流式基礎(chǔ)知識(shí)課件

1、流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)流式基礎(chǔ)知識(shí)流式細(xì)胞術(shù)？流式細(xì)胞術(shù)？對(duì)于處在流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或顆粒各項(xiàng)特性進(jìn)行檢測(cè)flow cyto metryflow cyto metryinmotioncellmeasure 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 速度快(10000cells/s) 特異性強(qiáng)，靈敏度高( mrd:1/10000 ) 多參數(shù)分析、活細(xì)胞分選 研究對(duì)象研究對(duì)象: : 單細(xì)胞懸液?jiǎn)渭?xì)胞懸液 可檢測(cè)的樣本種類多樣：外周血、骨髓、細(xì)胞穿刺液、洗脫液、實(shí)體組織、培養(yǎng)細(xì)胞、藻類等2流式基礎(chǔ)知識(shí)流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)3流式基礎(chǔ)知識(shí)facsverseaccuri c6lsr forttesa現(xiàn)代流式細(xì)胞儀現(xiàn)代流式細(xì)胞儀(flow

2、 cytometer)4流式基礎(chǔ)知識(shí)fl2 pesscfsc電子系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)fl3 percp, cy5 fl1 fitclight detectors液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)laser流式細(xì)胞儀工作流程流式細(xì)胞儀工作流程5流式基礎(chǔ)知識(shí)流式細(xì)胞儀的構(gòu)造流式細(xì)胞儀的構(gòu)造1. 細(xì)胞樣本成單列依次通過光檢測(cè)區(qū) 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)2. 激發(fā)并收集各種光信號(hào)3. 光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，數(shù)字化處理4. 數(shù)字信號(hào)傳入計(jì)算機(jī) 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng) 分選系統(tǒng)分選系統(tǒng)5. 活細(xì)胞分選6流式基礎(chǔ)知識(shí)液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)流動(dòng)室（流動(dòng)室（flow cellflow cell）lasersample流

3、體動(dòng)力學(xué)聚焦鞘液：sheathsheathsample streamcell7流式基礎(chǔ)知識(shí) 樣本流和鞘液流的驅(qū)動(dòng)一般采用加正壓的方法 鞘液壓力恒定，流速不變 通過調(diào)節(jié)樣本壓力調(diào)節(jié)樣本進(jìn)樣速率液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)8流式基礎(chǔ)知識(shí)調(diào)節(jié)樣本進(jìn)樣速度樣本流與鞘液壓力差改變，樣本流直徑改變，細(xì)胞間距改變10 psi10 psi10 psi10 psi10 psi10.2 psi10.4 psi10.8 psi壓力差 樣本流 進(jìn)樣速度 分辨率分辨率hihilolomedmed9流式基礎(chǔ)知識(shí)low pressurehigh pressure細(xì)胞周期細(xì)胞周期fl301024204830724096cou

4、nt300280260240220200180160140120100806040200.g0/g1 cv= 2. 42g2/ms phaseg0/g1fl301024204830724096count340320300280260240220200180160140120100806040200go/g1 cv= 7. 79.go/g1 cv= 7. 7910流式基礎(chǔ)知識(shí)流式細(xì)胞儀的構(gòu)造流式細(xì)胞儀的構(gòu)造1. 細(xì)胞樣本成單列依次通過光檢測(cè)區(qū)2. 激發(fā)并收集各種光信號(hào) 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)11流式基礎(chǔ)知識(shí)光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 激發(fā)光學(xué)系統(tǒng):激發(fā)光源激光透鏡和反射鏡將激光引導(dǎo)到檢測(cè)區(qū)域

5、接收光學(xué)系統(tǒng):濾光片等將產(chǎn)生的光信號(hào)引導(dǎo)到對(duì)應(yīng)的光學(xué)接收器12流式基礎(chǔ)知識(shí)激發(fā)光學(xué)系統(tǒng): 將激光引導(dǎo)到檢測(cè)區(qū)域，產(chǎn)生光信號(hào)激光激光單波長(zhǎng)高強(qiáng)度高穩(wěn)定488 nm blue488 nm blue633 nm red633 nm red405 nm violet405 nm violetlight signals光學(xué)棱鏡光學(xué)棱鏡13流式基礎(chǔ)知識(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)信號(hào)流式細(xì)胞儀檢測(cè)信號(hào)injector tipfluorescencesignalsfocused laserbeamsheathsheath fluidfluidlaser beam 1. 散射光信號(hào) 2.染色過細(xì)胞的熒光信號(hào) 前向角散射光(

6、fsc) 側(cè)向角散射光(ssc)360度立體角14流式基礎(chǔ)知識(shí)通過流式細(xì)胞儀我們可以得到通過流式細(xì)胞儀我們可以得到- 相對(duì)細(xì)胞大小 （前向角散射光-fsc） 相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度 （側(cè)向角散射光-ssc） 染色過細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度 （熒光-fluoresent light）15流式基礎(chǔ)知識(shí)前向角散射光（前向角散射光（fscfsc）forward (angle light) scatterforward (angle light) scatter fsc信號(hào)收集方向與激光束相平行 fsc與被測(cè)細(xì)胞或顆粒相對(duì)大小及表面積相關(guān) fals sensorfals sensorlaserlaser

7、16流式基礎(chǔ)知識(shí)前向角散射光（前向角散射光（fscfsc）fsc is proportional to relative size & cell-surface area17流式基礎(chǔ)知識(shí)側(cè)向角散射光（側(cè)向角散射光（sscssc）side-scattered lightside-scattered light (90 degree light (90 degree light scatter)scatter) ssc信號(hào)收集方向與激光束相垂直（90） ssc與被測(cè)細(xì)胞或顆粒內(nèi)部顆粒度和結(jié)構(gòu)復(fù)雜度相關(guān)fals sensorfals sensor90ls sensor90ls sensorlaser

8、laser18流式基礎(chǔ)知識(shí)側(cè)向角散射光（側(cè)向角散射光（sscssc）ssc is proportional to cell granularity or internal complexity.19流式基礎(chǔ)知識(shí) 散射光（散射光（fsc & sscfsc & ssc） 散射光能被用來區(qū)分不同細(xì)胞群體的基本形態(tài)上的差異 通常使用“散點(diǎn)圖”來看散射光信號(hào) 散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒的數(shù)據(jù)20流式基礎(chǔ)知識(shí)eg. major leucocyte subpopulations can be differentiated using fsc and ssc.figure: cell subpopul

9、ations based on fsc vs sscfigure: cell subpopulations based on fsc vs sscdual parameter dot-plot21流式基礎(chǔ)知識(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)信號(hào)流式細(xì)胞儀檢測(cè)信號(hào)injector tipfluorescencesignalsfocused laserbeamsheathsheath fluidfluidlaser beam 1. 散射光信號(hào) 2.染色過細(xì)胞的熒光信號(hào) 自發(fā)熒光信號(hào)特異性熒光信號(hào)22流式基礎(chǔ)知識(shí)熒光信號(hào)熒光信號(hào)（ fluoresent lightfluoresent light ）23流式基礎(chǔ)知識(shí)雙

10、色熒光散點(diǎn)圖雙色熒光散點(diǎn)圖24流式基礎(chǔ)知識(shí)熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度（ fluoresence intensityfluoresence intensity） 熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表被測(cè)細(xì)胞膜表面抗原強(qiáng)度或細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)濃度。25流式基礎(chǔ)知識(shí)熒光信號(hào)熒光信號(hào)（ fluoresent lightfluoresent light ）熒光信號(hào)收集方向與激光束相垂直（90）freqfluorescencefals sensorfals sensorfluorescence detectorfluorescence detector( fl1,fl2,fl3,fl4)( fl1,fl2,fl3,fl4)接收光學(xué)系統(tǒng)接收光

11、學(xué)系統(tǒng)26流式基礎(chǔ)知識(shí)接收光學(xué)系統(tǒng)：接收光信號(hào),并將光信號(hào)引導(dǎo)到對(duì)應(yīng)的接收器中光學(xué)濾片光學(xué)濾片460 500 540460 500 540460 500 540longpass shortpass bandpass( 500+/- 25 )27流式基礎(chǔ)知識(shí)facscalibur光路圖每個(gè)探測(cè)器前往往為bp，所以每個(gè)探測(cè)器只能接收特定波長(zhǎng)范圍的光信號(hào)fl1:515nm - 545nm28流式基礎(chǔ)知識(shí)光學(xué)探測(cè)器光電二極管光電二極管 -fsc photodiodes 光電倍增管光電倍增管 - ssc & fluoresence photomultiplier tubes (pmts)光電轉(zhuǎn)換器：光電

12、轉(zhuǎn)換器： 將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)29流式基礎(chǔ)知識(shí)流式細(xì)胞儀的構(gòu)造流式細(xì)胞儀的構(gòu)造3. 光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，數(shù)字化處理1. 細(xì)胞樣本成單列依次通過光檢測(cè)區(qū)2. 激發(fā)并收集各種光信號(hào) 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)30流式基礎(chǔ)知識(shí)電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)l 將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)（模擬信號(hào)）l將模擬信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)l 計(jì)算每個(gè)脈沖峰l和計(jì)算機(jī)連接以傳出數(shù)據(jù)將光信號(hào)成比例的轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，并進(jìn)行數(shù)字化處理后傳入計(jì)算機(jī)31流式基礎(chǔ)知識(shí)光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)pmt電壓 電信號(hào) 32流式基礎(chǔ)知識(shí)電壓脈沖的產(chǎn)生模擬信號(hào)timevoltagetimevoltagetimevoltag

13、e1當(dāng)微粒通過激光束時(shí)，脈沖開始。此時(shí)，激光強(qiáng)度和信號(hào)強(qiáng)度都很低。2當(dāng)微粒達(dá)到激光束中間時(shí)，脈沖達(dá)到最大強(qiáng)度或者高度，此時(shí)激光束和信號(hào)強(qiáng)度都最高。此時(shí)測(cè)定峰值強(qiáng)度或者脈沖高度。3當(dāng)微粒離開激光束時(shí)，脈沖減弱。33流式基礎(chǔ)知識(shí)計(jì)算一個(gè)電壓脈沖峰timevoltspulse areapulse heightpulse width0 面積是對(duì)熒光光通量進(jìn)行積分測(cè)量的結(jié)果 寬度=面積/高度，與顆粒通過激光照射區(qū)的時(shí)間成正比 特定參數(shù)可選擇面積、寬度信號(hào)（dna含量分析）34流式基礎(chǔ)知識(shí)模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)35流式基礎(chǔ)知識(shí)流式細(xì)胞儀的構(gòu)造流式細(xì)胞儀的構(gòu)造3. 光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，數(shù)字化處理4. 數(shù)字信

14、號(hào)傳入計(jì)算機(jī)1. 細(xì)胞樣本成單列依次通過光檢測(cè)區(qū)2. 激發(fā)并收集各種光信號(hào) 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)36流式基礎(chǔ)知識(shí)數(shù)據(jù)的獲取表現(xiàn)37流式基礎(chǔ)知識(shí)專業(yè)軟件中的數(shù)據(jù)表現(xiàn)單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖 雙參數(shù)散點(diǎn)圖雙參數(shù)散點(diǎn)圖 三維點(diǎn)圖三維點(diǎn)圖等高圖 密度圖38流式基礎(chǔ)知識(shí)設(shè)門（gating）平均熒光強(qiáng)度百分比39流式基礎(chǔ)知識(shí)流式細(xì)胞儀的構(gòu)造流式細(xì)胞儀的構(gòu)造1. 細(xì)胞樣本成單列依次通過光檢測(cè)區(qū)2. 激發(fā)并收集各種光信號(hào)3. 光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，數(shù)字化處理4. 數(shù)字信號(hào)傳入計(jì)算機(jī) 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng) 分選

15、系統(tǒng)分選系統(tǒng)5. 活細(xì)胞分選40流式基礎(chǔ)知識(shí)分選系統(tǒng)分選系統(tǒng)檢測(cè)加電偏轉(zhuǎn)收集41流式基礎(chǔ)知識(shí)reviewreviewsorting42流式基礎(chǔ)知識(shí)review questions在儀器設(shè)置中調(diào)高 red參數(shù)的電壓，左圖中群體會(huì)發(fā)生什么變化？43流式基礎(chǔ)知識(shí)如何進(jìn)行流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)？如何進(jìn)行流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)？1. 樣本處理2. 熒光染料的選擇3. 染色4. 數(shù)據(jù)收集和分析44流式基礎(chǔ)知識(shí)1. 樣本處理單細(xì)胞懸液?jiǎn)渭?xì)胞懸液細(xì)胞懸液： 直接使用外周血、骨髓：最接近生理狀況，操作簡(jiǎn)便，樣本用血量小 灌洗液、體腔積液 培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞系實(shí)體組織： 病理組織：新鮮樣本/石蠟包埋樣本 針吸組織：新鮮樣本45流式基礎(chǔ)知

16、識(shí)2. 選擇合適的熒光染料 必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配備的激光器所激發(fā) 激發(fā)光譜必須在探測(cè)器能夠接收的合適范圍內(nèi) 根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱選擇熒光抗體 熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少46流式基礎(chǔ)知識(shí)熒光信號(hào)熒光信號(hào)（ fluoresent lightfluoresent light ）47流式基礎(chǔ)知識(shí)fluorescein (fitc)400 nm500 nm600 nm700 nmr el at i ve i nt ensi t ywavelength300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm48流式基礎(chǔ)知識(shí)

17、300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nmphycoerytherin (pe)49流式基礎(chǔ)知識(shí)allophycocyanin (apc)300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm50流式基礎(chǔ)知識(shí)2. 選擇合適的熒光染料 必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配備的激光器所激發(fā) 激發(fā)光譜必須在探測(cè)器能夠接收的合適范圍內(nèi) 根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱選擇熒光抗體 熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少51流式基礎(chǔ)知識(shí)facscalibur光路圖每

18、個(gè)探測(cè)器前往往為bp，所以每個(gè)探測(cè)器只能接收特定波長(zhǎng)范圍的光信號(hào)fl1:515nm - 545nm52流式基礎(chǔ)知識(shí)2. 選擇合適的熒光染料 必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配備的激光器所激發(fā) 激發(fā)光譜必須在探測(cè)器能夠接收的合適范圍內(nèi) 根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱選擇熒光抗體 熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少53流式基礎(chǔ)知識(shí)2. 選擇合適的熒光染料 必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配備的激光器所激發(fā) 激發(fā)光譜必須在探測(cè)器能夠接收的合適范圍內(nèi) 根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱選擇熒光抗體 熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少54流式基礎(chǔ)知識(shí)55流式基礎(chǔ)知識(shí)熒光光譜重疊與補(bǔ)償530/30585/42利用電子術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號(hào)加以扣除的技術(shù)稱“熒光補(bǔ)償”56流式基礎(chǔ)知識(shí)熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償補(bǔ)償前補(bǔ)償前 補(bǔ)償后補(bǔ)償后57流式基礎(chǔ)知識(shí)2. 選擇合適的熒光染料 必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配備的激光器所激發(fā) 激發(fā)光譜必須在探測(cè)器能夠接收的合適范圍內(nèi) 根據(jù)抗原表達(dá)強(qiáng)弱選擇熒光抗體 熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少58流式基礎(chǔ)知識(shí)59流式基礎(chǔ)知識(shí)3.染色 體積 溫度 孵育時(shí)間 對(duì)照60流式基礎(chǔ)知識(shí)4. 數(shù)據(jù)收集和分析1) 畫圖（直方圖，散點(diǎn)圖）2) 調(diào)整儀器