 在高溫下產(chǎn)生化學(xué)電離，電離產(chǎn)生比基流高幾個(gè)數(shù)量級(jí)的離子，在高壓電場(chǎng)的定向作用下，形成離子流，微弱的離子流（10-12 10-8A ）經(jīng)過(guò)高阻（ 106 1011 ）放大，成為與進(jìn)入火焰的有機(jī)化合物量成正比的電信號(hào)，因此可以根據(jù)信號(hào)的大小對(duì)有機(jī)物進(jìn)行定量分析。氫火焰檢測(cè)器由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、性能優(yōu)異、穩(wěn)定可靠、操作方便，所以經(jīng)過(guò)40 多年的發(fā)展，今天的 FID 結(jié)構(gòu)仍無(wú)實(shí)質(zhì)性的變化。其主要特點(diǎn)是對(duì)幾乎所有揮發(fā)性的有機(jī)化合物均有響應(yīng)，對(duì)所有徑類化合物（碳數(shù)3）的相對(duì)響應(yīng)值幾

39、乎相等，對(duì)含雜原子的烴類有機(jī)物中的同系物（碳數(shù)3）的相對(duì)響應(yīng)值也幾乎相等。這給化合物的定量帶來(lái)很大的方便，而且具有靈敏度高（10-13 10-10g/s ），基流?。?10-14 10-13A ），線性范圍寬 （106 107 ），死體積小 （ 1L），響應(yīng)快（ 1ms ），可以和毛細(xì)管柱直接聯(lián)用，對(duì)氣體流速、 壓力和很度變化不敏感等優(yōu)點(diǎn)，所以成為應(yīng)用最廣泛的氣相色譜檢測(cè)器。其主要缺點(diǎn)是需要三種氣源及其流速控制系統(tǒng)，尤其是對(duì)防爆有嚴(yán)格的要求。氫火焰離子化檢測(cè)器的結(jié)構(gòu)氫火焰離子化檢測(cè)器（FID ）由電離室和放大電路組成，分別如圖2-9(a) ， (b) 所示。FID 的電離室由金屬圓筒作外罩，底座中心有噴嘴; 噴嘴附近有環(huán)狀金屬圈(極化極，又稱發(fā)射極 )，上端有一個(gè)金屬圓簡(jiǎn)(收集極 ) 。兩者間加90 300V 的直流電壓， 形成電離電場(chǎng)加速電離的離子。收集極捕集的離子硫經(jīng)放大器的高組產(chǎn)生信號(hào)、放大后物送至數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)；燃燒氣、輔助氣和色譜柱由底座引入；燃燒氣及水蒸氣由外罩上方小孔逸出。電子俘獲檢測(cè)器及檢測(cè)方法節(jié)選自： 色譜分析方法應(yīng)用電子俘獲檢測(cè)器（ECD ）是靈敏度最高的氣相色譜檢測(cè)器，同時(shí)又是最早出現(xiàn)的選擇性檢測(cè)器。它僅對(duì)那些能俘獲電子