流行性腦脊髓膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則-中國疾病預(yù)防控制中心

1、流行性腦脊髓膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則GB 16884 1997、前言流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦）是由腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis , Nm）通過呼吸道傳播所引起的化膿性腦膜炎， 常在冬春季節(jié)引起發(fā)病與流行， 患者以兒童為多見， 流行時成年人發(fā)病亦增多。人受 Nm 感染后大多數(shù)表現(xiàn)為鼻咽部帶菌狀態(tài)，只有少數(shù)成為流腦患者，其主要臨床表現(xiàn)為突發(fā)性高熱、 頭痛、 嘔吐、 皮膚和粘膜出血點(diǎn)或瘀斑及頸項(xiàng)強(qiáng)直等腦膜刺激征，腦脊液呈化膿性改變。此外， Nm 也可不侵犯腦脊髓膜，僅表現(xiàn)為敗血癥，病重者可呈暴發(fā)型發(fā)作。為了貫徹執(zhí)行 中華人民共和國傳染病防治法 ， 認(rèn)真做好流腦流行病學(xué)

2、監(jiān)測與控制的工作，預(yù)防此病發(fā)病大幅度回升，控制其流行，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A 和 B 為標(biāo)準(zhǔn)的附錄；附錄C、 D 、 E 和 F 皆為提示的附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國衛(wèi)生部提出。本標(biāo)準(zhǔn)負(fù)責(zé)起草單位： 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所； 參加起草單位： 北京佑安醫(yī)院和北京市衛(wèi)生防疫站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：胡緒敬、徐蓮芝、吳貴坤。本標(biāo)準(zhǔn)委托技術(shù)歸口單位衛(wèi)生部傳染病防治監(jiān)督管理辦公室負(fù)責(zé)解釋。1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了流腦的診斷標(biāo)準(zhǔn)和處理原則。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各級、各類醫(yī)療保健、衛(wèi)生防疫機(jī)構(gòu)和人員對流腦病例診斷、報(bào)告與處理。2 診斷原則2.1 應(yīng)根據(jù)流行病學(xué)資料和臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果做出臨床

3、診斷。2.2 確診需要培養(yǎng)Nm 或檢測 Nm 群特異多糖抗原或 Nm 的 DNA 特異片段或檢測病人急性期和恢復(fù)期血清中抗Nm 特異抗體。3 診斷標(biāo)準(zhǔn)3.1 流行病學(xué)史在冬春季節(jié)和流行地區(qū)內(nèi)， 兒童患病者最為多見。 有些患者在發(fā)病前7 天有明顯密切接觸史。3.2 臨床表現(xiàn)3.2.1 突然寒戰(zhàn)、高熱、惡心、嘔吐、流涕、鼻塞、咽痛、全身疼痛、頭痛加重。3.2.2 面色蒼白、四肢發(fā)涼、皮膚發(fā)花并有散在的小出血點(diǎn)、唇周及指端青紫、唇周單純皰疹。3.2.3 煩躁不安、譫妄、昏迷或驚厥。3.2.4 皮膚、粘膜瘀點(diǎn)典型或融合成瘀斑，血壓明顯下降、脈搏細(xì)速、脈壓差縮小。3.2.5 頸項(xiàng)強(qiáng)直、角弓反張、克氏征和

4、布氏征陽性。3.2.6 瞳孔大小不等、邊緣不整、對光反應(yīng)遲鈍、眼球常凝視。3.2.7 呼吸快慢及深淺不均或呼吸暫停。3.2.8 幼兒發(fā)病多不典型，常見高熱、嘔吐、嗜睡外，還多見極度不安與驚厥、拒乳、尖叫、腹瀉、咳嗽、雙目凝視、頸項(xiàng)強(qiáng)直和布氏征陽性，其他腦膜刺激征可能缺項(xiàng)。前囟未閉者多見隆起，嘔吐頻繁而失水者也可出現(xiàn)囟門下陷。3.3 實(shí)驗(yàn)室診斷3.3.1 血象：白細(xì)胞數(shù)顯著增高，最高可達(dá)40X 10（上標(biāo)始）9（上標(biāo)終）/L,中性粒細(xì)胞在80%90以上。3.3.2 疑為流腦者應(yīng)做腰椎穿刺檢查，腦脊液（CSF）壓力常增高達(dá)1.96kPa以上；典型病例CSF 的外觀混濁如米湯樣甚或膿樣；白細(xì)胞數(shù)增多

5、，可達(dá)每升數(shù)億，以多形核細(xì)胞為主； 蛋 白質(zhì)顯著增高，可達(dá)15g/L;糖量常低于2.22mmol/L ,氯化物也稍降低。CSF涂片可在中 性粒細(xì)胞內(nèi)找到革蘭氏陰性雙球菌。3.3.3 從病人CSF或急性期血液分離到Nm,見附錄A（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）。3.3.4 從病人急性期血清或尿或CSF中檢測到Nm群特異性多糖抗原，見附錄C（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）。3.3.5 檢測病人恢復(fù)期血清抗體效價(jià)較急性期呈4倍或4倍以上升高，見附錄B（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）。3.3.6 以PCR檢測到病人急f期血清或CSF中Nm的DNA特異片段，見附錄D（提示的附錄）。3.4 病例分類3.4.1 疑似病例： 3.1 加 3.2.1 或 3.2.

6、2 或 3.2.3 之一項(xiàng)。3.4.2 臨床確診病例：疑似病例加3.2.4 或 3.2.5 或 3.2.6 或 3.2.7 之一項(xiàng)。3.4.3 確診病例：疑似病例或臨床確診病例加3.3.3 或 3.3.4 或 3.3.5 或 3.3.6 之一項(xiàng)。4 處理原則4.1 對病人早期處理，見附錄E（提示的附錄）。4.1.1 發(fā)現(xiàn)疫情及時向衛(wèi)生防疫部門報(bào)告。4.1.2 就地隔離，搶救治療，降低病死率。4.1.3 給予抗菌藥物，及時控制感染。4.1.4 早期發(fā)現(xiàn)并及時糾正休克與彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC） 。4.1.5 若早期發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)壓增高癥狀，及時應(yīng)用脫水療法防治腦疝和呼吸衰竭。4.2 對易感人群的處理，

7、見附錄F（提示的附錄）。4.2.1 與患者密切接觸的人群出現(xiàn)上呼吸道感染樣病人，應(yīng)按輕癥流腦患者處理。4.2.2 根據(jù)流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果，制定A 群腦膜炎雙球菌多糖菌苗預(yù)防注射的計(jì)劃，在流行前期完成接種任務(wù)，免疫對象接種率應(yīng)達(dá)到 90以上。4.2.3 除了完成上述菌苗常規(guī)免疫任務(wù)以外， 還應(yīng)備有應(yīng)急接種用的A 群腦膜炎雙球菌多糖菌苗，用于控制流腦暴發(fā)流行。4.2.4 在未免疫地區(qū)出現(xiàn)A 群 Nm 引起流腦暴發(fā)流行時，除了對15 歲以下兒童，還應(yīng)酌情對與病人密切接觸的成人應(yīng)急接種上述菌苗。4.2.5 目前在我國，若出現(xiàn)非A 群 Nm 引起流腦局部暴發(fā)，應(yīng)及時對病人全家以及與其毗連的鄰居實(shí) 施抗菌藥

8、物預(yù)防。附錄 A（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）流腦病原學(xué)診斷方法A1 病原體（腦膜炎奈瑟氏菌Neissria meningitidis） 分離從疑似流腦患者采集CSF 或急性期血液分離Nm 。A1.1 標(biāo)本的采集A1.1.1 CSF :無菌操作，吸出CSF 2mL,立即放到無菌試管內(nèi)離心（20003000r/min , 30min）,用滅菌過的毛細(xì)管吸取沉淀物直接接種到10羊血巧克力色瓊脂上（CSF 上清液部分供檢測Nm特異抗原，亦可將其置于20c待測），5%二氧化碳環(huán)境37c培養(yǎng)2472h,每日檢查細(xì)菌生長的情況，及時分離純培養(yǎng)物供鑒定。A1.1.2 血液：采取病人急性期靜脈血液6mL ，無菌操作往盛有30

9、mL 增菌用的葡萄糖肉湯三角瓶內(nèi)注入 4mL 血液 (余下的2mL 血液同上離心后吸出血清，供檢測 Nm 特異抗原和抗體，亦可將其置于一20c待測)，同上述條件培養(yǎng) 2472h,每日進(jìn)行分離培養(yǎng)。A1.2 接種和菌種鑒定A1.2.1細(xì)菌形態(tài)：Nm應(yīng)為革蘭氏陰性，呈卵圓形或腎形，0.8wmX0.6wm大小。常成對排列，臨近兩邊扁平凹陷。A1.2.2 菌落： Nm 接種于巧克力色瓊脂平皿上，5 二氧化碳，37培養(yǎng) 24h 后，其菌落直徑約 1mm ，表面突起、光滑、濕潤、圓整、略帶灰白色、半透明、不溶血、無色素。培養(yǎng) 時間延長，菌落增大、變成黃色、不透明，并可出現(xiàn)顆粒狀中心和放射性周邊。A1.2.

10、3 生長及抗原特性：絕大多數(shù)Nm 菌株分解葡萄糖和麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。不分解蔗糖、果糖和乳糖。過氧化酶和氧化酶陽性。Nm新分離菌株具有下列主要抗原：血清群特異性莢膜多糖，主要外膜蛋白-OMP(包括血清型特異的2/3類OMP ,亞型特異的1類OMP以及4與5類OMP),鐵調(diào)節(jié)蛋白，脂寡糖 (LOS) ， H.8 脂蛋白，還有菌毛抗原等， 根據(jù)群特異性莢膜多糖的結(jié)構(gòu)與組成成分， Nm 可分 為 13 個血清群 (A、 B、 C、 D、 29E、 H、 I、 K、 L、 W135、 X、 Y、 Z) ，其中 90以上的病 例是由 A 、 B 和 C 群 Nm 引起的。 根據(jù) 2/3 類 OMP 可將

11、 B 群與 C 群 Nm 分成 20 個血清型，但差不多半數(shù)菌株目前尚不能分型。 在可分型菌株中， 以 15、 2 和 4 型， P1.2、 P1.1、 P1.12、P1.15及P1.16亞型多見；對于A群Nm現(xiàn)有4與21兩個血清型，以P1.7與P1.9亞型多見。Nm 還可以分成13 個 LOS 免疫型，其中 A 群以 L10 和 L11 型多見， B 群中以 L3 ， 7， 9 復(fù)合型多見。 Nm 群特異性莢膜多糖、 型和亞型的 OMP 及 LOS 等抗原成分對流腦發(fā)病與流行 及其菌苗的研究均具有重要價(jià)值。附錄 B(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)流腦血清學(xué)診斷方法B1 玻片凝集試驗(yàn)81.1 目的應(yīng)用玻片凝集試

12、驗(yàn)對Nm 病原菌株或帶菌者菌株進(jìn)行血清學(xué)分群。81.2 材料81.2.1 待檢的 Nm 菌株純培養(yǎng)物。81.2.2 Nm 診斷血清：多價(jià) 1(包含 A、B、C、D 群)，多價(jià)H包含 1889(Y)、1890(H)、1892(29E), 多價(jià)出包含 319(W135)、1916(X)、1486(1)、1811(K)群及各群單價(jià)血清，共計(jì) 14種。81.2.3 潔凈載玻片。81.2.4 生理鹽水。81.3 試驗(yàn)方法81.3.1 先將診斷血清按說明書稀釋成所需的濃度，滴一滴在潔凈的玻片上。81.3.2 用白金耳刮取菌苔少許，在玻片上沾取少量血清，在一旁研磨均勻，再與血清混勻。81.3.3 輕輕搖動玻

13、片數(shù)次，在 12min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者，即為陽性。81.3.4 檢查從病人分離的疑似Nm 時，先試 A 群血清，若不與其發(fā)生凝集，則試用 B 或 C群血清，仍不凝集時，則試用多價(jià)n或多價(jià)出血清。若發(fā)生凝集，再用單價(jià)血清定群。從病 人分離的疑似Nm 對現(xiàn)有診斷血清皆不凝集者則送研究單位進(jìn)一步鑒定。81.3.5 在玻片上與各群診斷血清、鹽水或正常兔血清皆發(fā)生凝集者，即定為自凝菌。B2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)82.1 目的應(yīng)用 ELISA 間接法測病人急性期和恢復(fù)期血清中的抗體水平。 此方法也可以應(yīng)用于健康者血清抗體的測定。82.2 材料82.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測儀。82.2.2 聚

14、苯乙烯板（40 孔或 96孔）。82.2.3 加樣器（單頭或4頭或8頭，定量為0200 d L）。82.2.4 羊抗人 IgG 辣根過氧化酶結(jié)合物。82.2.5 試驗(yàn)質(zhì)控血清（抗體陽性和陰性的人血清）。82.2.6 菌體抗原 （A 、 B 和 C 群 Nm 標(biāo)準(zhǔn)菌株 ）或 A 群 Nm 多糖菌苗。82.2.7 包被液 （0.05mol/L 碳酸鹽緩沖液）：碳酸氫鈉（NaHCO（下標(biāo)始）3（下標(biāo)終）2.9g碳酸鈉（Na（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）CO（下標(biāo)始）3（下標(biāo)終）1.6g疊氮鈉（NaN（下標(biāo)始）3（下標(biāo)終）0.2g加蒸餾水至1000mL ， pH9.6 ，置 4可備用兩周。82.2.8 洗滌液

15、 （0.5mol/L 氯化鈉 ） ：氯化鈉（NaCl） 29.3g吐溫20（Tween 20） 0.5mL加蒸餾水至1000mL ，臨用前配制。82.2.9 稀釋液：氯化鈉 （NaCl） 8.0g磷 酸 二 氫 鉀 （KH（ 下 標(biāo) 始 ）2（ 下 標(biāo) 終 ）PO（ 下 標(biāo) 始 ）4（ 下 標(biāo) 終 ）0.2g磷酸 氫二鈉（Na（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）HPO（下標(biāo) 始）4（下標(biāo)終） 12H（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）0） 2.9g氯化鉀（KCl） 0.2g吐溫20（Tween 20） 0.5mL加蒸餾水至1000mL ， pH7.4 ，置 4備用。82.2.10 底物緩沖液：（1）0.2mo1/L 磷酸

16、氫二鈉磷酸氫二鈉（Na（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）HPO（下標(biāo)始）4（下標(biāo)終）- 12H（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）0） 35.8g蒸餾水 500mL（2）0.1mol/L 檸檬酸檸檬酸C（下標(biāo)始）3（下標(biāo)終）H（下標(biāo)始）4（下標(biāo)終）（OH）（COOH）（下標(biāo)始）3（下標(biāo)終） H（下標(biāo) 始）2（下標(biāo)終）0 10.5g蒸餾水 500mL（1） 液和 （2）液分別置4備用。臨用前按下述配方配制底物溶液， pH 為 5.0：（1）液 2.57mL（2）液 2.43mL鄰苯二胺 4mg蒸餾水 5mL30% H（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）0（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）15 dLB2.2.11 填充液：稀釋液100mL白明膠或牛

17、血清白蛋白 （Bovine Serium Albumin ， BSA） 0.5gB2.2.12終止溶液：2mo1/L硫酸（H（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）SO（下標(biāo)始）4（下標(biāo)終）。B2.3 試驗(yàn)步驟82.3.1 包被抗原的制備將 Nm 純培養(yǎng)的菌苔刮到生理鹽水中，離心（3000r/min ， 30min） 洗滌菌體 3 次，再混懸于生理鹽水中， 置 56 30min 滅活， 用比濁法測定菌懸液中細(xì)菌濃度， 用包被液將其稀釋成10（上標(biāo)始 ）6（上標(biāo)終）個菌 /mL 作為包被抗原。 對于 A 群 Nm ， 亦可將 A 群 Nm 多糖菌苗稀釋到 10g/mL進(jìn)行包被。82.3.2 抗原的包被用蒸儲水把酶

18、標(biāo)板各孔沖洗干凈，空干水，置 37c烘干；往每孔中加包被抗原100 L,置4C 過夜；傾出孔內(nèi)液體，用洗滌液沖洗各孔3 次，每次 1min ，并且均在干凈的吸水紙上或紗布上拍打酶標(biāo)板，空干孔內(nèi)的液體。82.3.3 填充空干孔中液體，用 1mL 吸管加填充液，每孔加以 0.25mL ；置室溫 30min ，同上洗滌，空干孔內(nèi)液體；酶標(biāo)板置塑料袋中，密封貯存于4C ，可備用一個月。82.3.4 檢測待檢血清82.3.4.1 病人急性期和恢復(fù)期血清均從此1 ： 2開始，用稀釋液連續(xù)倍比稀釋到第7孔，第8 孔以稀釋液代替血清作為陰性對照之一；酶標(biāo)板置37 培育1h 后同上洗滌。82.3.4.2 加酶結(jié)

19、合物上述酶結(jié)合物用稀釋液稀釋到預(yù)試測定的最適工作濃度，每孔加 100dL，置37C反應(yīng)1h 后同上洗滌酶標(biāo)板。82.3.4.3 每孔加B2.2.10中配制的底物溶液 100科L,置37c反應(yīng)15min。82.3.4.4 終止反應(yīng)每孔加2mol/L硫酸（H（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）SO（下標(biāo)始）4（下標(biāo)終）50科L。82.3.4.5 測光密度值 在 495nm 波長下測定每孔的光密度值，并記錄。82.3.4.6 每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置下列對照：陽性和陰性血清質(zhì)控對照；抗原對照（以稀釋液代替待檢血清，其余同試驗(yàn)組） ；緩沖液對照（ 以包被液和稀釋液代替抗原和待檢血清，其余同試驗(yàn)組 ） 。82.3.4.7 結(jié)果判

20、定若被檢孔的光密度值與平行對照孔的光密度值比值（P/N） > 2,即判斷為陽性反應(yīng)。B3 殺菌力試驗(yàn)83.1 目的應(yīng)用微量殺菌力試驗(yàn)（TTC 法 ）測定病人急性期和恢復(fù)期血清中對Nm 的殺菌抗體水平。 此方法也可用于健康人群的血清抗體測定。83.2 材料83.2.1 靶菌： 對補(bǔ)體的自然殺菌作用具有耐受性， 但對殺菌抗體反應(yīng)敏感的 Nm（A 群 29019 ，B 群和 C 群 Nm） 。83.2.2 稀釋液： Dulbeccos 磷酸鹽緩沖鹽水A液：氯化鈉（NaCl）8.0g ,氯化鉀（KCl）0.2g ,磷酸氫二鈉（Na（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）HPO（下標(biāo) 始）4（下標(biāo)終）1.15g ,

21、磷酸二氫鉀（KH（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）PO（下標(biāo)始）4（下標(biāo)終）0.2g ,蒸儲水 800mL ；B液：氯化鈣（CaCl（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）0.1g,蒸儲水100mL;C液：氯化鎂（MgCl（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終） 6H（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）O）0.1g,蒸儲水100mLo上述三液分別滅菌121C, 15min,置4c備用。需用時按 A液8份，B液和C液各1份的比例混合， pH 為 7.1 。使用時每100mL稀釋液加滅活小兔血清1mL,萬古霉素500dg，多粘菌素B2500單位或硫酸抗敵霉素5000 單位。配就的稀釋液盛于小瓶中，置4 備用2 周。83.2.3 滴定板：底部呈“ U”形的96

22、孔有機(jī)玻璃微滴板，并備用同樣大小的普通玻璃作蓋板。將它們平放在 80c的烤箱內(nèi)烤2h后備用。試驗(yàn)完畢，以約80c的熱水泡板1h殺死靶菌，再以自來水沖洗干凈，并用棉棒拭凈不潔凈的孔。最后以蒸餾水沖洗一次， 37烤干后同上于 80干烤。滴定板使用一段時間后或遇到雜菌污染較嚴(yán)重時， 可用熱水殺死靶菌并沖洗干凈； 在比較稀的硫酸重銘酸鉀清潔液內(nèi)浸泡4h,沖洗干凈后同上處理備用。83.2.4 兔補(bǔ)體83.2.4.1 補(bǔ)體可從幼齡兔或成齡兔血清中篩選， 預(yù)試測定要求它們既不能具有自然殺靶菌的活性， 但加有已知陽性參考血清時應(yīng)產(chǎn)生較高殺菌抗體滴度。 不過， 幼齡兔被選中的機(jī)率較 高。83.2.4.2 將所選

23、家兔從頸動脈放血或抽取全部心血，置4，待血液凝固后盡早分離血清，混合后， 分裝到 2mL 安瓿中， 每只放 1mL 血清。 立即將安瓿置20以下冰箱內(nèi)冷凍過夜，次日進(jìn)行冷凍干燥。 凍干以后再抽樣檢查時， 不應(yīng)出現(xiàn)非特異殺菌反應(yīng)， 特異殺菌抗體滴度在1: 3200以上則保存在一20c以下冰箱內(nèi)，可備用36個月。為減少補(bǔ)體批次間的差異，可將所選定的兔血清混合后進(jìn)行冷凍干燥，再作質(zhì)量檢定，合格者則保存于20以下。83.2.5 氯化三苯四氮吵（Triphenyl Tetrazolium Chloride , TTC）瓊脂培養(yǎng)基（TTC 瓊脂）83.2.5.1 TTC 瓊脂配方：牛肉膏0.5%,氯化鈉0

24、.5%,日本多月東3.0%,可溶性淀粉0.2%,以蒸儲水配制，調(diào)pH7.41.1.1.1 0.5。1.1.1.2 TTC 瓊脂制作上述培養(yǎng)基成分熔化后， 按每 10mL 或 20mL 分裝于大試管， 121滅菌 15min ， 冷卻后置 4 備用。臨用前將培養(yǎng)基加熱熔化，每10mL 培養(yǎng)基加50葡萄糖注射液0.1mL ， 1TTC 水溶液 （4避光以存）0.1mL ，混勻放在45水溶液中待用。1.1.1.3 陽性參考血清用Nm免疫兔制備的診斷血清，未加防腐劑，經(jīng)預(yù)試測定其殺菌抗體滴度較高（1 ： 3200以上）。1.1.1.4 滴管與滴頭采用臨床上輸液用的玻璃輸液接頭作滴管，滴頭采用 12 號

25、輸液針，在砂輪上磨去針頭的斜面部分，使其下口呈圓形。用滴管與滴頭滴稀釋液應(yīng)是40滴/mL ± 2滴/mL。它們可用于滴加稀釋液、補(bǔ)體、靶菌液、TTC瓊脂及待檢血清。如有條件，血清最好用 25 dL移液器稀釋。B3.3 殺菌抗體測定步驟83.3.1 靶菌液的制備83.3.1.1 開啟A、B或C群Nm菌種，接種到巧克力色瓊脂平皿上，37c二氧化碳孵箱或燭缸培養(yǎng)1520h,挑取35個菌落涂于另一平皿，同上培養(yǎng)1015h。83.3.1.2 用 Nm 診斷血清和生理鹽水進(jìn)行玻片凝集及顯微鏡檢查，以核實(shí)菌種。83.3.1.3 菌種被確證以后，取其菌苔，混勻于 2mL 滅菌脫脂牛奶管中，制成濃菌液

26、，分裝若干支小試管，每管約0.2mL,置一20c以下保存，Nm可存活36個月。83.3.1.4 需用靶菌時，取出一支上述牛奶菌種管，熔化后立即轉(zhuǎn)種并放在4冰箱內(nèi)以存，供每日分離靶菌制作菌懸液， 可備用 2 周。 在測定抗體的過程中， 每次所用靶菌傳種的代數(shù)保持一致。83.3.1.5 從所分離的靶菌平皿上挑取35個典型菌落，涂抹轉(zhuǎn)種 1/4巧克力色瓊脂平皿，37c燭缸培養(yǎng)46h,刮取菌苔，于盛有3.5mL左右稀釋液的試管壁上用白金耳將其充分研 磨，制成輕度混濁的均勻菌懸液，其光密度值相當(dāng)于0.1。83.3.1.6 取出上述菌懸液2mL 加到 0.5cm 的比色杯內(nèi)，在波長為 540nm 的分光光

27、度計(jì)上測其光密度值。83.3.1.7 稀釋液用量按式（B1）計(jì)算：X = ODX100.1 （B1）式中：X 稀釋液用量，mL ；OD 光密度值。按照式（B1）計(jì)算稀釋液用量，然后往里加入0.1mL靶菌懸液，此時相當(dāng)于光密度值為0.1的靶菌液作了 10 倍稀釋。 吹吸均勻后， 由其開始再連續(xù)作10 倍稀釋至 10（上標(biāo)始 ） 5（上標(biāo)終 ）稀釋度，以菌液的最終濃度為每毫升含 4000 個菌落形成單位為宜。稀釋時每個稀釋度更換 一個移液槍頭。83.3.1.8 稀釋好的靶菌懸液在1h 內(nèi)用完。若室溫較高，可將菌液管置冰浴中，以防靶菌迅速死亡。83.3.2 殺菌抗體的測定83.3.2.1 先在微滴板

28、每孔內(nèi)加 1滴相當(dāng)于25 dL的稀釋液。83.3.2.2 用移液器從每排第一孔內(nèi)加25dL經(jīng)56c30min滅活的待檢血清，吹吸 510次后吸出25 dL至下一孔，如此作連續(xù)倍比稀釋至最后一孔。每份血清分別用一支移液槍頭。83.3.2.3 從低溫冰箱內(nèi)取出補(bǔ)體，于37溫水中搖動將其速溶，每孔加一滴。若補(bǔ)體已冷凍干燥，可往安瓿內(nèi)加相當(dāng)于補(bǔ)體血清原體積的稀釋液，使其融化后即刻使用。83.3.2.4 每孔加一滴稀釋成合適濃度的靶菌菌液，微滴板置微型振蕩器上中速振蕩5min ，再在37培養(yǎng)25min ，取出后重復(fù)上述振蕩。83.3.2.5 每孔加2滴已熔化冷至45c左右的TTC瓊脂后，微滴板置37c燭

29、缸內(nèi)培養(yǎng)1520h 后觀察結(jié)果。83.3.2.6 每次試驗(yàn)需做下列對照：陽性參考血清對照； 4 孔補(bǔ)體對照（稀釋液、補(bǔ)體、菌液各一滴，檢查補(bǔ)體自然殺菌活性）； 4孔細(xì)菌生長對照（稀釋液、滅活補(bǔ)體和靶菌菌液各1 滴） 。每次檢測時至少每5 塊微滴板中應(yīng)有一組上述三種對照試驗(yàn)。83.3.2.7 往各孔滴完靶菌菌液之后， 應(yīng)將該菌液兩滴分別滴加到一個巧克力色瓊脂平皿的一端，沿著劃好的兩條線傾斜下流，于37燭缸內(nèi)同時培養(yǎng)，次日檢查每滴靶菌的菌落數(shù)及其純度。83.3.2.8 判斷結(jié)果時， 先檢查上述三種對照試驗(yàn)的結(jié)果： 補(bǔ)體的和細(xì)菌生長對照的各孔應(yīng)出現(xiàn)眾多的紅色點(diǎn)狀小菌落； 陽性參考血清應(yīng)達(dá)到原來確定的

30、殺菌滴度。 若所試各孔中紅色點(diǎn)狀菌落數(shù)目明顯地少于補(bǔ)體對照孔或不出現(xiàn)紅色點(diǎn)狀菌落時， 則判斷為殺菌陽性； 如果所試 孔中的菌落數(shù)目接近補(bǔ)體對照孔的一半或更多時，則判斷為殺菌陰性。83.3.2.9 根據(jù)紅色點(diǎn)狀菌落數(shù)目的多少，以符號“”記錄試驗(yàn)結(jié)果。若補(bǔ)體及靶菌生長對照各孔的細(xì)菌正常生長時，應(yīng)出現(xiàn)眾多紅色點(diǎn)狀菌落，可記為“” 。當(dāng)所試各孔與其比較，菌落數(shù)減少30 以下，記為“” ；減少50左右記為“”；減少70左右記為“” ；每孔少于10 個菌落則記為“±” 。以細(xì)菌生長成呈“”及以下者判斷為殺菌陽性；以 “”及以上者判為殺菌陰性。以出現(xiàn)殺菌陽性的血清最高稀釋度為殺菌抗體 的最高滴度。

31、附錄 C(提示的附錄)膠乳凝集試驗(yàn)C1 目的應(yīng)用膠乳凝集試驗(yàn)測定病人CSF、急性期血清和尿中 Nm群特異抗原，輔助流腦臨床診斷。C2 材料C2.1 10%膠乳顆粒(Latex Particles, Lx)懸液，顆粒直徑為 0.81科m。C2.2 從兔免疫血清中提純的抗 A 、 B 和 C 群 Nm 的 IgG 。C2.3 在潔凈玻璃板上，用紅漆畫兩排紅圈，其直徑為 3.5cm 左右，漆干后備用。C2.4 pH8.2 ， 0.1mol/L 硼酸鹽緩沖液。C2.5 BSA 。C2.6 白明膠。C2.7 戊二醛。C2.8 疊氮鈉。C2.9 懷疑流腦病人的 CSF 或急性期血清或尿液。C3 試驗(yàn)方法C

32、3.1 兔抗不同群 Nm 的 IgG 致敏 Lx 。C3.1.1 將 10Lx 懸液用硼酸緩沖液再稀釋80 倍。C3.1.2 取稀釋的 Lx 懸液 1 個體積分別加等體積合適濃度的兔抗不同群 Nm 的 IgG ，置 25mL 容量的三角瓶中。C3.1.3 在 37水浴中旋轉(zhuǎn)(120r/min) 振蕩瓶中的反應(yīng)物，致敏Lx2h 。必要時可在每毫升Lx中加25%戊二醛1020 d L,這將有助于 Lx吸附IgG。C3.1.4 離心致敏過的 Lx(3000r/min ， 30min) ，用 1mL 吸管小心吸取上清液，計(jì)量后棄之；再加含有 0.1BSA 的硼酸鹽緩沖液(Borate Buffered

33、 Solution Containing BSA ， BBSB) ，混懸 Lx ，同上離心，棄上清，除去游離的 IgG ；照此重復(fù)洗滌Lx3 次。C3.1.5用BBSB液再將Lx恢復(fù)到致敏時的濃度，加疊氮鈉至終濃度為 0.1%,置4c備用36 個月。C3.1.6 用正常兔 IgG 同上步驟致敏Ix 作為陰性對照。C3.2 以膠乳凝集試驗(yàn)檢測疑似流腦病人標(biāo)本內(nèi) Nm 群特異性抗原。C3.2.1 病人標(biāo)本的處理： CSF 離心 (3000r/min ， 30min) ，取上清，沉淀部分作細(xì)菌培養(yǎng)；急性期血液 (2mL) ，分離血清，置 56將其滅活30min ；急性期尿液5mL 加 20mL 無水

34、乙醇，置4C 12h,離心(3000r/min , 15min),棄上清，收集沉淀部分加 0.25mL BBSB液將其溶解， 同前離心，小心地吸取上清液待測，不要吸取尿中不溶解的沉渣。C3.2.2 用 BBSB 液將處理過的標(biāo)本從1 ： 2 起連續(xù)倍比稀釋成不同的稀釋度。C3.2.3 用 9 號針頭分別吸取各稀釋度標(biāo)本2 滴滴到玻璃板上的紅圈內(nèi)，其中 1 滴滴到上列一排的紅圈內(nèi)，作為試驗(yàn)組；另 1 滴滴到下列一排的紅圈內(nèi)，作為平行對照組。C3.2.4 往試驗(yàn)組的紅圈內(nèi)各加1 滴免疫的兔IgG 致敏過的 Lx 懸液； 往對照組的紅圈內(nèi)各加1 滴正常兔 IgG 所致敏的 Lx 懸液。C3.2.5

35、輕輕地旋搖玻板，使標(biāo)本與Lx 充分混勻。C3.2.6在12min內(nèi)即可見凝集，5min時凝集更明顯，此時可記錄試驗(yàn)結(jié)果。C3.2.7 若只在試驗(yàn)組的紅圈內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集， 但 Lx 本身與 BBSB 液以及在平行對照組的紅圈內(nèi)皆不出現(xiàn)凝集則判斷為陽性反應(yīng)。此時與陰性對照組比較， Lx 懸液變得較清亮， Lx 明 顯地聚集成較大的顆粒。C3.2.8 在上述病人標(biāo)本中只要有一種標(biāo)本與抗任何一群 Nm 的 IgG 所致敏的 Lx 發(fā)生明顯凝 集反應(yīng)，則說明所檢標(biāo)本中含有Nm 相應(yīng)群特異的抗原，即可輔助臨床診斷為流腦。附錄 D（提示的附錄）以 PCR 檢測病人急性期血清或CSF 中 Nm 的 DNA 特

36、異片段D1 目的應(yīng)用 PCR 檢查病人急性期血清或CSF 中 Nm 的 DNA 特異片段， 對流腦病人進(jìn)行早期診斷。D2 材料D2.1 疑似流腦患者的 CSF 或急性期血清。D2.2 Nm 的模板 DNA 和正常人血清作為對照。D2.3 4XdNTP。D2.4 瓊脂糖。D2.5 溴化乙啶。D2.6 Taq 酶（Promega）。D2.7 引物 1 為：5/ ATTATTCAGACCGCCGGCAG 3'引物 2 為：5/ CCGATAATCAGGCA TCCG 3'。D2.8 液體石蠟。D2.9 無菌去離子水。D2.10 紫外光檢測器。D2.11 PCR 擴(kuò)增儀。D2.12 1

37、0XPCR 反應(yīng)緩沖液1500mmol/L KCl , 100mmol/L Tris HCl ,（室溫，pH8.3）, 15mmol/LMgCl（ 下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）， 0.1（W/V） 明膠。D2.13 載樣緩沖液（0.2溴酚藍(lán)，50蔗糖 ）。D2.14 1 XTBE電泳緩沖液：0.089m ol/L Tris H（下標(biāo)始）3（下標(biāo)終）BO（下標(biāo)始）3（下標(biāo)終）0.002mol/L EDTAD2.15 電泳儀。D2.16 分子量標(biāo)準(zhǔn)：入DNA EcoR I/Hind出。D3 擴(kuò)增程序在 0.5mL Eppendorf 管中分別加入：反應(yīng)物加樣順序體積（WL）終濃度10X緩沖液15.01 X

38、緩沖液4XdNTP混合物24.0200 mol/L 每種 dNTP引物 132.51mol/L引物 242.51mol/L模板 DNA 或待檢標(biāo)本55.0（標(biāo)本需95 加熱5min 預(yù)處理）無菌去離子水630.5（95水浴10min ，快速離心30s）TaqDNA 聚合酶70.5 1u液體石蠟 825.05.0ng DNA/ 科 LD3.1 混勻離心，于72反應(yīng)2min 后即開始循環(huán)。循環(huán)參數(shù)如下：94變性反應(yīng)30s；56退火反應(yīng)30s；72延伸反應(yīng)60s。D3.2 30 個循環(huán)后再72延伸4min 。D3.3 反應(yīng)結(jié)束，取出反應(yīng)管冷至室溫后置4供檢測。D4 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測D4.1取2dL反應(yīng)

39、產(chǎn)物與1科L載樣緩沖液混合。D4.2用含澳化乙咤(0.5 wg/mL)的1.2%瓊脂糖凝膠檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。D4.3 75mm x 48mm微型膠，以 6V/cm電泳1h,電泳緩沖液為1XTBE。D4.4 電泳結(jié)束后，將凝膠置紫外光檢測器上觀察結(jié)果、照相。D4.5 擴(kuò)增產(chǎn)物特異片段的長度為 596 個堿基對。附錄 E(提示的附錄)流行性腦脊髓膜炎治療原則E1 普通型E1.1 一般治療臥床休息，流質(zhì)飲食，必要時鼻飼或靜脈補(bǔ)液。E1.2 對癥治療高熱、頭痛、嘔吐、煩躁或驚厥等，應(yīng)分別給予相應(yīng)處理。E1.3病原治療 輕癥病例首選 SD,疑對磺胺過敏或耐藥者應(yīng)改換其他藥物如青霉素或氯霉 素。E1.3.1磺

40、胺喀咤(SD):成人68g/d,小兒0.150.2g/(kg d),每日總量不超過 6g,加等量 碳酸氫鈉分34次服用，首劑加倍。頻繁嘔吐或不能口服者，應(yīng)改為注射，SD為首選。成人46g/d,小兒0.10.15g/(kg d),分23次肌注或靜脈滴注，其濃度應(yīng)小于 5%。另可用SMZ TMP(復(fù)方新諾明，每片含 SMZ400mg、TMP80mg),成人每8h服2片。小兒 SMZ50mg/(kg - d), TMP 10mg/(kg - d),分 2 次口服。E1.3.2青霉素：單用青霉素，成人 (8002000)萬u/d,小兒(2040)萬u/(kg d),分34 次靜脈滴注，療程 57天。E

41、1.3.3氯霉素：對磺胺、青霉素過敏者或耐藥者可選用。成人24g/d,小兒 50100mg/(kg d),分34次靜脈滴注，療程 57天，新生兒禁用。使用過程中注意觀察骨 髓抑制情況。E1.3.4氨芳青霉素，適用于病情較重和病原不明者。成人46g/d,小兒150300mg/(kg d),分23次靜脈滴注，療程 57天。注意副作用。E1.3.5頭抱氨曝的(Cefotaxime)肌注(靜脈滴注),成人 28g/d,兒童 50200mg/(kg d), 分24次給藥，或頭抱曝的三嗪(Ceftriaxone)每日用藥一次，成人 24g加到5%葡萄糖溶 液50100mL靜脈滴注。兒童肌注15200mg(

42、平均46mg)/kg。此兩種抗生素僅適用于不能 應(yīng)用青霉素和氯霉素的重癥患者。E2 休克型E2.1病因治療：首選青霉素，劑量(2040)萬u/(kg d),多與氯霉素聯(lián)合用藥，病情好轉(zhuǎn)后用法同普通型。E2.2 抗休克治療E2.2.1 補(bǔ)充血容量(擴(kuò)容) ：可選用低分子右旋糖苷，成人500mL 靜脈內(nèi)滴注， 24h 不超過1000mL ，可根據(jù)中心靜脈壓、尿量調(diào)整補(bǔ)液速度。E2.2.2 糾正酸中毒：成人先給5碳酸氫鈉200mL ，后根據(jù)血生化檢查結(jié)果而定。E2.2.3 血管活性藥：擴(kuò)充血容量和糾正酸中毒后，若休克仍未糾正，可應(yīng)用血管活性藥山葭苦堿，劑量0.30.5mg/（kg 次）（兒童劑量酌增

43、），每1020min靜脈推注1次。待面色紅 潤、微循環(huán)改善、尿量增加、血壓回升后，即可延長給藥時間。若應(yīng)用山莨菪堿療效不好，病情有加重趨勢，可改用多巴胺。亦可一開始即首先選用多巴胺1020mg加入100mL 5%10%葡萄糖溶液中靜脈滴入。開始以75100g/min的速度滴入，血壓回升后逐漸調(diào)慢滴速。臨床上以紫紺消失、面唇轉(zhuǎn)紅、脈搏有力、血壓平穩(wěn)、尿量增多等作為停藥指征。E2.2.4抗凝治療：如出現(xiàn) DIC應(yīng)使用肝素治療，劑量 0.51mg/（kg 次），加入10%葡萄糖 溶液40100mL內(nèi)靜脈滴注。必要時每46h重復(fù)一次，一般用藥23次。每次用藥前，需以試管法測定凝血時間，使凝血時間保持在

44、1530min。重癥休克時纖維蛋白溶酶增多， 使血管內(nèi)纖維蛋白溶解而加重出血， 故治療大片出血者， 可先應(yīng)用肝素，首次劑量為 1mg/kg 溶入 20mL10 的葡萄糖溶液或生理鹽水中靜脈推注，繼以1mg/kg溶入10%葡萄糖溶液或生理鹽水 50100mL中，專用一個點(diǎn)滴瓶，在 4h內(nèi)緩慢 滴完。用肝素24次立即見效，用藥時間一般不超過 24h。然后再用6氨基己酸6g（兒童 用量12g/次）加于10%葡萄糖液100mL中靜滴，必要時46h重復(fù)一次。E2.2.5 腎上腺皮質(zhì)激素（激素 ）： 其抗休克作用至今尚無定論。 氫化考的松， 成人用量 300mg/d ，小兒1015mg/（kg d）,分2

45、3次靜脈滴注?；虻厝姿?，成人劑量為 2030mg/d,小兒 為0.5mg/（kg d）,分23次，靜脈滴注。E3 腦膜腦炎型E3.1 抗菌藥物的應(yīng)用同前，治療重點(diǎn)為減輕腦水腫，防止腦疝和呼吸衰竭。E3.2脫水劑應(yīng)用：以20%甘露醇為主，劑量 12g/（kg 次）。根據(jù)情況每46或8h靜脈快速滴注 （30min 內(nèi)注完）或推注。脫水劑用至顱內(nèi)壓增高癥狀好轉(zhuǎn)，即可逐漸減量或延長給藥時間，到完全停藥需23天。如出現(xiàn)腦疝，可給速尿2040mg加入20%甘露醇或25%山梨醇內(nèi)靜脈滴注。E3.3 腎上腺皮質(zhì)激素的應(yīng)用同前。E3.4 呼吸衰竭：用呼吸興奮劑如山梗菜堿、可拉明、利他林或回蘇靈等。吸氧、吸痰、

46、保持氣道通暢。如呼吸驟停，立即喉插管，或氣管切開，行人工呼吸。E4 混合型應(yīng)根據(jù)病情，參照休克型及腦膜腦炎型治療。附錄 F（提示的附錄）流腦預(yù)防的原則 流腦是由 Nm 經(jīng)空氣飛沫傳播而引起的一種急性傳染病，病死率高，具有季節(jié)性發(fā)病高峰，在高發(fā)地區(qū)還具有周期性流行的特點(diǎn)。 兒童發(fā)病率比成人發(fā)病率高， 90以上的病例是由 A 、B和C群Nm引起的。雖然目前在我國由B群Nm致病有所增多，但仍以A群Nm引起的病例最多見。 Nm 感染性強(qiáng)，人被感染后大多表現(xiàn)為鼻咽部帶菌狀態(tài)或出現(xiàn)上呼吸道輕度炎癥，只有少數(shù)受感染者發(fā)展為流腦病人。 A 群 Nm 可以引起世界范圍的流腦大流行，而 B群和 C 群 Nm 主要

47、引起局部地區(qū)流行或散發(fā)。人被Nm 感染后可以獲得一定的免疫力。盡管 Nm 感染性強(qiáng)， 但它對外界的抵抗力較弱， 在外環(huán)境中存活能力差。 因此對流腦的預(yù)防應(yīng)采取以注射菌苗為主的綜合防治措施，重點(diǎn)預(yù)防的對象是易感人群。F1 平時的預(yù)防措施F1.1 開展群眾性的衛(wèi)生運(yùn)動，預(yù)防此病傳播。搞好居民居住地方、托兒機(jī)構(gòu)、中小學(xué)校、廠礦、 工地、商場和影劇院等場所的衛(wèi)生狀況，對減少流腦的播散具有重要意義。 因此在此 病流行前期要有計(jì)劃地開展幾次群眾性衛(wèi)生運(yùn)動， 清掃周圍環(huán)境與室內(nèi)衛(wèi)生， 注意通風(fēng)、 換 氣、勤曬衣被和兒童玩具。F1.2 加強(qiáng)體育鍛煉和營養(yǎng)，增強(qiáng)體質(zhì)，提高機(jī)體抵御疾病的能力。F1.3 宣傳防治流腦的科普知識，增強(qiáng)廣大群眾預(yù)防流腦的意識，使病人能得到早發(fā)現(xiàn)、早報(bào)告、早診斷、早隔離治療并使疫點(diǎn)得到早處理。F1.4 堅(jiān)持做好流腦流行病學(xué)監(jiān)測。F1.4.1 疫情監(jiān)測：F1.4.1.1 建立健全的流腦疫情報(bào)告網(wǎng)， 經(jīng)常檢查疫情報(bào)告和漏報(bào)的情況， 提高疫情報(bào)告的質(zhì) 量。F1.4.1.2 與過去做比較，分析疫情升降水平和發(fā)病的趨勢。F1.4.1.3 比較病例年齡組百分構(gòu)成比例的變化。F1.4.1.4 分析病例地區(qū)分布的特點(diǎn)，散發(fā)、局部暴發(fā)或地區(qū)流行。流行時疫情擴(kuò)散的路線與范圍以及本地與毗連地區(qū)發(fā)病的關(guān)系。F1.4.2 病原學(xué)和血清學(xué)監(jiān)測：F1.4.2.1 收集疑似流腦病人CSF