PCR詳細講解蒼松書苑

1、1深層分析2深層分析3深層分析模板模板（templatetemplate）：基因組、質(zhì)粒：基因組、質(zhì)粒dnadna、cdnacdna，也可，也可以是細菌、組織樣品等。以是細菌、組織樣品等。引物引物（primerprimer）：確定擴增目的序列的特異性；確定：確定擴增目的序列的特異性；確定擴增產(chǎn)物長度。擴增產(chǎn)物長度。dnadna聚合酶聚合酶（dna polymerasedna polymerase）：推動）：推動pcrpcr反應(yīng)進行的機反應(yīng)進行的機器。擴增效率和保真性。器。擴增效率和保真性。緩沖液緩沖液（bufferbuffer）：控制體系的：控制體系的phph和離子強度，為和離子強度，為dna

2、dna聚合酶提供最佳工作環(huán)境。聚合酶提供最佳工作環(huán)境。脫氧核苷酸脫氧核苷酸（dntpdntp）：dnadna的基本組成元件，包括的基本組成元件，包括datpdatp、 dgtp dgtp、 dctp dctp、 dttp dttp。mgmg2+2+、k k+ +、增強劑、增強劑4深層分析1.1.變性變性：高溫使雙鏈：高溫使雙鏈dnadna解離形成單鏈解離形成單鏈（9595，30s30s）。）。2.2.退火退火：低溫下，引物與模板：低溫下，引物與模板dnadna互補互補區(qū)結(jié)合區(qū)結(jié)合（4545 6565，30s30s） 。3.3.延伸延伸：中溫延伸。：中溫延伸。dnadna聚合酶催化以聚合酶催化以

3、引物為起始點的引物為起始點的dnadna鏈延伸反應(yīng)（鏈延伸反應(yīng)（ 7272，3030 60s 60s ）。）。5深層分析6深層分析7深層分析8深層分析9深層分析10深層分析11深層分析12深層分析13深層分析 理論理論：2 2n n遞增（遞增（n n為循環(huán)次數(shù)），為循環(huán)次數(shù)），如果擴增如果擴增3030循環(huán)，目標循環(huán)，目標dnadna可增加可增加2 23030也就是也就是10109 9倍。倍。 實際實際：由于引物和底物的消耗，：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴增產(chǎn)物酶活力的下降等因素，擴增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實際上進行性形式，所以實

4、際上進行3030個循個循環(huán)后，擴增倍數(shù)一般可達環(huán)后，擴增倍數(shù)一般可達10106 6 10107 7。14深層分析1.1.早期早期（e e期）期）: :引物在單鏈引物在單鏈dnadna模板上搜索互補序列模板上搜索互補序列 ，并與特定位點雜交。并與特定位點雜交。2.2.中期中期（m m期）：擴增反應(yīng)期）：擴增反應(yīng)順利進行，產(chǎn)物呈指數(shù)型增順利進行，產(chǎn)物呈指數(shù)型增長。長。3.3.晚期晚期（l l期）：平臺期，期）：平臺期，dnadna聚合酶過度損耗或者產(chǎn)聚合酶過度損耗或者產(chǎn)物的抑制。物的抑制。15深層分析預(yù)變性 94 5min變性 94 30s退火 4565 30s延伸 72 30s終延伸 72 7m

5、in循環(huán)循環(huán)16深層分析pcrpcr反應(yīng)條件反應(yīng)條件9494 5min5min9494 30s30s56.256.2 30s30s7272 30s30s7272 7min7min4 4 pc1-p20pc1-p20：模板：基因組模板：基因組dnadna；產(chǎn)物：；產(chǎn)物：506bp506bp舉個例子舉個例子pcrpcr體系（體系（10 l10 l）模板：模板：1 l1 l上游引物：上游引物：0.2 l0.2 l下游引物：下游引物：0.2 l0.2 leasy taq easy taq 酶：酶：0.1 l0.1 leasy taq buffereasy taq buffer：1 l1 ldntpdn

6、tp：0.8 l0.8 lddhddh2 2o o：6.7 l6.7 l3030個循環(huán)個循環(huán)17深層分析1.1.避免避免pcrpcr試劑的污染試劑的污染2.2.最適合的反應(yīng)條件最適合的反應(yīng)條件3.3.設(shè)置對照組：設(shè)置對照組：pcrpcr空白對照：空白對照：在反應(yīng)體系中剔除反應(yīng)模板。在反應(yīng)體系中剔除反應(yīng)模板。pcrpcr陰性對照：陰性對照：即反應(yīng)體系中用無關(guān)的基因片即反應(yīng)體系中用無關(guān)的基因片段代替目的模板。段代替目的模板。pcrpcr陽性對照：陽性對照：即反應(yīng)體系中以已知能夠成功即反應(yīng)體系中以已知能夠成功進行特異性擴增的模板。進行特異性擴增的模板。18深層分析1.1.為什么完全沒有為什么完全沒有

7、pcrpcr擴增產(chǎn)物？擴增產(chǎn)物？試劑質(zhì)量問題或者加樣時出錯，導(dǎo)致反應(yīng)試劑質(zhì)量問題或者加樣時出錯，導(dǎo)致反應(yīng)體系不完整。體系不完整。聚合酶失活或反應(yīng)體系中有聚合酶抑制劑。聚合酶失活或反應(yīng)體系中有聚合酶抑制劑。pcrpcr儀溫度控制不精確。儀溫度控制不精確。模板模板dnadna發(fā)生降解。發(fā)生降解。引物或反應(yīng)溫度設(shè)計不合理引物或反應(yīng)溫度設(shè)計不合理靶片段靶片段gcgc含量過高或擴增對象長含量過高或擴增對象長常見問題常見問題19深層分析2.2.為什么出現(xiàn)多條非特異性條帶？為什么出現(xiàn)多條非特異性條帶？反應(yīng)體系被污染。反應(yīng)體系被污染。引物特異性差。引物特異性差。退火溫度不合適。退火溫度不合適。常見問題常見問題

8、20深層分析3.3.為什么為什么pcrpcr產(chǎn)物很少？產(chǎn)物很少？聚合酶活性過低。聚合酶活性過低。循環(huán)次數(shù)偏低。循環(huán)次數(shù)偏低。模板模板dnadna濃度過低。濃度過低。常見問題常見問題21深層分析4.4.為什么為什么pcrpcr產(chǎn)物出現(xiàn)片狀拖尾？產(chǎn)物出現(xiàn)片狀拖尾？dnadna聚合酶過多或酶活性差。聚合酶過多或酶活性差。dntpdntp和和mgmg2+2+濃度過高。濃度過高。退火溫度過低，退火溫度過低，pcrpcr循環(huán)數(shù)偏多。循環(huán)數(shù)偏多。模板模板dnadna用量過大或模板用量過大或模板dnadna不純。不純。引物特異性差、引物間形成二聚體導(dǎo)致非引物特異性差、引物間形成二聚體導(dǎo)致非特異擴增。特異擴增。

9、常見問題常見問題22深層分析普通普通pcrpcr儀儀溫度梯度溫度梯度pcrpcr儀儀23深層分析實時熒光定量實時熒光定量pcrpcr儀儀24深層分析25深層分析 為了找到一對合適的核苷酸片段，為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板使其能有效地擴增模板dnadna序列。序列。 引物是引物是pcrpcr特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，同特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，同時也與時也與pcrpcr擴增的效率密切相關(guān)。擴增的效率密切相關(guān)。引物設(shè)計的最重要的原則：引物設(shè)計的最重要的原則：最大限度最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。能減少非特異性擴增。引物設(shè)計的目的引

10、物設(shè)計的目的26深層分析1 1、引物應(yīng)具有足夠的特異性。、引物應(yīng)具有足夠的特異性。 如果需要從如果需要從基因組基因組等較復(fù)雜的模板中擴等較復(fù)雜的模板中擴增特定的增特定的dnadna序列，則需要考慮目的序列，則需要考慮目的dnadna序列序列的的保守性保守性，盡量避免所選引物設(shè)計區(qū)域序列，盡量避免所選引物設(shè)計區(qū)域序列的的非特異性非特異性。 引物與非特異序列的同源性不超過引物與非特異序列的同源性不超過70%70%或有連續(xù)或有連續(xù)8 8個互補堿基個互補堿基。 ncbi primer blastncbi primer blast 引物設(shè)計的基本原則引物設(shè)計的基本原則27深層分析2 2、避開易形成二級結(jié)

11、構(gòu)的模板序列區(qū)域。、避開易形成二級結(jié)構(gòu)的模板序列區(qū)域。 分子內(nèi)互補、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、分子間互補分子內(nèi)互補、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、分子間互補。 二級結(jié)構(gòu)會增加引物與模板雜交以及二級結(jié)構(gòu)會增加引物與模板雜交以及pcrpcr的困的困難，因此要盡可能避開這種序列區(qū)域。難，因此要盡可能避開這種序列區(qū)域。 用有關(guān)軟件預(yù)測用有關(guān)軟件預(yù)測mrnamrna的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)。的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)。 引物設(shè)計的基本原則引物設(shè)計的基本原則28深層分析29深層分析3 3、引物長度一般為、引物長度一般為18-3018-30個堿基之間。個堿基之間。 引物長度與反應(yīng)的特異性和解鏈溫度成引物長度與反應(yīng)的特異性和解鏈溫度成正相關(guān)正相關(guān)。過短：過短：擴增特

12、異性下降擴增特異性下降過長：過長：引物自身形成二級結(jié)構(gòu)，以及引物二引物自身形成二級結(jié)構(gòu)，以及引物二聚體。聚體。引物設(shè)計的基本原則引物設(shè)計的基本原則30深層分析4 4、g+cg+c含量一般為含量一般為40%-60%40%-60% 引物的堿基組成也會對引物的解鏈溫度引物的堿基組成也會對引物的解鏈溫度產(chǎn)生影響。產(chǎn)生影響。g+cg+c含量過低：含量過低：引物解鏈溫度低，引物易于引物解鏈溫度低，引物易于從模板上解離。從模板上解離。g+cg+c含量過高：含量過高：引物解鏈溫度高，易與非特引物解鏈溫度高，易與非特異性序列雜交，出現(xiàn)非特異性擴增條帶。異性序列雜交，出現(xiàn)非特異性擴增條帶。引物設(shè)計的基本原則引物設(shè)

13、計的基本原則31深層分析5 5、t tm m值之差應(yīng)小于值之差應(yīng)小于1 1，最適退火溫度，最適退火溫度在在55-6055-60。 一對引物的一對引物的tmtm值差過大可直接導(dǎo)致值差過大可直接導(dǎo)致pcrpcr擴增效率下降或失敗。擴增效率下降或失敗。 對于對于20bp20bp左右的引物：左右的引物： t tm m（）=2=2（a+ta+t）+4+4（g+cg+c） 一般情況下，一般情況下，pcrpcr的最佳退火溫度比引的最佳退火溫度比引物物t tm m值低值低5 5左右。左右。引物設(shè)計的基本原則引物設(shè)計的基本原則32深層分析6 6、引物中四種堿基最好是隨機分布的、引物中四種堿基最好是隨機分布的 避

14、免避免4 4個以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重復(fù)。個以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重復(fù)。特別是引物的特別是引物的33端端不應(yīng)有連續(xù)不應(yīng)有連續(xù)3 3個個g g或或c c，否，否則會使引物在則會使引物在g+cg+c富集序列區(qū)域產(chǎn)生錯配，富集序列區(qū)域產(chǎn)生錯配，降低擴增的特異性。降低擴增的特異性。引物設(shè)計的基本原則引物設(shè)計的基本原則33深層分析7 7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列。序列。 引物自身互補引物自身互補發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)夾結(jié)構(gòu) 引物之間互補引物之間互補二聚體二聚體 引物引物自身自身連續(xù)互補堿基不應(yīng)超過連續(xù)互補堿基不應(yīng)超過3 3個個，引物引物之間之間連續(xù)互補堿基不應(yīng)超過連續(xù)互補堿

15、基不應(yīng)超過4 4個個，尤其，尤其避免避免33端的互補重疊。端的互補重疊。引物設(shè)計的基本原則引物設(shè)計的基本原則34深層分析8 8、引物的、引物的55端可以修飾，端可以修飾，33端不可端不可以修飾。以修飾。 引物的引物的55端決定著端決定著pcrpcr產(chǎn)物的長度，它產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大，可以被修飾而不影對擴增特異性影響不大，可以被修飾而不影響擴增的特異性。如：加酶切位點、標記生響擴增的特異性。如：加酶切位點、標記生物素、引入點突變等。物素、引入點突變等。 由于延伸是從由于延伸是從33端開始的，所以不能端開始的，所以不能進行任何修飾。進行任何修飾。引物設(shè)計的基本原則引物設(shè)計的基本原則3

16、5深層分析9 9、引物的、引物的33端不可以端不可以a a結(jié)尾。結(jié)尾。 引物引物33端錯配時，不同堿基引發(fā)效率端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，存在著很大的差異，當末位的堿基為當末位的堿基為a a時，時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為而當末位鏈為t t時，錯配的引發(fā)效率大大降時，錯配的引發(fā)效率大大降低，低，g g、c c錯配的引發(fā)效率介于錯配的引發(fā)效率介于a a、t t之間，所之間，所以以33端最好選擇端最好選擇t t。引物設(shè)計的基本原則引物設(shè)計的基本原則36深層分析1010、引物、引物33端要避開密碼子的第端要避開密碼子的

17、第3 3位。位。 如擴增序列位于基因編碼區(qū)域，引物如擴增序列位于基因編碼區(qū)域，引物33端不要終止于密碼子的第端不要終止于密碼子的第3 3位，因密碼子的位，因密碼子的第第3 3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。效率。引物設(shè)計的基本原則引物設(shè)計的基本原則37深層分析1 1、避免重復(fù)堿基，尤其是、避免重復(fù)堿基，尤其是g g。2 2、引物退火溫度在、引物退火溫度在58-6058-60之間。之間。3 3、g+cg+c為為30-80%30-80%。 4 4、33端最后端最后5 5個堿基內(nèi)不能有多于個堿基內(nèi)不能有多于2 2個的個的g g或或c c。5 5、引物的產(chǎn)物大

18、小一般在、引物的產(chǎn)物大小一般在80-250bp80-250bp之之間；間；80-150 bp80-150 bp最為合適（可以延長至最為合適（可以延長至300 bp300 bp）。）。real-time pcrreal-time pcr引物設(shè)計原則引物設(shè)計原則38深層分析6 6、要特別注意避免引物二聚體和非特、要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。異性擴增的存在。7 7、real-time pcrreal-time pcr引物的擴增產(chǎn)物應(yīng)引物的擴增產(chǎn)物應(yīng)跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，以避免基因組接頭區(qū)，以避免基因組dnadna污染影響。污染影響。

19、 real-time pcrreal-time pcr引物設(shè)計原則引物設(shè)計原則39深層分析primer premier 5.0primer premier 5.0oligo 6oligo 6primer 3primer 3（在線）（在線）primer-blastprimer-blast（在線）（在線）引物設(shè)計常用軟件引物設(shè)計常用軟件40深層分析file new dna sequencefile new dna sequence粘貼模板序列粘貼模板序列41深層分析42深層分析引物搜索引物搜索43深層分析引物位置引物位置產(chǎn)物大小產(chǎn)物大小引物長度引物長度44深層分析45深層分析46深層分析47深層分

20、析48深層分析49深層分析50深層分析oligooligo51深層分析52深層分析53深層分析54深層分析55深層分析primer blastprimer blast56深層分析57深層分析58深層分析59深層分析60深層分析61深層分析 由一條由一條rnarna單鏈轉(zhuǎn)錄為互補單鏈轉(zhuǎn)錄為互補dnadna（cdnacdna）稱作逆轉(zhuǎn)錄）稱作逆轉(zhuǎn)錄pcrpcr（reverse reverse transcription pcrtranscription pcr，rt-pcrrt-pcr），由依），由依賴賴rnarna的的dnadna聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。成。 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄

21、pcrpcr的原理的原理62深層分析逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄pcrpcr的原理的原理63深層分析逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄pcrpcr的反應(yīng)體系的反應(yīng)體系1 1、模板、模板rnarna2 2、逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶3 3、逆轉(zhuǎn)錄引物逆轉(zhuǎn)錄引物64深層分析65深層分析66深層分析67深層分析變性 94 30s 93-9693-96，較高的溫度變性，較高的溫度變性更快更徹底，尤其是對富含更快更徹底，尤其是對富含g+cg+c的靶序列而言。的靶序列而言。68深層分析退火 4565 30s 退火溫度與時間取決于引物的退火溫度與時間取決于引物的堿基組成堿基組成、長度長度和和濃度濃度。退火溫度。退火溫度可以通過計算推斷，通常采用可以通過

22、計算推斷，通常采用溫度溫度梯度梯度pcrpcr的方法進行摸索。的方法進行摸索。 45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 mpc1-p20 pc1-p20 退火溫度摸索退火溫度摸索69深層分析延伸 72 30s 延伸的溫度通常為所以延伸的溫度通常為所以dnadna聚合聚合酶的最適工作溫度，一般為酶的最適工作溫度，一般為7272；延伸的時間主要取決于延伸的時間主要取決于目的片段的目的片段的大小大小，不同種類的聚合酶的合成效，不同種類的聚合酶的合成效率也不同，因此還與率也不同，因此還與dnadna聚合酶的種聚合酶的種類類

23、有關(guān)。有關(guān)。 easy taq easy taq：1-2kb/min1-2kb/min transstart taq:1-2kb/min transstart taq:1-2kb/min fastpfu: 2-4kb/min fastpfu: 2-4kb/min70深層分析循環(huán)數(shù)：循環(huán)數(shù)： 在其他參數(shù)都已優(yōu)化的條件下，在其他參數(shù)都已優(yōu)化的條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列的初始濃最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列的初始濃度。一般情況下度。一般情況下30-3530-35個循環(huán)即可。個循環(huán)即可。循環(huán)數(shù)太多：循環(huán)數(shù)太多：會增加非特異擴增產(chǎn)會增加非特異擴增產(chǎn)物的數(shù)量和復(fù)雜性。物的數(shù)量和復(fù)雜性。循環(huán)數(shù)太少：循環(huán)數(shù)太少：

24、pcrpcr產(chǎn)量太低。產(chǎn)量太低。71深層分析逆轉(zhuǎn)錄引物：逆轉(zhuǎn)錄引物： （1 1）隨機六聚核苷酸引物）隨機六聚核苷酸引物 僅長僅長6 6個核苷酸，每個核苷酸位點上隨個核苷酸，每個核苷酸位點上隨機加入機加入4 4中不同的脫氧核苷酸，因此是中不同的脫氧核苷酸，因此是4 46 6中中不同引物的集合體。不同引物的集合體。 所有所有rnarna分子均可以充當模板，合成的分子均可以充當模板，合成的cdnacdna中有中有96%96%來自來自rrnarrna。72深層分析逆轉(zhuǎn)錄引物：逆轉(zhuǎn)錄引物： （2 2）oligooligo（dtdt） 僅由僅由dttpdttp構(gòu)成，長度一般為構(gòu)成，長度一般為18-18-2

25、424個核苷酸。個核苷酸。 識別識別mrnamrna的的33端端polypoly（a a）尾，）尾，因此僅因此僅mrnamrna可被逆轉(zhuǎn)錄。可被逆轉(zhuǎn)錄。73深層分析逆轉(zhuǎn)錄引物：逆轉(zhuǎn)錄引物： （3 3）特異性引物）特異性引物 能與目標能與目標rnarna堿基序列互補的寡堿基序列互補的寡核苷酸引物，僅產(chǎn)生待分析基因的核苷酸引物，僅產(chǎn)生待分析基因的cdnacdna。74深層分析半定量半定量 rt-pcr75深層分析基本概念基本概念半定量rt-pcr（semi-quantitatie reverse transcription and polymerase chain reaction ,sqrt-p

26、cr）是常用的一種簡捷、特異的定量rna測定方法，通過mrna反轉(zhuǎn)錄成cdna，再進行pcr擴增，并測定pcr產(chǎn)物的數(shù)量，可以推測樣品中特異mrna的相對數(shù)量。定量rt-pcr（quantitatie reverse transcription and polymerase chain reaction ,qrt-pcr）是在用一步法或兩步法，在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個pcr進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。76深層分析灰度值（iod值） 用凝膠成像系統(tǒng)自帶的分析軟件分析目的條帶的平均密度值，也稱為灰度用凝膠成像系統(tǒng)自帶的分析軟件分析目的條帶

27、的平均密度值，也稱為灰度值。是值。是densitydensity和和areaarea的乘積。的乘積。平臺效應(yīng) pcrpcr擴增屬于酶促反應(yīng)，所以，擴增屬于酶促反應(yīng)，所以，dnadna擴增過程遵循酶促動力學(xué)原理。靶擴增過程遵循酶促動力學(xué)原理。靶dnadna片段的擴增最初表現(xiàn)為直線上升，隨著靶片段的擴增最初表現(xiàn)為直線上升，隨著靶dnadna片段的逐漸積累，當引物片段的逐漸積累，當引物- -模模板板/dna/dna/聚合酶達到一定比值時，酶的促化反應(yīng)趨于飽和，此時靶聚合酶達到一定比值時，酶的促化反應(yīng)趨于飽和，此時靶dnadna產(chǎn)物產(chǎn)物的濃度不再增加，即出現(xiàn)所謂平臺效應(yīng)。的濃度不再增加，即出現(xiàn)所謂平臺

28、效應(yīng)。管家基因 持家基因持家基因(house-keeping genes)(house-keeping genes)：又稱管家基因，是指所有細胞中均要：又稱管家基因，是指所有細胞中均要表達的一類基因表達的一類基因, ,其產(chǎn)物是對維持細胞基本生命活動所必需的。管家基因其產(chǎn)物是對維持細胞基本生命活動所必需的。管家基因表達水平受環(huán)境因素影響較小，而是在個體各個生長階段的大多數(shù)、或幾表達水平受環(huán)境因素影響較小，而是在個體各個生長階段的大多數(shù)、或幾乎全部組織中持續(xù)表達，或變化很小。它的表達只受啟動序列或啟動子與乎全部組織中持續(xù)表達，或變化很小。它的表達只受啟動序列或啟動子與rnarna聚合酶相互作用的影

29、響，而不受其他機制調(diào)節(jié)。聚合酶相互作用的影響，而不受其他機制調(diào)節(jié)。77深層分析基本原理基本原理 pcr pcr擴增反應(yīng)是酶促反應(yīng)，遵循酶促動力學(xué)原擴增反應(yīng)是酶促反應(yīng)，遵循酶促動力學(xué)原理，理，開始的循環(huán)內(nèi)擴增產(chǎn)物呈指數(shù)積累，產(chǎn)物與開始的循環(huán)內(nèi)擴增產(chǎn)物呈指數(shù)積累，產(chǎn)物與模板呈線性關(guān)系模板呈線性關(guān)系。半定量。半定量rt-pcrrt-pcr技術(shù)正是利用技術(shù)正是利用產(chǎn)產(chǎn)物與模板量的這一線性關(guān)系物與模板量的這一線性關(guān)系，通過擴增產(chǎn)物來對，通過擴增產(chǎn)物來對比總比總rnarna中目的基因的表達。中目的基因的表達。78深層分析基本流程基本流程79深層分析注意的問題注意的問題rna的提取的提取做做rtrt前必需測

30、前必需測rnarna濃度，常用濃度，常用500ng500ng或或1ug1ug。a260/a280a260/a280和和a260/a230a260/a230a260/a280a260/a280在在1.8-2.01.8-2.0時，認為時，認為rnarna中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，當中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，當用用tristris作為緩沖液檢測吸光度時，作為緩沖液檢測吸光度時，r r值可能會大于值可能會大于2 2（一般應(yīng)該是（一般應(yīng)該是2.22.2的）。的）。當當r1.8r2.2r2.2時，說明時，說明rnarna已已經(jīng)水解成單核酸了。經(jīng)水解成單核酸了。a230a23

31、0表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、鹽（胍鹽）等，較純凈的核酸表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、鹽（胍鹽）等，較純凈的核酸a260/a230a260/a230的比值大于的比值大于2.0 2.0 。如果如果rnarna樣品的樣品的260/280=1-1.5, 260/230=1-1.5260/280=1-1.5, 260/230=1-1.5，那么污染原因就應(yīng)該考慮是酚殘留。，那么污染原因就應(yīng)該考慮是酚殘留。如果如果rnarna樣品的樣品的260/280=2260/280=2，260/2301260/2301，那么污染原因就應(yīng)該考慮是胍鹽殘留。，那么污染原因就應(yīng)該考慮是胍鹽殘留。80深

32、層分析注意的問題注意的問題rna的電泳圖譜一般的，一般的，rnarna的電泳都是用變性膠進行的，但是如果僅僅是為了檢測的電泳都是用變性膠進行的，但是如果僅僅是為了檢測rnarna的的質(zhì)量，用普通的瓊脂糖膠就可以了。質(zhì)量，用普通的瓊脂糖膠就可以了。電泳的目的是在于檢測電泳的目的是在于檢測28s28s和和18s18s條帶的完整性和他們的比值，或者是條帶的完整性和他們的比值，或者是mrna mrna 的完整性。一般的，如果的完整性。一般的，如果28s28s和和18s18s條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且邊緣清晰），并且28s28s的亮度在的亮度在1

33、8s18s條帶的兩倍以上，條帶的兩倍以上，rnarna的質(zhì)量是好的。的質(zhì)量是好的。注意的問題81深層分析注意的問題注意的問題引物設(shè)計所設(shè)計引物的擴增效率和特異性要所設(shè)計引物的擴增效率和特異性要好，一般選擇在基因的好，一般選擇在基因的cdscds區(qū)域設(shè)計區(qū)域設(shè)計引物，在可能的情況下將引物，在可能的情況下將pcrpcr引物置引物置于基因的不同外顯子上以消除基因于基因的不同外顯子上以消除基因和和mrnamrna的共線性。的共線性。注意的問題82深層分析注意的問題注意的問題內(nèi)參的選擇為了客觀地比較不同樣本中目標基因表達量的相對多少，消除由于反轉(zhuǎn)錄為了客觀地比較不同樣本中目標基因表達量的相對多少，消除由

34、于反轉(zhuǎn)錄時總時總rnarna濃度差異造成的誤差，要選擇合適的濃度差異造成的誤差，要選擇合適的controlcontrol基因。經(jīng)常用于基因。經(jīng)常用于rt-rt-pcrpcr法的法的controlcontrol有：有：gapdhgapdh、-actin-actin、18s rrna18s rrna、28s rrna28s rrna等等83深層分析注意的問題注意的問題同管擴增或異管擴增的選擇同管擴增的優(yōu)點：保證擴增效率一致。同管擴增的優(yōu)點：保證擴增效率一致。 缺點：兩種基因相互競爭，會影響擴增的進程。缺點：兩種基因相互競爭，會影響擴增的進程。分管擴增的優(yōu)點：保證每個基因的擴增進程優(yōu)化。分管擴增的優(yōu)

35、點：保證每個基因的擴增進程優(yōu)化。 缺點：擴增效率不能保證一致。缺點：擴增效率不能保證一致。注意的問題84深層分析注意的問題注意的問題pcr循環(huán)數(shù)的確定 最好選線性期的開始階段，但是要在你的凝膠成像最好選線性期的開始階段，但是要在你的凝膠成像分辨范圍內(nèi)，所以選一個這兩種的契合點。分辨范圍內(nèi)，所以選一個這兩種的契合點。 actinactin和和gapdh28-30gapdh28-30，否則增加模板量，否則增加模板量注意的問題85深層分析注意的問題注意的問題其他擴增條件固定（時間）擴增條件固定（時間） 循環(huán)數(shù)、循環(huán)時間、變性時間、退火和延伸、升降溫的速度循環(huán)數(shù)、循環(huán)時間、變性時間、退火和延伸、升降溫

36、的速度體系固定（體系固定（pcrmixpcrmix） dntpsdntps、引物、反應(yīng)模板、引物、反應(yīng)模板、dnadna聚合酶聚合酶pcrpcr儀固定儀固定凝膠濃度凝膠濃度ebeb濃度濃度梳子的選擇梳子的選擇掃膠（曝光）掃膠（曝光）注意的問題86深層分析結(jié)果分析結(jié)果分析將要比較的兩個樣品的內(nèi)參調(diào)成一將要比較的兩個樣品的內(nèi)參調(diào)成一樣的亮度；樣的亮度；根據(jù)擴增內(nèi)參時加入的根據(jù)擴增內(nèi)參時加入的cdnacdna量，進量，進行目標基因的行目標基因的pcrpcr擴增；擴增；電泳掃描后，計算灰度值，先用一電泳掃描后，計算灰度值，先用一個標本的目標和內(nèi)參進行比較，然個標本的目標和內(nèi)參進行比較，然后用這個相對值

37、再去和其他你所要后用這個相對值再去和其他你所要比較的平行組進行比較，一般每組比較的平行組進行比較，一般每組3 3個樣本以上。個樣本以上。結(jié)果分析87深層分析實時熒光定量實時熒光定量pcr技術(shù)介紹技術(shù)介紹(real time quantitative pcr)88深層分析實時熒光定量實時熒光定量pcr定義定義 在在pcrpcr反應(yīng)體系中加入反應(yīng)體系中加入熒光基團熒光基團，利用熒，利用熒光信號累積光信號累積實時監(jiān)測實時監(jiān)測整個整個pcrpcr進程，最后通進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法 89深層分析實時熒光定量實時熒光定量pcr pcr 原理

38、原理 實時原理實時原理 常常 規(guī)規(guī) pcrpcr技術(shù)：技術(shù)： 對對pcrpcr擴增反應(yīng)的擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物終點產(chǎn)物進行定量和定性分析進行定量和定性分析 無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應(yīng)實時無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測檢測實時定量實時定量pcrpcr技術(shù)：技術(shù)： 利用利用熒光信號的變化實時檢測熒光信號的變化實時檢測pcrpcr擴增反應(yīng)中擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過，通過ctct值值和標準和標準曲線的分析對曲線的分析對起始模板起始模板進行進行定量分析定量分析90深層分析實時熒光定量實時熒光定量pcrpcr原理定量原理原理定量原理介紹三

39、個概念：介紹三個概念： 擴增曲線、熒光閾值、擴增曲線、熒光閾值、ctct值值如何對起始模板定量？如何對起始模板定量？通過通過ct值和標準曲線對值和標準曲線對起始模板起始模板進行定量分析進行定量分析91深層分析實時熒光定量實時熒光定量pcr pcr 原理原理 - - 擴增曲線擴增曲線擴增曲線圖：擴增曲線圖： 橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（cycle）；縱坐標：熒光強度 每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集熒光基團熒光基團熒光檢測元件熒光檢測元件92深層分析實時熒光定量實時熒光定量pcr pcr 原理原理 -熒光閾值熒光閾值熒光信號閾值熒光信號閾值 （threshold threshold ）：q 前15個循環(huán)信

40、號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值q 熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍q 手動 設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段q 真正的信號:熒光信號超過域值93深層分析實時熒光定量實時熒光定量pcr pcr 原理原理 -ct值ctct值的定義值的定義： pcr擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)c(t) value 94深層分析實時熒光定量實時熒光定量pcr pcr 原理原理 -ct值的重現(xiàn)性橫軸：橫軸：pcr反映循環(huán)數(shù)反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量縱軸

41、：熒光信號量ctct值的特點值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定； ct值則極具重現(xiàn)性95深層分析實時熒光定量實時熒光定量pcr pcr 原理原理 - - 標準曲線標準曲線q 模板dna量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即ct值越小q log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)樣品ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量96深層分析非特異性熒光標記：非特異性熒光標記： 1、 sybr green 特異性熒光標記：特異性熒光標記： 2、taqman 3、molecular beacon 實時熒光定量實時熒光定量pcr pcr 原理原理 - dna

42、- dna 產(chǎn)物的熒光標記產(chǎn)物的熒光標記97深層分析實時熒光定量實時熒光定量pcr pcr 方法方法 1 -1 -sybr green 法98深層分析sybr green 法 工作機理q sybr green 能結(jié)合到雙鏈dna的小溝部位q sybr green 只有和雙鏈dna結(jié)合后才發(fā)熒光q 變性時，dna雙鏈分開，無熒光q 復(fù)性和延伸時，形成雙鏈dna， sybr green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。sybr green 99深層分析100深層分析實時熒光定量實時熒光定量pcr pcr 方法方法 2 -2 -taqman探針法101深層分析實驗方法 real time pcr嚴格上

43、可以區(qū)分為dna起始的real time pcr和rna起始的real time rt-pcr。102深層分析103深層分析sybr green sybr green 法法 融解曲線分析融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準確非特異性產(chǎn)非特異性產(chǎn)物物104深層分析cycle numberflourescenc ck 102ck 104samplecycle numberlog of dna concentrationsybr green 法 定量原理q 模板dna量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少q log濃度與循環(huán)數(shù)呈

44、線性關(guān)系，根據(jù)樣品ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量105深層分析sybr green 法 -引物設(shè)計106深層分析sybr green 法 -pcr反應(yīng)的建立反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:1.sybr green 使用濃度:太高抑制taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測2.primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準3.mgcl2的濃度:可以降低到1.5mm,以減少非特異性產(chǎn)物4.反應(yīng)buffer 體系的優(yōu)化5.反應(yīng)溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定6.其他與常規(guī)pcr相同107深層分析sybr green 法 -pcr反應(yīng)性的確認108深層分析sybr green 法 -pcr條件優(yōu)化109深層分析sybr green sybr green 法法 優(yōu)缺點優(yōu)缺點 q 對dna模板沒有選擇性 -適用于任何dnaq 使用方便 -不必設(shè)計復(fù)雜探針q 非常靈敏q 便宜優(yōu) 點q 容易與非特異性雙鏈dna結(jié)合，產(chǎn)生假陽性 但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件q 對引物特異性要求較高缺 點11