水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系Protocol

1、水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系 ProtocolIntroduction1水稻的遺傳轉(zhuǎn)化研究歷史與現(xiàn)狀20 世紀(jì)80 年代末, 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化首獲成功。 1988 年, 3 個不同的研究 小組以水稻原生質(zhì)體為受體 ,采用“電擊法”或“ PEG 介導(dǎo)法”等方法將外源基 因?qū)氲剿局胁@得再生植株 13 。1991 年, 基因槍轉(zhuǎn)化的方法在水稻中獲 得成功 4, 隨后成為水稻遺傳轉(zhuǎn)化的常用方法之一。 1993 年， Chan 等人5 首先采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了轉(zhuǎn)基因水稻。 Hiei 等人6 以水稻成熟種子誘 導(dǎo)的愈傷為受體 , 建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻高效轉(zhuǎn)化體系 , 使得農(nóng)桿菌介導(dǎo)法逐 漸成為了水稻轉(zhuǎn)化最

2、常用的方法。 此后 , 粳稻的轉(zhuǎn)化方法被進(jìn)一步優(yōu)化 , 使粳稻 的遺傳轉(zhuǎn)化周期大幅縮短7。雖然Hiei等建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系使得 粳稻的轉(zhuǎn)化不再困難 , 但是許多秈稻的轉(zhuǎn)化依然存在障礙 , 主要是轉(zhuǎn)化效率低 下。因此 , 一些研究者對秈稻的轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了一些優(yōu)化 , 使得秈稻的轉(zhuǎn)化效率 得到了一定的提高8,9。最近，Hiei和Komari10發(fā)表了一個粳稻和秈稻均適 用的農(nóng)桿菌高效轉(zhuǎn)化的方法 .根據(jù)他們的結(jié)果 , 采用幼胚作為外植體 , 秈稻的轉(zhuǎn) 化可以在兩個半月內(nèi)完成， 且轉(zhuǎn)化效率非常高 （一個幼胚可以得到 513 個獨(dú)立的 轉(zhuǎn)化植株 ）。2. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水稻上的研究與應(yīng)用 11a.

3、 轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻對于水稻最主要的害蟲螟蟲 （二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等 ）在水稻中尚未發(fā)現(xiàn)有效的抗性種質(zhì)資源 . 目前,最有希望和前途的方法就是利用轉(zhuǎn)基因技 術(shù)把外源抗蟲基因引入水稻中創(chuàng)造出新的抗蟲品種。 雖然水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和鑒定 了 19 個抗褐飛虱的基因 12, 但是由于褐飛虱有多個生物型且易產(chǎn)生變異 , 抗 性品種往往推廣數(shù)年后就會失去抗性。b. 轉(zhuǎn)基因抗病水稻見抗水稻病毒研究c. 轉(zhuǎn)基因抗旱水稻d. 轉(zhuǎn)基因營養(yǎng)高效利用水稻e. 轉(zhuǎn)基因優(yōu)質(zhì)水稻f. 轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)水稻g. 轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻3. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水稻抗病毒基因工程上的應(yīng)用隨著 RNA 干擾技術(shù)（包括 siRNA 和 miRNA

4、 介導(dǎo)的 RNA 干擾）在抗病毒 基因工程上的廣泛研究和應(yīng)用 13 18 ，結(jié)合 RNA 干擾技術(shù)和水稻遺傳轉(zhuǎn)化技 術(shù)來研究水稻， 獲得對水稻病毒高抗的品系越來越受研究人員的重視， 成為國內(nèi) 外水稻病毒研究的熱點(diǎn)。 目前，國內(nèi)在這方面屬于起步階段， 僅僅做了一些構(gòu)建 干擾載體和獲得 RNA 干擾植株 19 27 ，但并沒有獲得高抗植株，國外，特別 是日本在這方面有著較大優(yōu)勢， Omura T 實(shí)驗(yàn)室分別在 2009 年和 2010 已獲 得了對RDV、RSV高抗植株28,29，另外Himani在2007年也獲得了對 RTBV 高抗的植株 30 。（重要是看以上文獻(xiàn)，一定要認(rèn)真體會）Materi

5、als and methods、接種步驟：1、保存在 -20 度的種子使用前取出（用多少取多少，用紙包好） ，置于 37 度恒 溫箱烘烤 10-20 小時左右（最好過夜） 。2、撥去種皮（ 1），盡量不要損害到種胚，撥皮后檢查，將胚乳表面發(fā)黑或胚死 亡的種子剔掉（ 2），用紙包好帶入組培操作間。3、（以下操作均在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行）將種子倒入干凈的100ml 三角瓶中，加入 75%乙醇消毒 2 分鐘，期間要不斷的搖動， 倒出酒精，再加入 20ml 2% 的 NaClO（3）, 覆蓋種子即可，室溫在搖床上 160rpm 搖 25min ，將 NaClO 倒掉，將種子用無菌鑷子轉(zhuǎn)移至高壓滅菌過的濾紙

6、上，在超凈工作臺上吹干 為止，然后將種子接入誘導(dǎo)培 養(yǎng)基（ NB 培 養(yǎng)基 ）（5 ）上，每皿 20 粒（ 4）， 注明日期，封口膜封口，置于 27 C恒溫箱中暗培養(yǎng)（15）;二、掐芽種子在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7 天后，長出可見的芽和遁片，根據(jù)種子的生長狀態(tài)，將芽掐掉（16）,繼續(xù)在27 °C恒溫箱中暗培養(yǎng)。三、繼代掐芽后 7 天左右，進(jìn)行第一次繼代， 用鑷子將新長出的愈傷夾成小塊 （17）， 轉(zhuǎn)入新的 NB 培養(yǎng)基中， 每皿 20 粒，在 27 度恒溫箱中暗培養(yǎng) 15 天后進(jìn)行第二 次繼代，培養(yǎng) 15 天后，就可以長出顏色鮮黃，表面光滑，直徑大小為 2-3mm 的胚性愈傷組織顆粒。 大小

7、合適的愈傷可以進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)， 小的就進(jìn)行第三次繼代。四、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)（整個操作過程需 8 天）第一天：選取自然分散，顏色鮮黃，直徑約為 2-3mm 的顆粒愈傷，置于 27 度暗培養(yǎng) 4 天。第三天：農(nóng)桿菌劃線 28 °培養(yǎng)，兩天后農(nóng)桿菌長滿即可洗脫（ 18 ），用于轉(zhuǎn) 化。第五天：懸浮農(nóng)桿菌，懸浮于添加有 100uM 乙酰丁香酮（ AS）（19）20ML 的 AMM 液體培養(yǎng)基 （20） 中，劇烈震蕩 1min 后，靜置 1h ，讓農(nóng)桿菌形成懸浮 液，取菌液于三角瓶中加入經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的愈傷，略微搖動靜置 30min ，于無菌紙 上晾干愈傷后置于添加有100uM的乙酰丁香酮

8、的NB培養(yǎng)基（AS培養(yǎng)基（21 ） 上 27 度暗培養(yǎng) 3 天。第八天：等農(nóng)桿菌生長至可見的愈傷下的菌斑， 但未長滿愈傷時， 挑取愈傷 于無菌培養(yǎng)瓶中，用無菌水沖洗，直至無可見菌絲為止，最后用含 300mg/l 的 羧芐無菌水靜置1h，置于無均濾紙上晾干后，轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上。五、抗性愈傷的繼代篩選當(dāng)抗性愈傷在朝霉素 30 培養(yǎng)基（ 22）上生長 15 天后（ 23），將愈傷換到 新的朝霉素 30 培養(yǎng)基上， 15 天后可觀察到一些褐化愈傷開始長出的新的愈傷， 繼續(xù)培養(yǎng)， 等新愈傷長出很多時轉(zhuǎn)移至朝霉素 50 培養(yǎng)基（ 24 ）上，篩選 3-7 天。六、分化從朝霉素 50 培養(yǎng)基中將繼續(xù)增生分

9、裂的抗性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基（ 25）上 再生，成團(tuán)而不是分散放置 （26） ，一周后愈傷開始轉(zhuǎn)綠， 三周后開始長出幼芽， 隨后根也長出，當(dāng)芽長至 2-3cm 時，就可移至 1/2MS 培養(yǎng)基（生根培養(yǎng)基） 上（ 27）。分化間進(jìn)行， 25°（28），光 14 小時，暗 10 小時。七、生根超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，每個培養(yǎng)瓶中只放一個抗性愈傷誘導(dǎo)出來的苗（ 29 ）， 在生根培養(yǎng)基上生長 10 天。（30）分化間進(jìn)行， 25 °，光14 小時，暗 10 小時。八、煉苗生根十天后開蓋，加已晾兩天或曬過的水，泡過培養(yǎng)基即可（ 28 ），2 天后28 ）用水洗掉生根培養(yǎng)基，加晾兩天或曬過

10、的水浸過根， 3-7 天后待生長狀態(tài) 好了后移栽大田。（期間每天要加水，確保根都泡在水中） 。分化間進(jìn)行， 25 °， 光 14 小時，暗 10 小時。九、移栽大田土、水提前曬上兩天， 移栽盆裝 4/5 體積的土，用水浸透即可， 不能太多水， 剛好浸過土面最好。移栽：在盆上標(biāo)記好，盆寬移栽兩株，長四株；移栽時不能插深，植株能站 住即可。10 天后可以施一點(diǎn)肥，不能太多。 20 天后可以每 10 天施肥一次，同樣不 能太多，太多會燒苗（如燒苗，施肥 3 天后可以觀察到，應(yīng)馬上將水換掉） 。要保證白天 29°（30 ），晚上 23°；光14 小時，暗 10 小時。（3

11、1）Notes（1）不用一粒一粒用手撥皮，在桌上墊一些白紙，用書壓。力道要掌握好，太用 力把種子壓碎了，用力不夠只能去個別的種皮，效率低。注意：接觸種子的紙必須是全白色的，不能有印刷有子的，否則用力壓時，墨就 著黑色上種子。(2) 不正常的種子，一律丟棄。因?yàn)楹笃谌羰且涣７N子長菌的話就污染了整盤。(3) a. 20ml 2% 的 NaClO 的配制：實(shí)驗(yàn)室買的是有效濃9%的NaCIO ,所以取4.5ml 9%的NaCIO力卩16ml 蒸餾水即配成 2% 的 NaClOb. 2%的 NaClO 現(xiàn)用現(xiàn)配，因?yàn)?NaClO 見光分解，所以配了就要趕緊用。(4) 20 粒共三圈，外圈 12 粒，中圈

12、 7 粒，里一粒。(5) NB 培養(yǎng)基的配置( 800ml )： 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：所有玻璃儀器必須洗凈再用雙蒸水潤洗 步驟：取一升二角瓶 f 加24g蔗糖依次加入80ml N 6max（ 10 X）16 ml鐵鹽 （50 X）8 ml 肌醇 （100X）（8）4 ml B 5miin （ 200 X）（9）加多點(diǎn)(勿超 500 )三蒸水搖使其溶解，倒入 1 升量筒中，再加三蒸水定容至780mlJ此時PH應(yīng)為4.2-4.3PH 調(diào)至 5.8(用 pH 計， KOH 調(diào))加 2.1g 植物凝膠(10)高壓滅菌( 121 °20min )J滅完前30min，拿出16ml有機(jī)，化為液態(tài)加 1.6m

13、l2.4-D (1mg ml )(11)至 16ml 有機(jī)(12)中待培養(yǎng)基稍燙手抽濾( 13)，倒培養(yǎng)基 (14) N6max ( 10 X)的配制(配1L)： KNO 328.3 g4.0 g4.63 g1.85 g1.66 g 或 Cacl21.25 g KH2PO4( NH4)2SO4 MgSO 47H2O Cacl2 2H2O注：a 一起溶解混勻成A,b 單獨(dú)溶解，再與A交替混勻，以免長期存放產(chǎn)生沉淀;c. 4C冰箱保存；(7)鐵鹽(50 X)的配制(配500mL ): FeSO4 7H2O0.695g g NA2EDTA 2H2O0.9325 g注：a.分別溶解，再交替混勻，邊加邊

14、搖勻；b 棕色瓶裝；c. 4C冰箱保存；(8)肌醇(100 X)的配制(配1L):10 g肌醇(InositoI )用雙蒸水定容至1L； 4C冰箱保存;(9) B5miin (200 X)的配制(配 500mL )： MnSO4.H 2O0.758 g H3BO30.3 g ZnS04 7H2O0.2 g CuSO4 5H2O0.0025 g CoCI2 6H2O0.0025 g KI0.075 g NaMoO4 2H 2O0.025 g注：a. 一起溶解，二蒸水疋容至500mL ；b 棕色瓶裝；c. 4 C冰箱保存；(10) 非瓊脂粉。(11) 2,4-D( 1mg/mI )配 1100mI

15、 )：加1ml無水乙醇用槍吸吹，可溶解。再用純水定容至100ml ；4 C冰箱保存；（12）有機(jī)（50 X）的配制（配1L）: 鹽酸硫胺素（ VB1 ）0.5 g 鹽酸吡哆醇（ VB6）0.05 g 尼克酸 （煙酸）0.05 g 水解酪蛋白15 g 谷氨酰胺12.5 g 脯氨酸25 g 甘氨酸0.1 g注：a.以上藥品均要求Sigma的，一起溶解，三蒸水定容至1L；b 再分裝，每個16mL ；c.用濾紙、漏斗過濾分裝；d . -20 °冰箱保存；e .用時提前拿出來；（ 13 ）抽濾：在超凈臺中把有機(jī)倒入一培養(yǎng)皿中，抽濾（先要試下過濾膜有沒 有裝好：注射器抽一些有機(jī)并抽入些空氣， 打

16、出有機(jī)，若彈起，才可以進(jìn)行抽濾。 所以通常過濾的應(yīng)多準(zhǔn)備幾個； 若使用一次性過濾器則直接抽濾即可； 過濾膜為 0.2um ） ,搖蕩三角瓶（混勻），酒精燈燒瓶口再倒培養(yǎng)基。（14） 倒培養(yǎng)基：a.六皿培養(yǎng)皿一摞，從下至上倒培養(yǎng)基b 每皿倒一半稍多厚（水稻組培要厚點(diǎn)） ,800ml 倒 22 皿左右C.快停時右手使三角瓶前傾點(diǎn)（可防倒到皿壁上）d 移動培養(yǎng)皿摞時小心，慢點(diǎn)。倒培養(yǎng)基后處理：a.升三角瓶、有機(jī)瓶子：即刻沖洗。b .過濾器：過濾膜扔掉，沖洗過濾器（特別是過濾孔），打開晾干；若是一次性過濾器則不必；c.注射器：抽開晾干。注：每次要用培養(yǎng)基提前 2 天倒好（保證無菌）；（15） 要做到每

17、天觀察，一但發(fā)現(xiàn)有污染的要及時處理：長真菌的話整盤丟棄， 但長細(xì)菌的可以將未污染的轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上。16 ）左手鑷子輕夾愈傷，右手鑷子掐芽，為掐而非拔。17 ）發(fā)黑的愈傷不要，黏糊的不要，要的是偏硬的愈傷。18 ）經(jīng)驗(yàn)：一般晚上劃線，第三天上午做侵染。 （例： 1.1 晚上劃線， 1.3 號上 午做侵染，所以 1 號、 2 號用來做實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，高壓濾紙培養(yǎng)皿， 100ml 三角瓶、 槍頭等。）（19）AS 的配制：9.81mgAS 用 ImIDMSO 溶解即可；一般稱 98.1mg,用 lOmIDMSO 溶解, 用 1.5ml 離心管分裝，每管裝 1ml ； -20 °保存；（20）

18、AMM 液體培養(yǎng)基的配制（21）AS 培 養(yǎng)基 （共培養(yǎng)培養(yǎng)基）的配制（ 8OOmI ）：780ml NB +16ml有機(jī)+1.6ml 2 mg L-1 2,4-D +800ulAS(22) 篩選培養(yǎng)基 I (Hyg30 )的配制( 800ml )：780mlNB+16ml 有機(jī) +1.6ml2 mg L-1 2,4-D +2ml 100mg/mlCb+480ul50mg/ml Hyg注：a100mg/mlCb 母液配制： 1gCB 用 10ml 雙蒸水溶解(應(yīng)為略黃色、澄清、有刺激性味液體)，4 C保存b50mg/ml Hyg ：默克牌的買來就應(yīng)該是這個濃度，即 1g/20mlc. Hyg3

19、0 :是指潮霉素濃度為 30mg/ml (即：480ul X1g/20mg -800ul )。d .有機(jī)、2,4-D、Cb、Hyg混勻，抽濾。(23) 可以看到愈傷一天一天開始慢慢褐化，就像死了一樣；(24) 篩選培養(yǎng)基 II(Hyg50 )的配制( 800ml )：780mlNB+16ml 有機(jī) +1.6ml2 mg L-1 2,4-D +2ml 100mg/mlCb+900ul50mg/ml Hyg方法同上(略)(25) 分化培養(yǎng)基的配制( 800ml )：780ml NB +16ml 有機(jī)+320ul(1mg/ml)NAA +8mgKT ; pH 5.8-5.9。說明：a. 1mg/ml

20、NAA 母液的配制：配 50ml稱50mgNAA 加1MKOH直至溶解(一般加1ml就可以溶解)，再加雙蒸水定容至50ml。不用高壓，4 °C保存。b .分開抽濾：16ml有機(jī)和320ul(1mg/ml)NAA混勻一起抽濾;8mgKT 用 1ml 1MKOH 溶解,再加 9 ml 雙蒸水，混勻，抽濾；(因?yàn)?KT 和有機(jī)、 NAA 會形成結(jié)晶，所以要分開抽濾) 。 注： 8mgKT 務(wù)必要稱精確，用新的電子天平，勿用一樓的電子天平?；蛘叻Q 24mgKT ，加 3ml 1MKOH 溶解,再加 27 ml 雙蒸水混勻，抽濾 10ml 即可。 c800ml 倒 18 個 100ml 三角瓶

21、(每瓶約 45ml )。(26) 經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)團(tuán)放比分散放置出苗率高。(27) 生根培養(yǎng)基： 1/2MS 培養(yǎng)基； pH 5.8-5.9 。(28) 25 °要恒溫，不能一會 28 °一會25 °，那樣分化瓶壁上會出現(xiàn)很多水，影響 苗的生長。(29) 生根培養(yǎng)基的配制(30) 操作很重要，嚴(yán)格執(zhí)行，一大意就很容易污染。操作時務(wù)必用長鑷子，不 能用手弄，用涂過酒精的手弄后期絕大部分會長真菌。(31) 這 10 天要常觀察，一發(fā)現(xiàn)有污染的情況，即刻轉(zhuǎn)移；一般 2 天后就可發(fā)現(xiàn)根往瓶底部長， 4 天后發(fā)現(xiàn)苗明顯轉(zhuǎn)綠，莖變粗壯；7 天后發(fā)現(xiàn)有明顯側(cè)須根長出；根很多；(32)

22、一定要浸過培養(yǎng)基，沒的話容易長菌；(33) 若長菌則換水。(34) 水稻高溫下長勢很好(大于 28 °)(35) 注意防蟲，必要時 15-30 天打一次農(nóng)藥。被帶毒的蟲子吃了的話，一但傳 上毒，實(shí)驗(yàn)就前功盡棄！所以，在防蟲方面，務(wù)必認(rèn)真對待。附錄轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)基的配方1. NB培養(yǎng)基配方（基本培養(yǎng)基）N6大量工作濃度（mg/l ）母液：10 x, 1L (g)KNO3283028.3(NH 4)2SO44634.63KH2PO44004MgSO 4 7H 2O1851.85CaCb 2H2O166166B5微量工作濃度(mg/l )母液：100 x, 1L (g)H3B0430.3MnS

23、O 4 H2O7.580.758Zn SO47H2O20.2KI0.750.075Na2MoO 4 2H2O0.250.025CuSO4 5H2O0.0250.025C0CI2 6H2O00250.0025鐵鹽工作濃度（mg/l）母液：100 x1L(g)jy< ittIaFeSO4 7H2ON/EDTA27.837 32.783 73肌醇工作濃度（mg/l ）母液：100 x1L(g)丿J丿U|-|J肌醇 Myo-inositol100101 1i y丿)4j u ii j iviyo iiiodiloi有機(jī)成分1 JJ工作濃度(mg/l )1母液:：50 X,4L-鹽酸硫 鹽 酸 吡

24、 尼克酸Niacin 水解酪蛋白Casam ino谷氨酰胺Glutam 脯氨酸 Proline ine 甘氨酸Glycine 蔗糖 Sucrose 瓊脂 PhytagelPH 5.8-5.91011300250500丄30g/l2.4g/l0.500.050.0515.012.525.00402. AAM培養(yǎng)基配方大量兀素KH2PO4.2H2O MgSO4.7H2O KCLCaCL2微量兀素Mn SO4.4H2ONaMoO4.2H2OH3BO4Zn SO4.7H2OKICuSO4.5H20Cocl2.6H2O鐵鹽- FeSO4.7H2O Na2EDTA有機(jī)成份 甘氨酸工作濃度(mg/l )17

25、03702940440工作濃度(mg/l )100.25320.750.03870.025工作濃度(mg/l )27.837.3工作濃度(mg/l )75母液：10 X, 1L (g)1.73.729.444母液：100 X, 1L (g)10.0250.30.20.0750.003870.0025母液：100 X, 1L (g)2.783.73母液：100 X, 1L (g)075鐵鹽工作濃度（mg/l ）母液：100 x 1L (g)TA FTTLFeSO4.7H2ONa2EDTA27.837 31入1 w 丿、，II vy/3.732 78有機(jī)成分工作濃度（mg/l ）母液：50 X,

26、1L (g )CuSO4.5H200.00250.0025肌醇1005精氨酸174谷氨酰胺876肌醇100尼克酸0.5鹽酸硫胺素（VB1 ）0.5鹽酸吡哆醇（VB6）0.5水解酪蛋白50017.487.6100.050.050.05-50-乙酰丁香酮（AS） 葡萄糖蔗糖19.6268,50030,000PH5.23. MS培養(yǎng)基配方大量兀工作濃度（mg/l ）母液：10 x, 1L (g )硝酸鉀KNO3190019NH4NO3165016.5KH2PO41701.7MgSO4.7H2O3703.7CaCL2.2H2O44044KIH3BO3微量兀素工作濃度（mg/l ）0.830.62Mn

27、SO4.4H2O2.23Zn SO4.7H2O0.86NaMoO4.2H2O0.025母液：1000 X, 1L (g)0.0830.622.230.860.0250.1甘氨酸鹽酸硫胺素（VB1 ）01鹽酸吡哆醇（VB6）尼克酸0.50 50.0250 025蔗糖20000瓊脂9-9 5PH58羧卞青霉素（cb）250mg/l100mg/ml潮霉素（hyg ）30-50mg/l50mg/ml利福平（rif）50mg/l20mg/ml卡鈉霉素（kana）50mg/l50mg/ml四環(huán)素（tet）4mg/l10mg/ml氨卞青霉素50mg/l50mg/mlNAA奈乙酸400ug/l1mg/mlRe

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