土壤中分解尿素的細菌分離和計數(shù)PPT課件

1、細菌脲酶細菌脲酶尿素尿素CO(NHCO(NH2 2) )2 2重要的農(nóng)業(yè)氮肥。重要的農(nóng)業(yè)氮肥。只能被土壤中細菌分解為只能被土壤中細菌分解為NHNH3 3才能被植物吸才能被植物吸收利用收利用 CO(NHCO(NH2 2) )2 2 + H + H2 2O COO CO2 2 +2NH+2NH3 3課題背景課題背景第1頁/共25頁課題目的課題目的土壤中尿素分解菌的分離與計數(shù)從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌統(tǒng)計每克土樣中究竟含有多少這樣的細菌第2頁/共25頁思考：思考：PCRPCR技術(shù)要求使用耐高溫的技術(shù)要求使用耐高溫的DNADNA聚合酶，聚合酶，這種酶要能忍受這種酶要能忍受93 93 左右的高溫。

2、如果請你來尋左右的高溫。如果請你來尋找這種耐高溫的酶，你會去哪里尋找？找這種耐高溫的酶，你會去哪里尋找？( () )A A土壤中土壤中 B B海水中海水中C C熱泉中熱泉中 D D冷庫中冷庫中C C如何尋找如何尋找耐高溫耐高溫的酶？的酶？ 尋找尋找高溫高溫環(huán)境；環(huán)境；原理：熱泉原理：熱泉70-8070-80的的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)高溫條件淘汰了絕大多數(shù)的微生物，使得耐熱的的微生物，使得耐熱的TaqTaq細菌脫穎而出。選出細菌脫穎而出。選出耐高溫細菌后，從耐高溫菌種中提取耐高溫酶。耐高溫細菌后，從耐高溫菌種中提取耐高溫酶。第3頁/共25頁1 1、自然界中目的菌株的刷選原理：、自然界中目的菌株的

3、刷選原理：一、篩選菌株一、篩選菌株2 2、實驗室中篩選微生物的原理：、實驗室中篩選微生物的原理：（純且活的菌種純且活的菌種）在尋找目的菌株時，要根據(jù)它對在尋找目的菌株時，要根據(jù)它對生存環(huán)境生存環(huán)境的要求，的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去找。到相應(yīng)的環(huán)境中去找。人為提供人為提供有利于目的菌株生長的條件有利于目的菌株生長的條件( (包括營養(yǎng)、包括營養(yǎng)、溫度、溫度、pHpH等等) )，同時，同時抑制或阻止抑制或阻止其他微生物生長。其他微生物生長。第4頁/共25頁 KH KH2 2POPO4 4 1.4g 1.4g NaHPO NaHPO4 4 2.1g 2.1g MgSO MgSO4 4 H H2 2O 0

4、.2gO 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g10.0g 尿素尿素 1.0g1.0g 瓊脂瓊脂 15.0g15.0g 將上述物質(zhì)溶解后，將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到用蒸餾水定容到1000mL1000mL。 該培養(yǎng)基的配方中，為微該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？分別是什么物質(zhì)？ 此配方能否篩選出分解尿此配方能否篩選出分解尿素的細菌？為什么？素的細菌？為什么？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素氮源：氮源：尿素尿素能。只有產(chǎn)生脲酶的細菌能。只有產(chǎn)生脲酶的細菌能利用尿素作為氮源而生能利用尿素作為氮源而生存。存。第5頁/共25頁3 3、方法：

5、、方法： 利用選擇培養(yǎng)基分離利用選擇培養(yǎng)基分離選擇培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基：允許允許特定種類特定種類的微生物生長，同時的微生物生長，同時抑制或阻止抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。(1)(1)在培養(yǎng)基中在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)加入某種化學(xué)物質(zhì)。利用選擇培養(yǎng)基分離微生物的方法：利用選擇培養(yǎng)基分離微生物的方法：例如，加入例如，加入青霉素青霉素可以分離出可以分離出 ； 加入加入高濃度的食鹽高濃度的食鹽可以得到可以得到 。 酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌這里的加入是在培養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上加入這里的加入是在培養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上加入。第6頁/共25頁(2)(2)改

6、變改變培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分營養(yǎng)成分。例如，缺乏例如，缺乏氮源氮源時可以分離時可以分離 ； 尿素尿素作為作為唯一氮源唯一氮源時，可以分離出時，可以分離出 石油石油作為作為唯一碳源唯一碳源時，可以分離出時，可以分離出 固氮微生物固氮微生物能消除石油污染的微生物能消除石油污染的微生物能分解尿素的細菌能分解尿素的細菌(3)(3)改變改變微生物的微生物的培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件。例如，將培養(yǎng)基放在例如，將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境高溫環(huán)境中培養(yǎng)可以得到中培養(yǎng)可以得到耐高溫的微生物耐高溫的微生物第7頁/共25頁本課題使用的培養(yǎng)基的配方如下：本課題使用的培養(yǎng)基的配方如下：成分成分KH2PO4Na2HPO4MgSO4

7、 7H2O葡萄糖葡萄糖 尿素尿素瓊脂瓊脂水水含量含量1.4 g2.1 g0.2 g10.0 g1.0 g 15.0 g 1000 mL請分析后回答：請分析后回答： (1)(1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是氮源的分別是_和和_。 (2)(2)該培養(yǎng)基為該培養(yǎng)基為_培養(yǎng)基培養(yǎng)基( (按物理狀態(tài)分按物理狀態(tài)分) )，理由是理由是_。 (3)(3)想一想這種培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如想一想這種培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，又是如何進行選擇的？果具有，又是如何進行選擇的？_ _ _。葡萄糖葡萄糖尿素尿素固體固體有

8、凝固劑瓊脂有凝固劑瓊脂有選擇作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能有選擇作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長夠利用尿素的微生物才能夠生長第8頁/共25頁二、二、統(tǒng)計菌落數(shù)目統(tǒng)計菌落數(shù)目1 1、方法：、方法：常用稀釋涂布平板法統(tǒng)計活菌的數(shù)目常用稀釋涂布平板法統(tǒng)計活菌的數(shù)目原理：原理：當樣品的當樣品的 時，培養(yǎng)基表面生長時，培養(yǎng)基表面生長的的一個菌落一個菌落來源于樣品稀釋液中的來源于樣品稀釋液中的 。為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在 統(tǒng)計統(tǒng)計通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含

9、有多少的活菌。中大約含有多少的活菌。要求：要求：3030 300 300 個菌落的平板個菌落的平板稀釋度足夠高稀釋度足夠高一個活菌一個活菌第9頁/共25頁 例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤例：兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為樣品中的細菌數(shù)。從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為10106 6的培養(yǎng)基中，的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。 1 1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)為落數(shù)為230230。 2 2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A A、B B、C C三個平板，三個平板，統(tǒng)

10、計的菌落數(shù)分別為統(tǒng)計的菌落數(shù)分別為2121、212212、256256，該同學(xué)以這三個，該同學(xué)以這三個平板上菌落數(shù)的平均值平板上菌落數(shù)的平均值163163作為統(tǒng)計結(jié)果。作為統(tǒng)計結(jié)果。 你認為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，你認為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯在哪？錯在哪？ 甲：沒有甲：沒有重復(fù)實驗重復(fù)實驗（至少涂布（至少涂布3 3個平板）個平板） 乙：乙：A A組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值組結(jié)果誤差過大，不應(yīng)用于計算平均值第10頁/共25頁 用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為的細菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為10106 6的

11、培養(yǎng)基中，得的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，正確的是到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，正確的是( () )A A涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是230230B B涂布了兩個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是涂布了兩個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是215215和和260260，取平均值，取平均值238238C C涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是2121、212212和和256256，取平均值，取平均值163163D D涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是210210、240240和和250250，取平均值，取平均值233233第11頁/

12、共25頁因為因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。觀察到的只是一個菌落。因此統(tǒng)計結(jié)果一般用因此統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)菌落數(shù)表示。表示。= =（平均菌落數(shù)（平均菌落數(shù)涂布的稀釋液體積）涂布的稀釋液體積）稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 。缺點：缺點：操作復(fù)雜，實驗結(jié)果有一定的誤差。操作復(fù)雜，實驗結(jié)果有一定的誤差。 統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低 每克樣品中的菌株數(shù)每克樣品中的菌株數(shù)= =（C/V)X MC/V)X MC:C:某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V:V:所用稀釋液的體積；

13、所用稀釋液的體積；M:M:稀釋倍數(shù)。稀釋倍數(shù)。計算計算公式：公式：第12頁/共25頁顯微鏡直接計數(shù)顯微鏡直接計數(shù) 優(yōu)點：優(yōu)點：缺點：缺點：計數(shù)方便，操作簡單計數(shù)方便，操作簡單死菌、活菌都計算在內(nèi)，死菌、活菌都計算在內(nèi)，統(tǒng)計結(jié)果比實際值偏大統(tǒng)計結(jié)果比實際值偏大（統(tǒng)計菌株數(shù)目）（統(tǒng)計菌株數(shù)目）第13頁/共25頁1 、產(chǎn)生標準形態(tài)菌落的細菌的最初數(shù)目和培養(yǎng)基分別是（ ）A 一個細菌、液體培養(yǎng)基 B 許多細菌、液體培養(yǎng)基C 一個細菌、固體培養(yǎng)基 D 許多細菌、固體培養(yǎng)基2、某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106 的培養(yǎng)基上測得平板上的菌落數(shù)的平均值為215，那么每毫升樣品中菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.

14、1ml）A 2.15108 B 2.15109 C 215 D 21.5 3、下列有關(guān)檢測土壤中細菌總數(shù)實驗操作的敘述中，不正確的是（ ）A 用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨，高溫、高壓滅菌后道平板B 取104、105、106 倍土壤稀釋液和無菌水各0.1ml涂布不同平板C 將實驗組和對照組平板倒置，37恒溫培養(yǎng)24h-48hD 確定對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的平板進行計數(shù)。CBD第14頁/共25頁 利用選擇培養(yǎng)基進行尿素分解菌的分離過程中，利用選擇培養(yǎng)基進行尿素分解菌的分離過程中，從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為從對應(yīng)稀釋倍數(shù)為10106 6的培養(yǎng)基中，的培養(yǎng)基中，A A、B B兩同學(xué)分別兩同學(xué)分別得到以

15、下兩種統(tǒng)計結(jié)果。得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果。 1 1、A A同學(xué)篩選出同學(xué)篩選出150150個菌落。個菌落。 2 2、B B同學(xué)篩選出同學(xué)篩選出5050個菌落。個菌落。 B B認為認為A A的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或培養(yǎng)基中混入的培養(yǎng)基被雜菌污染了，或培養(yǎng)基中混入了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿素的細菌也能了其他含氮物質(zhì)，因而導(dǎo)致不能分解尿素的細菌也能在該培養(yǎng)基中生長。在該培養(yǎng)基中生長。A A確認自己的操作無誤，但也拿確認自己的操作無誤，但也拿不出能令人信服的證據(jù)。不出能令人信服的證據(jù)。 請你幫助請你幫助A A同學(xué)改進實驗，提供具有說明了的證同學(xué)改進實驗，提供具有說明了的證據(jù)。據(jù)。方案方案1 1：其

16、他同學(xué)用：其他同學(xué)用A A同學(xué)的土樣進行實驗。同學(xué)的土樣進行實驗。 方案方案2 2：A A同學(xué)以不接種的培養(yǎng)基作為空白對照同學(xué)以不接種的培養(yǎng)基作為空白對照。第15頁/共25頁2 2、增加實驗說服力的措施、增加實驗說服力的措施：排除實驗組中排除實驗組中非測試因素非測試因素對實驗結(jié)果對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。設(shè)置重復(fù)：設(shè)置重復(fù)：排除排除偶然因素偶然因素對實驗結(jié)果的影響。對實驗結(jié)果的影響。在培養(yǎng)過程中在培養(yǎng)過程中同一稀釋度下同一稀釋度下應(yīng)應(yīng)涂布涂布至少至少3個平板個平板，才能增強說服力和準確性，才能增強說服力和準確性設(shè)置對照：設(shè)置對照：若對照的培養(yǎng)皿中無菌

17、落生長，說明：若對照的培養(yǎng)皿中無菌落生長，說明：方法：方法：方法：方法：觀察培養(yǎng)物中是否有雜菌污染觀察培養(yǎng)物中是否有雜菌污染如如空白對照組空白對照組培養(yǎng)基未被雜菌感染培養(yǎng)基未被雜菌感染培養(yǎng)基混入其他雜菌培養(yǎng)基混入其他雜菌若實驗的培養(yǎng)基菌落數(shù)偏高或者菌落形態(tài)多樣，說明：若實驗的培養(yǎng)基菌落數(shù)偏高或者菌落形態(tài)多樣，說明：第16頁/共25頁若牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)大于選擇培養(yǎng)基若牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，說明：上的數(shù)目，說明：觀察選擇培養(yǎng)物是否具有觀察選擇培養(yǎng)物是否具有選擇作用選擇作用如如完全培養(yǎng)基對照組完全培養(yǎng)基對照組選擇培養(yǎng)基具有篩選作用選擇培養(yǎng)基具有篩選作用第17

18、頁/共25頁距地表約距地表約3 3 8cm8cm土壤層土壤層菌落計數(shù)菌落計數(shù)配制土壤溶配制土壤溶液液系列稀釋系列稀釋涂布平板與涂布平板與培養(yǎng)培養(yǎng)三、實驗設(shè)計三、實驗設(shè)計1 1、實驗流程：、實驗流程：2 2、操作流程：、操作流程：（1 1）土壤取樣）土壤取樣 取樣原因：取樣原因：土壤要求：土壤要求：取樣部位：取樣部位：土壤土壤“微生物的天然培養(yǎng)基微生物的天然培養(yǎng)基”，含有大量，含有大量的微生物，數(shù)量最大，種類最多。的微生物，數(shù)量最大，種類最多。富含富含有機質(zhì)有機質(zhì)，pHpH接近接近中性中性且且潮濕潮濕。第18頁/共25頁測細菌數(shù)：測細菌數(shù)：測放線菌：測放線菌：測真菌數(shù)：測真菌數(shù)：（2 2）樣品稀

19、釋）樣品稀釋 稀釋原因：稀釋原因：稀釋標準：稀釋標準：稀釋倍數(shù)：稀釋倍數(shù)：樣品的稀釋程度樣品的稀釋程度直接影響平板上生長直接影響平板上生長的菌落數(shù)目的菌落數(shù)目選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，保證獲得保證獲得菌落數(shù)在菌落數(shù)在30-30030-300之間之間，便于計數(shù)。，便于計數(shù)。一般用一般用10104 4、10105 5、10106 6稀釋液稀釋液一般用一般用10103 3、10104 4、10105 5稀釋液稀釋液一般用一般用10102 2、10103 3、10104 4稀釋液稀釋液思考：為什么分離不同的微生物要用不同的稀釋度？思考：為什么分離不同的微生物要

20、用不同的稀釋度？土壤中各類微生物的數(shù)量不同土壤中各類微生物的數(shù)量不同如果是第一次做這個實驗，稀釋倍數(shù)的范圍如果是第一次做這個實驗，稀釋倍數(shù)的范圍可以放寬可以放寬103-107.第19頁/共25頁1 、關(guān)于土壤取樣的敘述，錯誤的是（ ）A 土壤取樣，應(yīng)選取肥沃、濕潤的土壤 B 先鏟去表層土3-8cm左右，再取樣C 取樣用的小鐵鏟和信封在使用前不用滅菌D 應(yīng)在火焰旁稱取土壤2、下列關(guān)于“土壤中分解尿素的細菌的分離”實驗步驟排列正確的是土壤取樣稱取10g土壤加入盛有90ml無菌水的錐形瓶中吸取0.1ml進行平板涂布依次稀釋至101、102、103、104、105、106、107 稀釋度A B C D CC第20頁/共25頁（三）微生物的培養(yǎng)與觀察（三）微生物的培養(yǎng)與觀察 1 1、接種：用適當?shù)南♂屢和坎计桨?、接種：用適當?shù)南♂屢和坎计桨?2 2、培養(yǎng)：細菌：、培養(yǎng)：細菌：3030 3737，1 1 2d;2d; 放線菌放線菌:25:25 28, 528, 5 7d;7d; 霉菌霉菌: 25: 25 28,