土源性線蟲和食源性寄生蟲檢測方法

1、土源性線蟲和食源性寄生蟲檢土源性線蟲和食源性寄生蟲檢測方法測方法20162016年年5 5月月2929日日一、改良加藤厚涂片法改良加藤厚涂片法二、透明膠紙肛拭法二、透明膠紙肛拭法三、三、試管濾紙培養(yǎng)法試管濾紙培養(yǎng)法四、土壤中鉤蚴分離改良方法四、土壤中鉤蚴分離改良方法五、土壤中人蛔蟲卵檢查及活力測定方法五、土壤中人蛔蟲卵檢查及活力測定方法六、豬體囊尾蚴檢測方法六、豬體囊尾蚴檢測方法七、肉類中旋毛蟲檢驗方法七、肉類中旋毛蟲檢驗方法八、囊尾蚴病和旋毛蟲病血清學檢測方法八、囊尾蚴病和旋毛蟲病血清學檢測方法一、改良加藤厚涂片法一、改良加藤厚涂片法加藤厚涂片法是50年代日本人Kato首先提出，是用在甘油透

2、明液中浸泡過的親水玻璃紙?zhí)娲w玻片。七十年代Katz設計出圓孔卡片用于定量，此后稱為改良加藤厚涂片法。八十年代起，中國疾控中心寄生蟲病所對定量板進行了多次改進。檢出率高，操作簡便、適用于糞便中各種寄生蟲卵檢測。1988年至今我國實施的大規(guī)模寄生蟲病調查，糞檢用的都是該方法。背景一、改良加藤厚涂片法一、改良加藤厚涂片法透明液（蒸餾水透明液（蒸餾水100ml純甘油純甘油100ml3%孔雀綠孔雀綠1ml);親水性透明玻璃紙親水性透明玻璃紙( (2540mm) )需在透明液中浸泡需在透明液中浸泡2424小時小時 以上；以上；尼龍絹片（尼龍絹片（80目）裁剪大小目）裁剪大小55cm；圓臺形孔塑料定量板；

3、圓臺形孔塑料定量板；塑料刮片。塑料刮片。其他：原始登記表、鑷子、剪刀、記號筆、標本盒、舊報其他：原始登記表、鑷子、剪刀、記號筆、標本盒、舊報紙、吸水紙、光學顯微鏡和一次性手套等。紙、吸水紙、光學顯微鏡和一次性手套等。材料一、改良加藤厚涂片法一、改良加藤厚涂片法步驟刮刮填填蓋蓋壓壓透透一一、改良加藤厚涂片法改良加藤厚涂片法1 1）每份糞樣取每份糞樣取2張載玻片進行編號（與待檢糞樣的編號張載玻片進行編號（與待檢糞樣的編號相同）相同）2 2）將）將8080目的尼龍絹攤在糞樣上，用刮棒壓平后目的尼龍絹攤在糞樣上，用刮棒壓平后刮刮取糞便。取糞便。3 3）將定量板放置玻片中央，定量孔小孔朝上，將糞樣）將定

4、量板放置玻片中央，定量孔小孔朝上，將糞樣填填滿、抹平。滿、抹平。一一、改良加藤厚涂片法改良加藤厚涂片法4）垂直向上移去定量板，將親水玻璃紙抖）垂直向上移去定量板，將親水玻璃紙抖掉多余水分，掉多余水分，蓋蓋在糞樣上；在糞樣上；5）取另一張載玻片輕）取另一張載玻片輕壓壓糞樣，均勻展開糞樣，均勻展開至玻片邊緣；至玻片邊緣；6）待加藤片）待加藤片透透明后鏡檢明后鏡檢一一、改良加藤厚涂片法改良加藤厚涂片法記錄下每張片子的各種蟲卵數記錄下每張片子的各種蟲卵數;當每個視野中的蛔蟲卵數當每個視野中的蛔蟲卵數在在10個以上時個以上時,可固定抽查可固定抽查10個視野個視野,將將 10個視野的蟲卵個視野的蟲卵平均數

5、乘以全片的視野數，得到全片蟲卵數近似值。平均數乘以全片的視野數，得到全片蟲卵數近似值。例：例：抽查的抽查的10個視野蛔蟲卵數相加為個視野蛔蟲卵數相加為366，全片糞膜視野數為，全片糞膜視野數為78，則全片糞膜蛔蟲卵總數（，則全片糞膜蛔蟲卵總數（ 36610 ）782854.82855鏡檢（1）受檢者需提供足量的糞樣，約）受檢者需提供足量的糞樣，約50g（雞蛋大小）。（雞蛋大?。?。（2）加藤片的糞樣應厚薄均勻，不能逸出玻片邊緣。）加藤片的糞樣應厚薄均勻，不能逸出玻片邊緣。（3）涂片放置時間長短是關鍵。一般室溫）涂片放置時間長短是關鍵。一般室溫25、75濕度濕度下，涂片放置下，涂片放置不宜超過不宜

6、超過2小時小時。只要透明了，就應及時鏡。只要透明了，就應及時鏡檢，否則透明過度，薄殼蟲卵易變形看不清楚。檢，否則透明過度，薄殼蟲卵易變形看不清楚。（4）登記糞檢結果時，分別填寫每張加藤片的各種蟲卵數）登記糞檢結果時，分別填寫每張加藤片的各種蟲卵數（不要乘不要乘24）。）。（5）調節(jié)顯微鏡左右目鏡的距離和焦距。）調節(jié)顯微鏡左右目鏡的距離和焦距。一、改良加藤厚涂片法一、改良加藤厚涂片法注意事項二、透明膠紙肛拭法二、透明膠紙肛拭法材料材料透明膠貼載玻片二、透明膠紙肛拭法二、透明膠紙肛拭法檢測步驟檢測步驟1）在膠貼紙上記錄受檢者編號等信息，將膠貼紙有粘性一面向外；二、透明膠紙肛拭法二、透明膠紙肛拭法2

7、） 用食指和拇指分開受檢兒童的肛門，盡量分開肛周褶皺 ，將透明膠貼紙在肛門口反復粘壓。二、透明膠紙肛拭法二、透明膠紙肛拭法3)將采樣后的膠貼紙貼回載玻片，抹平，減少氣泡產生。二、透明膠紙肛拭法二、透明膠紙肛拭法要求要求39歲兒童只檢查歲兒童只檢查1次。次。蟲卵不計數，只蟲卵不計數，只記錄記錄陰性、陽性陰性、陽性。蟯蟲有夜間排卵的習性蟯蟲有夜間排卵的習性,采樣宜在清晨采樣宜在清晨,采樣采樣前不要洗澡或清洗肛門前不要洗澡或清洗肛門,以免漏檢。以免漏檢。三、三、試管濾紙培養(yǎng)法試管濾紙培養(yǎng)法錐形離心管（長錐形離心管（長11.5cm、管口內徑、管口內徑1.5cm）。）。試管架、吸管、載玻片、蓋玻片試管架

8、、吸管、載玻片、蓋玻片(2020mm)、小鑷子、小鑷子、濾紙條（寬度略大于試管直徑，長度略短于試管，約濾紙條（寬度略大于試管直徑，長度略短于試管，約9.01.6cm，濾紙條要用剪刀剪，防止毛邊）、，濾紙條要用剪刀剪，防止毛邊）、顯微鏡、溫箱、解剖鏡或放大鏡、竹簽、舊報紙、橡皮筋。顯微鏡、溫箱、解剖鏡或放大鏡、竹簽、舊報紙、橡皮筋。材料三、三、試管濾紙培養(yǎng)法試管濾紙培養(yǎng)法（1）每管內加入冷開水約）每管內加入冷開水約2ml。（2）將濾紙條沿長軸縱折，以保持挺直。）將濾紙條沿長軸縱折，以保持挺直。（3）用竹簽取）用竹簽取0.5g糞便，涂于濾紙中段，左右各留糞便，涂于濾紙中段，左右各留0.5cm，上端

9、留，上端留1cm，下端留約下端留約2cm空白，不涂糞便。空白，不涂糞便。（4）將涂布糞便的濾紙插入管中，但不應該接觸管底，濾紙條插入管中）將涂布糞便的濾紙插入管中，但不應該接觸管底，濾紙條插入管中的深度以的深度以水只接觸紙條而不碰到糞便水只接觸紙條而不碰到糞便為宜。為宜。（5）在培養(yǎng)管上貼上標簽并寫上受檢者的姓名和編號。）在培養(yǎng)管上貼上標簽并寫上受檢者的姓名和編號。（6）每）每3050管用橡皮筋扎住，上下均包以舊報紙，再用橡皮筋扎緊。管用橡皮筋扎住，上下均包以舊報紙，再用橡皮筋扎緊。步驟三、三、試管濾紙培養(yǎng)法試管濾紙培養(yǎng)法（7）將培養(yǎng)管置于）將培養(yǎng)管置于31溫度中培養(yǎng)溫度中培養(yǎng)4天，或置于天，

10、或置于2630溫度中培養(yǎng)溫度中培養(yǎng)68天。以保證所有幼蟲都有足夠的時間發(fā)育到感染期幼蟲。天。以保證所有幼蟲都有足夠的時間發(fā)育到感染期幼蟲。（8）分離幼蟲：沿管壁加入）分離幼蟲：沿管壁加入45溫水溫水，淹沒濾紙上的糞便淹沒濾紙上的糞便，1小時后用小時后用鑷子取出濾紙條，棄去。鑷子取出濾紙條，棄去。將培養(yǎng)管靜置將培養(yǎng)管靜置1小時小時，用吸管吸去上清液，用吸管吸去上清液，幼蟲留于管底幼蟲留于管底0.5ml或更少的水內?；蚋俚乃畠?。（9）用放大鏡）用放大鏡(4以上以上)或解剖鏡以側照法檢出沉淀物內有無活的幼蟲?；蚪馄淑R以側照法檢出沉淀物內有無活的幼蟲。如有活的幼蟲，可先將管底部浸于如有活的幼蟲，可先

11、將管底部浸于50-60的熱水內抑制活動。的熱水內抑制活動。（10）將沉淀物置于低倍鏡下）將沉淀物置于低倍鏡下(1010)檢查，為使可折光的幼蟲易于觀檢查，為使可折光的幼蟲易于觀察，檢查時要盡量縮小光圈減弱光線，如需詳細辨認幼蟲，可加上蓋察，檢查時要盡量縮小光圈減弱光線，如需詳細辨認幼蟲，可加上蓋玻片，在高倍鏡下玻片，在高倍鏡下(4010)檢查，必要時可用目鏡測微計測量幼蟲。檢查，必要時可用目鏡測微計測量幼蟲。三、三、試管濾紙培養(yǎng)法試管濾紙培養(yǎng)法每份樣本鑒定鉤蚴每份樣本鑒定鉤蚴100條，不足條，不足100條，全部鑒定記數。發(fā)現條，全部鑒定記數。發(fā)現其他種類的線蟲只記錄蟲種名不記數。其他種類的線蟲

12、只記錄蟲種名不記數。如遇土壤污染，培養(yǎng)中可出現自由生活的線蟲成蟲和幼蟲必須如遇土壤污染，培養(yǎng)中可出現自由生活的線蟲成蟲和幼蟲必須與人體寄生蟲的幼蟲相鑒別。與人體寄生蟲的幼蟲相鑒別。若若幼蟲蠕動過快，難于觀察，可用以下方法制動幼蟲蠕動過快，難于觀察，可用以下方法制動1)將載玻片放在將載玻片放在90的熱水上用熱氣熏的熱水上用熱氣熏2)從一側加從一側加3%5%福爾馬林一滴福爾馬林一滴3)加入加入1：4000的稀碘液一滴的稀碘液一滴要求注意事項三、三、試管濾紙培養(yǎng)法試管濾紙培養(yǎng)法鉤蚴鑒別鉤蚴鑒別美洲鉤蟲低倍鏡下食管矛明顯高倍鏡下尾部鞘膜橫紋明顯十二指腸鉤蟲低倍鏡下食管矛不不明顯高倍鏡下尾部鞘膜橫紋不不

13、明顯美洲鉤蟲美洲鉤蟲鞘膜橫紋鞘膜橫紋食管矛食管矛十二指腸鉤蟲十二指腸鉤蟲三、三、試管濾紙培養(yǎng)法試管濾紙培養(yǎng)法四、土壤中鉤蚴分離改良方法四、土壤中鉤蚴分離改良方法1 材料材料圓形分樣篩（圓形分樣篩（20目，直徑目，直徑15cm）、塑料燒）、塑料燒杯（杯（500ml）、棉紙、搪瓷盤或不銹鋼臉）、棉紙、搪瓷盤或不銹鋼臉盆（底面稍大于圓形分樣篩的底面）、三盆（底面稍大于圓形分樣篩的底面）、三角量杯（角量杯（500ml）、平皿（直徑）、平皿（直徑9cm）、土）、土鏟、量筒、大鑷子、記號筆、保鮮袋、溫鏟、量筒、大鑷子、記號筆、保鮮袋、溫箱（或水浴箱）、溫度計、自來水、氯化箱（或水浴箱）、溫度計、自來水、氯

14、化鈉（鈉（Nacl）、解剖鏡、顯微鏡。）、解剖鏡、顯微鏡。四、土壤中鉤蚴分離改良方法四、土壤中鉤蚴分離改良方法2 步驟2.1用土鏟取表層2-3 cm土樣，在500 ml塑料燒杯中定量至300 ml刻度處（約350 g）后放入保鮮袋，注明土樣編號，并在登記本上注明相應的取樣點、種植物類型、戶主姓名等基本信息。2.2在圓形分樣篩網面上鋪上3層棉紙（棉紙直徑22 cm），倒入樣本土，用大鑷子將顆粒較大的土壓細、去除石子、草等雜質后，將土鋪展均勻。2.3將放入土樣的分樣篩放入搪瓷盤中，并在搪瓷盤中加入45、5%的鹽水，至鹽水的液面沒過篩網面的棉紙為止。2.4將加入鹽水和土樣分樣篩的搪瓷盤置45溫箱或水

15、浴箱中，放置1.5 h。2.5取出分樣篩，將搪瓷盤中的水倒入三角量杯，自然沉淀15 min。2.6緩緩棄去上清液（傾倒過程不要讓水回流），底部留50 ml或更少的液體。2.7將沉淀倒入平皿，解剖鏡下進行初步鑒別后，顯微鏡下進行十二指腸鉤蟲鉤蚴和美洲鉤蟲鉤蚴的鑒別和計數。四、土壤中鉤蚴分離改良方法四、土壤中鉤蚴分離改良方法四、土壤中鉤蚴分離改良方法四、土壤中鉤蚴分離改良方法3 注意事項3.1土樣應在早上10點前采集完畢。3.2采集的土樣在近一段時間內沒有噴過殺蟲劑。3.3如果分離后沉淀中有絮狀沉淀不便觀察，建議再采取以上分離步驟，在45、5%的鹽水中分離20 min后進行觀察。1 取土樣取從土表

16、至表層以下2cm處泥土；2 土樣處理2.1 取回土樣，剔除菜葉、樹皮等大雜物，壓碎土樣中的大顆粒；2.2過篩 先后用孔徑3mm的銅篩和孔徑為2mm的銅篩過篩，收集過篩后的土樣。五、土壤中人蛔蟲卵檢查及活力測五、土壤中人蛔蟲卵檢查及活力測定方法定方法五、土壤中人蛔蟲卵檢查及活力測五、土壤中人蛔蟲卵檢查及活力測定方法定方法3 取2支50ml大離心管，各放入過篩后的土樣10g，加5%氫氧化鈉溶液至40或45ml刻度線。4 用橡皮塞緊塞管口，用力振搖數分鐘，充分混合后，以2000rpm,離心4min。5 棄去上部的氫氧化鈉，加入飽和硝酸鈉溶液攪拌混勻，2000rpm離心4min。6 離心后，再加飽和硝

17、酸鈉溶液滿至管口，靜置15min。7 用一次性滴管吸取管口表層液面，滴加于離心管內，待下一步活力測定。六、六、 豬體囊尾蚴檢測方法豬體囊尾蚴檢測方法一、設備和材料顯微鏡、目鏡測微尺、37C孵箱、方盤、解剖刀、解剖剪、解剖針、眼科鑷、培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、標本瓶、滴管、廢物盤二、試劑生理鹽水、豬膽汁。六、六、 豬體囊尾蚴檢測方法豬體囊尾蚴檢測方法三、檢測方法 豬囊尾蚴寄生豬活動較多的肌肉，以臀股部肌肉最多，其后依次為舌肌、腦組織以及心肌。通過肉眼可直接查看到肌肉內有米粒大至豌豆大的白色半透明的囊泡。用鑷子取出囊泡，置于生理鹽水孵化，囊尾蚴頭節(jié)外翻，壓片后在低倍顯微鏡下觀察頭節(jié)，頭節(jié)的四周可有4個吸盤和2圈小鉤。“米豬肉”六、六、 豬體囊尾蚴檢測方法豬體囊尾蚴檢測方法1 采樣采集豬的一側臀股部肌肉1000 g，用刀每隔810 mm橫斷切開肌肉纖維，觀察有無乳白色透明石榴籽樣物的囊泡，取下囊泡置入盛有生理鹽水的標本瓶中，待鏡檢鑒定。2 鏡檢將檢獲的囊泡用解剖針剝離去掉纖維膜，放入盛有20%豬膽汁生理鹽水的平皿中，置于37C孵箱30 min，待頭節(jié)翻出后壓片鏡檢，觀察其形