?；撬釋xLDL誘導(dǎo)的MC細胞Lox1表達的影響

1、牛磺酸對oxLDL誘導(dǎo)的MG田胞Lox1表達的影響摘要：目的觀察?；撬釋ρ趸兔芏戎鞍讗u皿門誘導(dǎo)的大鼠系膜細胞（MC血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1I,” I）的表達。方法 培養(yǎng)大鼠MC細胞，分為空白對照組、追LDL組、?；撬峤M和牛磺酸 M |兒組，24 h 后以檢測表達情況,并用分光光度比色法測定細胞上清液中超氧化物歧化酶（SOD活性和丙二醛（MDA含量。結(jié)果MC細胞中有皿I表 達，曲LDL誘導(dǎo)后表達增加，并導(dǎo)致MC細胞SOD舌性下降、MDA含量明顯高于 對照組分別為SOD（）X 103 U/L， MDA（1 2賈【002）卩mol/L, PvO館。牛磺酸可明顯降低皿 HL誘導(dǎo)引起Li;丨表

2、達水平,同 時也使SOD舌性增加和MDA含量降低，P 0館。結(jié)論?；撬峥赡芡ㄟ^抑制 ox 受體丨的表達及由其引起的氧化應(yīng)激減輕址LDL對腎臟的損 傷。關(guān)鍵詞：?；撬?；氧化低密度脂蛋白；系膜細胞?；撬幔╰aurine）即2氨基乙磺酸，是體內(nèi)分布廣泛、效應(yīng)多樣的自調(diào)素， 它不但參與維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而且對多種組織細胞有明顯保護作用1, 2。 但其對腎臟系膜細胞是否有直接保護作用，國內(nèi)外研究報道尚少。有研究表明， 氧化低密度脂蛋白5 血i* i.J i w心iii g在腎臟病變的發(fā)展中起重要作用，而血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1Lm J是近年來發(fā)現(xiàn)的址LDL主要受體。因此，本研究觀察?；撬釋χ稩B

3、L誘導(dǎo)的系膜細胞 Lox丨表達及其抗氧化作用，初步探討了其拮抗腎臟病變發(fā)生發(fā)展的可能作用 機制。1 材料與方法1. 1 試劑 ?；撬帷EPE購自美國Sigma公司；S LDL購自中國協(xié) 和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)生化所；SOD MD航劑盒購自南京建成生物工程研究所；低糖 DME購自Gibsco公司；胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；RNA抽提試劑盒購自Promega公司；RT卩CR試劑盒購自寶生生物工程大連有限公 司；7225型紫外分光光度計為上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；圖像掃描儀為 Fujifilm 公司 Image Master VDS 產(chǎn)品。1. 2 細胞系大鼠系膜細胞購自杭州市中醫(yī)

4、院腎病中心。細胞系用含10%胎牛血清的低糖DME培養(yǎng)。1. 3 方法1. 3. 1細胞培養(yǎng)及分組：大鼠系膜細胞在含 10%胎牛血清及HEPES勺低糖DME培養(yǎng)液中貼壁生長。以每孔5X104個細胞總數(shù)接種到24孔培養(yǎng)板， 待細胞達到80%左右，更換無血清培養(yǎng)基使細胞同步生長，將培養(yǎng)細胞隨機分 為4組：正常對照組，只加無血清培養(yǎng)液；x LDL組，無血清培養(yǎng)液加OX山1,濃度為50 mg/L;?；撬峤M，無血清培養(yǎng)液加?；撬幔瑵舛葹?0 mmol/L; ?；撬犭臝兒組，無血清培養(yǎng)液中含終濃度為 20 mmol/L?；撬岷?0 mg/L 曲 山I,每組設(shè)6個復(fù)孔，用藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細胞上清液和

5、細胞待檢。1. 3. 2檢測細胞.表達：以Trizol試劑抽提細胞的總RNA使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，以oligo DT為引物，取總RNA 2卩g進行逆 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，之后以50卩l(xiāng)反應(yīng)體系進行體外PCRT增，以B 北山 作為內(nèi)參。 Lox 1引物序列為：正義5GMTTCTGGOM冊3反義5擴增產(chǎn)物大小為328 bp ; B弓I物序列為：正義 5 TTCCAGCfTTlITTUTa； 3 反義 5擴增產(chǎn)物大小為206 bp，引物均由上海生物工 程公司合成。反應(yīng)條件：預(yù)變性 94 C 1 min ;然后進入94 C變性30 s ; 55C 退火45 s ; 72 C延伸1 min，共35個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束前7

6、2C 10 min以充分延 伸PCR產(chǎn)物于丨3%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照并進行半定量分析， B 孔仃11值校正，得出目的條帶與內(nèi)參照條帶的光密度比值。1. 3. 3 細胞上清液SOD MD冰平檢測：上述細胞用藥后繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后收集培養(yǎng)液，2 000 r/min 離心10 min，取上清液在分光光度計上測定 SOD MDA測定均依照試劑盒說明操作。1. 4 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料以xs表示，用SPSS 11 5統(tǒng)計軟件進 行處理，組間比較用單向方差分析法（皿 誦眄 ANOVA, P0 05表示有 統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2. 1 ox LDL誘導(dǎo)大鼠 l.ox 1MZ的表達 RT卩R

7、半定量檢測 表明，大鼠mc在師LDL刺激下山戊I inRA的表達隨著師LDL濃度增加而 增強，在濃度為50 mg/L時表達水平最高（圖1）。圖1不同濃度曲LDL對大鼠；!C l.ox 1 mkA表達的影響 略2. 2 ?；撬釋χ稬DL誘導(dǎo)的大鼠；!C l.ox 1血訕 表達的影響20 mmol/L?；撬嶙饔?4 h后明顯降低了追LDL誘導(dǎo)的大鼠 忙宓 1 niRA的 表達（圖2）。 圖2 牛磺酸對朋LDL誘導(dǎo)的大鼠MC Lox ImRNA表達的影 響略2. 3 ?；撬釋ψ稬DL誘導(dǎo)的大鼠MC培養(yǎng)上清液中SOD舌性、MDA含 量的影響 20 mmol/L?；撬嶙饔?4 h后SOD舌性增加，同時M

8、DA含量降低（表 1） 表1?；撬釋ψ稬DL誘導(dǎo)的大鼠MC培養(yǎng)上清液中SOD舌性及MDA含量的影響（略）3 討論血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1Lg 是近年來發(fā)現(xiàn)的追LDL的主 要受體，首先被發(fā)現(xiàn)于血管內(nèi)皮細胞3，后來發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞、平滑肌細胞、 成纖維細胞和血小板中也有表達。在內(nèi)皮細胞中的研究表明，追可通過 Lox丨誘發(fā)內(nèi)皮細胞ROSI著升高，特別是超氧陰離子和H2O2激活W K B, 減少NO生成，并可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞凋亡4。但是關(guān)于I在其它細胞中的 作用研究還較少，本研究檢測I在系膜細胞中的表達，結(jié)果顯示L黠丨 也在系膜細胞上有微弱表達，受到朋LDL誘導(dǎo)后表達明顯升高，在一定濃度范 圍內(nèi)隨址I

9、BL濃度的增加其表達也逐漸增加，但追LOL濃度達100 mg/L時 Lox I表達又逐漸下降，推測這可能與址LDL的直接細胞毒性作用有關(guān)。該 實驗結(jié)果說明不僅對于內(nèi)皮細胞而且對于系膜細胞而言，山冥I也是其結(jié)合或內(nèi)吞s LDL的重要受體。?；撬崾且环N b 氨基酸的亞磺酸類似物，被認為 是含硫氨基酸的無功能代謝產(chǎn)物。 最近的研究顯示，?；撬峋哂芯S持細胞內(nèi)外滲 透壓平衡、穩(wěn)定細胞膜、抗脂質(zhì)過氧化損傷以及調(diào)節(jié)內(nèi)皮舒張因子、內(nèi)皮素等血管活性物質(zhì)合成釋放的紊亂狀態(tài)5等多種作用，但其確切機制尚未完全明了。 本實驗研究了?；撬釋其I表達的影響，結(jié)果顯示，?；撬峥梢燥@著地降低 ox 誘導(dǎo)引起的丨基因表達水平。

10、研究表明，曲 W 作用于內(nèi)皮細 胞膜引起一系列過氧化鏈式反應(yīng)，并產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物，這些脂質(zhì)過氧化 物不僅直接損傷細胞的DNA誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡，而且作為一種重要的信使分子， 介導(dǎo)多種細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)；另有研究表明，?；撬釋Ω哐且鸬难軆?nèi)皮細胞 的脂質(zhì)過氧化損傷有明顯的保護作用6。至于牛磺酸對匡L(fēng)DL所致的系膜 細胞損傷，目前尚未見相關(guān)報道。本實驗觀察?；撬釋ηT導(dǎo)的系膜細胞自由基產(chǎn)生情況，結(jié)果表明，oxLL可使系膜細胞分泌MDA增多、SOD舌性 降低，而牛磺酸干預(yù)可使系膜細胞 MDA含量顯著下降、SOD舌性增加，證實?；撬峥梢种谱杂苫a(chǎn)生從而保護系膜細胞，減輕追l)L對系膜細胞的損傷，進

11、而延緩腎臟病變的發(fā)生、發(fā)展。【參考文獻】1 Huxtable RJ. Physiological action of taurineS . Physiol Rev,1992,72:101.2 Strurman JA. Taurine in development S . Physiol Rev, 1993,73:119.3 SawamuraT, KumeN, AoyamaT, et al. An endothelial receptorfor oxi di zed low” density 1 i poprot einj . Nature, 1997,3S6 (6620): 7377,4 Co

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