生物樣本分析

1、生物樣本分析生物樣本分析島津自動前處理系統(tǒng)島津自動前處理系統(tǒng)（co-sense for ba lcms co-sense for ba lcms ）藥代動力學(xué)研究的內(nèi)容藥代動力學(xué)應(yīng)用動力學(xué)原理研究藥物吸收、分布、代謝和排泄過程。 藥物劑量與藥理效應(yīng)的相互關(guān)系研究 人體生理及病理狀態(tài)對藥物體內(nèi)過程的影響 藥物制劑的生物利用度測定 藥物相互作用評價生物樣品包括各種體液和組織血漿中微量藥物或代謝產(chǎn)物的測定藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點世界藥物索引1999收載藥物總數(shù)：51596可離子化藥物：62.9%，其中 酸性化合物14.5% 堿性化合物67.5% 兩性化合物18.0%分子量一般 500 離子化 質(zhì)譜分析血漿

2、樣品的特點基質(zhì)復(fù)雜 選擇性強待測物含量低 靈敏度高濃度差異大 線性范圍寬生物樣品中的藥物分析前處理的要點生物樣品中的藥物分析前處理的要點除蛋白質(zhì)，分離純化濃縮液液萃取法 固相萃取法 規(guī)?？s小的柱色譜法直接沉淀法 超濾法血漿樣品加入提取溶媒（酸化或堿化）血漿樣品加入提取溶媒（酸化或堿化）渦旋離心取上清液吹氮氣濃縮渦旋離心取上清液吹氮氣濃縮殘渣溶解過濾進樣殘渣溶解過濾進樣色譜分析色譜分析樣本前處理一般步驟樣本前處理一般步驟藥代動力學(xué)研究面臨的挑戰(zhàn)高效液相色譜法（hplc）的特點和局限：靈敏度：定量限一般為 10100 ng/ml，選擇性差測試速度：每個樣品 1520 min，低通量對結(jié)構(gòu)分析提供的

3、信息很少需求：靈敏度： ng/ml 濃度，高選擇性制劑生物等效性實驗：5001000 樣品新藥研究：分析超過 10000 個生物樣品液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的發(fā)展1977年，lc/ms開始投放市場1978年，lc/ms首次用于生物樣品分析1991年，api lc/ms用于藥物開發(fā)hplchplc85%85%gc/msgc/ms12%12%lc/mslc/ms3%3%hplchplc85%85%gc/msgc/ms12%12%lc/mslc/ms3%3%hplchplc15%15%gc/msgc/ms5%5%lc/mslc/ms80%80%hplchplc15%15%gc/msgc/ms5%5%lc

4、/mslc/ms80%80%數(shù)據(jù)來源：american society for mass spectrometry, 2002藥物色譜分析中不同方法的比例1990年2000年lc/ms lc/ms 法測定人血漿中克拉霉素的濃度法測定人血漿中克拉霉素的濃度 克拉霉素克拉霉素(clarithromycin) (clarithromycin) 紅霉素衍生物紅霉素衍生物新一代對酸穩(wěn)定的口服大環(huán)內(nèi)酯類抗生素新一代對酸穩(wěn)定的口服大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 以往克拉霉素血藥濃度測定以往克拉霉素血藥濃度測定多采用微生物法多采用微生物法hplchplc紫外檢測紫外檢測 ch3ch3oooch3h3ch0h3coch3ch

5、3h3coooch3ch3och3h0o ch3h0nch3ch3oh克拉霉素檢測條件檢測條件 流動相流動相: 0.05%: 0.05%冰醋酸和乙腈（冰醋酸和乙腈（4060 v/v4060 v/v） 流速流速: 0.2ml/min: 0.2ml/min 色譜柱色譜柱: shim-pack ods 150mm: shim-pack ods 150mm2.0 mm i.d. 52.0 mm i.d. 5mm 柱溫柱溫: 40: 40 質(zhì)譜離子化方式：電噴霧離子化（質(zhì)譜離子化方式：電噴霧離子化（esiesi） 離子極性離子極性:positive:positive； 選擇性離子檢測選擇性離子檢測(si

6、m): (sim): 克拉霉素克拉霉素m/z: 748.5m+h+m/z: 748.5m+h+ 羅紅霉素羅紅霉素m/z: 837.5 m+h+ m/z: 837.5 m+h+ 內(nèi)標物內(nèi)標物 14-14-羥基克拉霉素羥基克拉霉素m/z: 764.5m+h+m/z: 764.5m+h+血漿樣品的處理血漿樣品的處理 血漿樣品血漿樣品, , 內(nèi)標羅紅霉素內(nèi)標羅紅霉素, , 碳酸鈉溶液堿化后乙碳酸鈉溶液堿化后乙醚提取醚提取, , 上清液用氮氣吹干。最后殘渣乙腈溶解。上清液用氮氣吹干。最后殘渣乙腈溶解。方法的專屬性方法的專屬性克拉霉素、內(nèi)標、克拉霉素、內(nèi)標、14-14-羥基克拉霉素的保留時間分別羥基克拉霉

7、素的保留時間分別為為1.93min1.93min、1.93min1.93min、1.92min1.92min島津自動前處理系統(tǒng)島津自動前處理系統(tǒng)（co-sense for ba lcms ） 內(nèi)容 自動前處理的優(yōu)點與問題自動前處理的優(yōu)點與問題 自動前處理系統(tǒng)自動前處理系統(tǒng)co-sense for ba的特長的特長 采用新型色譜柱和稀釋系統(tǒng)實現(xiàn)了高回收率 使用新型色譜柱的自動濃縮系統(tǒng)實現(xiàn)了高靈敏度使用新型色譜柱的自動濃縮系統(tǒng)實現(xiàn)了高靈敏度 co-sense for ba + lcms系統(tǒng)的特長系統(tǒng)的特長背景背景p樣品前處理是目前分析化學(xué)的瓶頸，是分析化學(xué)研究的難點和樣品前處理是目前分析化學(xué)的瓶頸

8、，是分析化學(xué)研究的難點和熱點問題之一。由于樣品數(shù)量極多，且分析物含量越來越低、熱點問題之一。由于樣品數(shù)量極多，且分析物含量越來越低、基體越來越復(fù)雜，迫切要求發(fā)展高通量、高選擇性、高效率的基體越來越復(fù)雜，迫切要求發(fā)展高通量、高選擇性、高效率的在線樣品前處理技術(shù)。因此，開展這方面的研究具有極為重要在線樣品前處理技術(shù)。因此，開展這方面的研究具有極為重要的意義。的意義。 hplc/lc-mshplc/lc-ms廣泛應(yīng)用于血漿或血清的代謝物分析和原廣泛應(yīng)用于血漿或血清的代謝物分析和原藥分析，一般的血漿和血清分析，需要對樣本進行預(yù)藥分析，一般的血漿和血清分析，需要對樣本進行預(yù)處理，以除去蛋白質(zhì)，這樣會降低

9、精確度和工作效率。處理，以除去蛋白質(zhì)，這樣會降低精確度和工作效率。引入了具有限制性通路媒介（引入了具有限制性通路媒介（restricted access restricted access media -rammedia -ram）的預(yù)柱，可對血漿樣本進行直接分析，）的預(yù)柱，可對血漿樣本進行直接分析，而不必進行預(yù)處理。這樣，可提高精確度、簡化操作而不必進行預(yù)處理。這樣，可提高精確度、簡化操作和提高工作效率和提高工作效率 。但是，使用限制性通路媒介柱，。但是，使用限制性通路媒介柱，也存在一些問題，需解決的問題：回收率、靈敏度、也存在一些問題，需解決的問題：回收率、靈敏度、耐用性耐用性。生物樣品中

10、的藥物分析前處理的要點生物樣品中的藥物分析前處理的要點除蛋白質(zhì)除蛋白質(zhì)濃縮濃縮手工前處理的問題手工前處理的問題處理時間處理時間重現(xiàn)性重現(xiàn)性藥物回收率藥物回收率前處理的現(xiàn)狀除蛋白、濃縮操作自動化的優(yōu)點除蛋白、濃縮操作自動化的優(yōu)點提高分析精度提高分析精度脫線處理時，難以保持操作完全一致，有時分析精度變差。脫線處理時，難以保持操作完全一致，有時分析精度變差。提高操作簡便性提高操作簡便性脫線處理時需操作熟練脫線處理時需操作熟練提高處理效率提高處理效率夜間可自動運行，大幅度地提高了處理效率夜間可自動運行，大幅度地提高了處理效率前處理自動化的課題前處理自動化的課題提高回收率及提高濃縮率提高回收率及提高濃縮

11、率自動前處理的優(yōu)點和課題提高回收率的手段提高回收率的手段p有必要使與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物游離出來有必要使與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物游離出來n與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物，在除蛋白質(zhì)處理時，藥物也與蛋白質(zhì)一起被除去，與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物，在除蛋白質(zhì)處理時，藥物也與蛋白質(zhì)一起被除去，藥物回收率降低。藥物回收率降低。p切斷蛋白質(zhì)結(jié)合（離子結(jié)合，疏水結(jié)合切斷蛋白質(zhì)結(jié)合（離子結(jié)合，疏水結(jié)合）n調(diào)整樣品導(dǎo)入溶液的調(diào)整樣品導(dǎo)入溶液的phph值值p堿性藥物時，使用堿性藥物時，使用phph值低的溶液值低的溶液p酸性藥物時，使用酸性藥物時，使用phph值高的溶液值高的溶液n調(diào)整樣品導(dǎo)入溶液的離子強度調(diào)整樣品導(dǎo)入溶液的離子強度p20-10

12、0mm20-100mm的緩沖液濃度的緩沖液濃度n在樣品導(dǎo)入溶液中添加有機溶劑在樣品導(dǎo)入溶液中添加有機溶劑p在在20%20%以內(nèi)使用有機溶劑（防止由蛋白質(zhì)的變性而產(chǎn)生的析出）以內(nèi)使用有機溶劑（防止由蛋白質(zhì)的變性而產(chǎn)生的析出）p使用界面活性劑使用界面活性劑( (* *) ) 從藥物保持（使用反相柱）的方式看，有抑制藥離子化的從藥物保持（使用反相柱）的方式看，有抑制藥離子化的phph 值較為理想。值較為理想。 方法方法 我們研究開發(fā)出優(yōu)質(zhì)的限制性通路媒介（我們研究開發(fā)出優(yōu)質(zhì)的限制性通路媒介（ramram）預(yù)柱，應(yīng)用柱切換）預(yù)柱，應(yīng)用柱切換hplchplc系系統(tǒng)及其在線稀釋旁路系統(tǒng)，可對血漿直接進行藥

13、物分析。統(tǒng)及其在線稀釋旁路系統(tǒng)，可對血漿直接進行藥物分析。 我們的系統(tǒng)我們的系統(tǒng) . . 回收率回收率 即使是緊密與蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物，也能被預(yù)柱吸附（捕集），即使是緊密與蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物，也能被預(yù)柱吸附（捕集）， 并且回收率幾乎達到并且回收率幾乎達到100%100% 靈敏度靈敏度 目標化合物可進行濃縮和分離即使是大體積進樣分析也如此目標化合物可進行濃縮和分離即使是大體積進樣分析也如此。 不會造成峰值惡化。不會造成峰值惡化。耐用性耐用性 新設(shè)計的涂漬技術(shù)和粒徑優(yōu)化技術(shù)，使得數(shù)據(jù)保持穩(wěn)定，即使是新設(shè)計的涂漬技術(shù)和粒徑優(yōu)化技術(shù)，使得數(shù)據(jù)保持穩(wěn)定，即使是 長時間的實驗也能如此。長時間的實驗也能如此

14、。co-sense for baco-sense for bap何謂何謂c co-sense for bao-sense for ban用于分析生物樣品的應(yīng)用系統(tǒng)用于分析生物樣品的應(yīng)用系統(tǒng)p具有在線稀釋旁通流路的自動前處理系統(tǒng)和新開發(fā)的前處理柱pshim-pack mayl-ods的組合，實現(xiàn)了真正的血漿（血清）的直接大量注入。p特長特長n可對應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)合率高的藥物可對應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)合率高的藥物p使用樣品導(dǎo)入用溶液的在線稀釋的應(yīng)用，即使是蛋白質(zhì)結(jié)合率高的藥物且在大量注入時 也可有效地捕集，回收率幾乎100%。n超高速進樣和無限接近零的交叉污染。超高速進樣和無限接近零的交叉污染。 -使用高效自動進樣

15、器n迅速且有效地除去蛋白迅速且有效地除去蛋白p有效地保護分析柱色譜柱和lc/ms的接口n經(jīng)久耐用的新型柱經(jīng)久耐用的新型柱 通過采用新開發(fā)的涂覆技術(shù)和粒子徑的最優(yōu)化，可得到長期穩(wěn)定數(shù)據(jù)。自動前處理系統(tǒng)的基本流路泵泵1泵泵2前處理柱前處理柱分離柱分離柱自動進樣器自動進樣器檢測器檢測器流動相流動相 導(dǎo)入溶液導(dǎo)入溶液自動前處理系統(tǒng)的基本流路泵泵1泵泵2前處理柱前處理柱分離柱分離柱自動進樣器自動進樣器檢測器檢測器流動相流動相 導(dǎo)入溶液導(dǎo)入溶液通過對樣品導(dǎo)入溶液進行最優(yōu)化，可提高回收率。但是，為了提高濃縮效果而大量進樣時的回收率會怎樣呢？血漿（血清）樣品的大量進樣時的回收率？p因大量進樣，回收率降低。因大

16、量進樣，回收率降低。p通過安裝在線稀釋旁通流路，可大量注入血漿（血清）通過安裝在線稀釋旁通流路，可大量注入血漿（血清）樣品。樣品。這便是co-sense的關(guān)鍵技術(shù)！自動進樣器前處理柱在線稀釋流路在線稀釋流路 導(dǎo)入泵在線稀釋流程圖在線稀釋流程圖樣品處理柱的容量樣品處理柱的容量 進樣體積對色譜圖的影響進樣體積對色譜圖的影響 當(dāng)進樣體積加大的時候，由于樣品處理柱子容量的限制會發(fā)生峰展寬的現(xiàn)象.100 ul50 ul10 ul100 ul50 ul10 ul不同進樣體積的影響不同進樣體積的影響10 uldrugprotein100 ul 小體積進樣的時候，預(yù)處理柱可捕集幾乎所有的藥物分子 大體積進樣的

17、時候，部分藥物被蛋白帶走，回收率降低在線稀釋泵提高回收率的原因在線稀釋泵提高回收率的原因auto-samplerpretreatment columnsample introduction pump在樣品進入預(yù)處理柱之前，在線稀釋泵可預(yù)先將蛋白和藥在樣品進入預(yù)處理柱之前，在線稀釋泵可預(yù)先將蛋白和藥物分子分離物分子分離auto-samplerpretreatment columnsample introduction pump90%10%free drugdilution pumpshim-pack mayi-ods shim-pack mayi-ods （ramram）預(yù)處理柱）預(yù)處理柱p采用

18、采用shim-pack mayi-odsshim-pack mayi-ods除蛋白除蛋白蛋白質(zhì)等大分子蛋白質(zhì)等大分子藥物藥物涂覆膜涂覆膜將硅膠（50m）的外表面用親水性聚合物涂覆，只將細孔內(nèi)部用十八烷基進行化學(xué)修飾。象蛋白質(zhì)這樣的高分子不能進入細孔內(nèi)部，并被外表面的親水性聚合物阻擋，不在固定相上保留，很快地洗脫。另一方面，諸如藥物這樣的通常的小分子化合物則浸透到細孔內(nèi)部，被保留在內(nèi)部表面的固定相上。pcolumn name ; shim-pack mayi-odsppacking material ; silica particleouter surface methyl cellulosei

19、nner surface octadecylsilyl grouppparticle size ; 50mmpcolumn size ; 4.6mm i.d. x 10mmpph range ; 2 - 7.5pmaximum pressure ;20mpa涂漬的甲基纖維素表面涂漬的甲基纖維素表面藥物藥物蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)ods 表面表面預(yù)處理柱預(yù)處理柱co-sense for baco-sense for ba的流路構(gòu)成的流路構(gòu)成樣品通過在線稀釋旁通的作用 ，導(dǎo)入溶液自動稀釋，被導(dǎo)入mayi-ods前處理柱。在除蛋白的同時，捕集、濃縮藥物step1. step1. 除蛋白質(zhì)的捕集濃縮除蛋白質(zhì)的捕集

20、濃縮分析用高壓梯度泵分析柱自動進樣器前處理柱在線稀釋旁通 導(dǎo)入樣品泵檢測器被mayi-ods捕集的藥物，經(jīng)閥切換，導(dǎo)入分析柱step 2. step 2. 分析經(jīng)濃縮的藥物分析經(jīng)濃縮的藥物 導(dǎo)入樣品泵分析用高壓梯度泵分析柱自動進樣器前處理柱在線稀釋旁通檢測器在線自動稀釋用旁通流路的效果在線自動稀釋用旁通流路的效果0412168time (min)標準標準溶液溶液無旁通無旁通有旁通有旁通樣品：消炎痛(1 mg/l) 添加血漿樣品導(dǎo)入液（稀釋液）：0.1磷酸水溶液：乙腈=95：5注入量：500l稀釋倍率：8倍檢測：uv 315nmp用蛋白結(jié)合率較高的消炎痛進行評價用蛋白結(jié)合率較高的消炎痛進行評價p

21、無稀釋旁通流路：回收率約50%。p有稀釋旁通流路：回收率幾乎100%自動濃縮帶來的高靈敏度自動濃縮帶來的高靈敏度100l注入注入200l注入注入500l注入注入0124816time (min)樣品：消炎痛(1 mg/l) 添加血漿 無峰形歪斜樣品導(dǎo)入液（稀釋液）：0.1%磷酸水溶液：乙腈混合液（95：5）檢測：uv 315nm實現(xiàn)高靈敏度實現(xiàn)高靈敏度p實現(xiàn)高靈敏度的大量注入的穩(wěn)定性實現(xiàn)高靈敏度的大量注入的穩(wěn)定性n捕集效率p即使注入血漿500l，回收率也幾乎達到100%。n峰形狀p樣品名：添加消炎痛的血漿recovery（ %)injection volume(l)ketoprofennapr

22、oxenwarfarin5098100100bypass2509790100500968399no bypass500542160recovery（ %)injection volume(l) chlorpropamideibuprofenacetohexamide509499100bypass250-9950010010099250-56no bypass5007157-流動相 (樣品導(dǎo)入溶液) ：100mm 醋酸鈉緩沖液 血漿樣品中藥物回收率測定血漿樣品中藥物回收率測定 在線自動稀釋用旁通流路的影響 各藥物在有稀釋旁路下的回收率結(jié)果 (spiked 2ug/ml each)table. 血

23、漿樣品中藥物回收率(spiked 2ug/ml each, 50ulinj.)樣品導(dǎo)入溶液樣品導(dǎo)入溶液 ph值變化值變化對回收率的影響對回收率的影響 樣品導(dǎo)入溶液對回收率的影響 1 recovery (%)mobile phase (sample injection liquid)injection volume ketoprofen naproxenwarfarin100mm phosphate (na) buffer / acetonitrile = 9 / 1 (v/v) 50l979898250l969596100mm phosphate (na) buffer 50l88208625

24、0l-100mm acetate (na) buffer50l98100100250l9790100100mm ammonium acetate50l977592250l92348610mm ammonium acetate100mm ammonium acetate200mm ammonium acetatenaproxen-75%85%lidocaine100%99%-noscapine96%94%-chlorpheniramine80%99%-propranolol87%91%-diphenhydramine93%96%-verapamil80%90%-acetohexamide62%1

25、00%-imipramine78%80%-table血漿樣品中各藥物回收率結(jié)果 (spiked 0.5ug/ml each (naproxen:2ug/ml), 50ulinj.)2樣品導(dǎo)入溶液樣品導(dǎo)入溶液 離子強度變化離子強度變化對回收率的影響對回收率的影響 100mm ammonium acetate / acetonitrile = 95/5 (v/v) / acetonitrile= 90/10 (v/v)200mm ammoniumacetate / acetonitrile= 98/2 (v/v)naproxen63%85%97%lidocaine99%99%-noscapine9

26、4%96%-chlorpheniramine99%100%-propranolol91%99%-diphenhydramine96%100%-verapamil90%94%100%-acetohexamide100%-imipramine80%86%95%-table recovery of drugs in plasma (spiked 0.5ug/ml each (naproxen:2ug/ml), 50ulinj.)3樣品導(dǎo)入溶液 乙腈溶劑添加乙腈溶劑添加對回收率的影響對回收率的影響出色的柱使用壽命出色的柱使用壽命08.517time (min)08.517time (min)第第1次次

27、第第300次次閥切換閥切換閥切換閥切換p連續(xù)注入時的穩(wěn)定性n血漿基底的洗脫p從穩(wěn)定的mayl-ods洗脫蛋白質(zhì)等血漿基底p峰及回收率p穩(wěn)定的峰形狀及回收率（幾乎100%）樣品 ：添加異丙基安替比林的血漿注入量 ：100l樣品導(dǎo)入液 ：0.1%磷酸水溶液乙腈混合液稀釋倍數(shù) ：8倍檢測 ：分析；275nm，血漿基質(zhì)；280nmco-sense for ba-lcms系統(tǒng)的特長通過在通過在co-sense for baco-sense for ba系統(tǒng)上連接系統(tǒng)上連接lcms-2010evlcms-2010ev，成為更強有力的生物樣品分析系統(tǒng)，成為更強有力的生物樣品分析系統(tǒng)lcmslcms所具有的高

28、選擇性檢測，在有復(fù)雜的基底的生物樣品的分析中，發(fā)揮威力所具有的高選擇性檢測，在有復(fù)雜的基底的生物樣品的分析中，發(fā)揮威力。何種化合物可用 lc/ms分析? 取決于化合物的離子化效率；取決于化合物的離子化效率； 化合物分子自身的極性，結(jié)構(gòu)及其所含的功能基團等因素均會化合物分子自身的極性，結(jié)構(gòu)及其所含的功能基團等因素均會影響離子化情況；影響離子化情況； 多數(shù)具有一定極性的有機化合物可以通過多數(shù)具有一定極性的有機化合物可以通過esi 或或apci的方式離的方式離子化，如子化，如: : 藥物及其代謝產(chǎn)物藥物及其代謝產(chǎn)物天然產(chǎn)物天然產(chǎn)物 ( (生物堿生物堿, , 配糖物、苷配糖物、苷glycosides,

29、 taxanes, glycosides, taxanes, 毒毒素素, , 糖類糖類, , 脂類脂類, , 維生素等等維生素等等) )蛋白質(zhì)，多肽；蛋白質(zhì)，多肽；殺蟲劑，除草劑殺蟲劑，除草劑表面活性劑和染料表面活性劑和染料lc/ms的優(yōu)勢p強大的定性和選擇性能力強大的定性和選擇性能力n多組份樣品的準確定性；多組份樣品的準確定性； n未充分分離組份峰的鑒別；未充分分離組份峰的鑒別；n消除雜質(zhì)干擾；消除雜質(zhì)干擾；p可作為便捷的定性分析可作為便捷的定性分析n用于合成和衍生反應(yīng)的研究用于合成和衍生反應(yīng)的研究；n作作nmr預(yù)分析的質(zhì)譜鑒定；預(yù)分析的質(zhì)譜鑒定；p廣泛適用于難揮發(fā)性化合物的分析廣泛適用于難

30、揮發(fā)性化合物的分析n擴展了大氣壓離子化擴展了大氣壓離子化的多種應(yīng)用的多種應(yīng)用 對液相色譜分離組份進行強有力的定性確證m/zm/zm/ztic色譜圖色譜圖 質(zhì)譜圖質(zhì)譜圖強大的選擇性a:100d:150b:100c:150m/z=150tic m/z=100abcd未充分分離峰的鑒別椰子油的分析椰子油的分析2.55.07.510.012.515.017.5min0e610e620e630e640e650e660e6int.三烷基甘油用反相三烷基甘油用反相hplc方式分離，方式分離，洗脫次序基于同系物的炭數(shù)洗脫次序基于同系物的炭數(shù)ecn = cn - 2 x dbelution order is b

31、ased on equivalent carbon number m/z 439.5 : c38 db=0 m/z 467.5 : c40 db=1 m/z 495.5 : c42 db=2 m/z 523.5 : c44 db=3tic 高效液相色譜高效液相色譜hplc與質(zhì)譜與質(zhì)譜ms的接口技術(shù)研究始于的接口技術(shù)研究始于1970s ; 大氣壓下的離子化大氣壓下的離子化api (atmospheric pressure ionization) 于于1987年商品化。年商品化。 大氣壓下的離子化接口大氣壓下的離子化接口: : 電噴霧離子化電噴霧離子化 electrospray ionizatio

32、n (esi)；大氣壓大氣壓下化學(xué)離子化下化學(xué)離子化 atmospheric pressure chemical ionization (apci) ；大氣壓下光離大氣壓下光離子化子化atmospheric pressure photo ionization (appi) lc/ms離子化接口高效液相高效液相hplc質(zhì)譜質(zhì)譜ms離子化接口離子化接口 含緩沖鹽的水含緩沖鹽的水/ /有機相；有機相； 非揮發(fā)性的流動相非揮發(fā)性的流動相non-volatilenon-volatile 高真空狀態(tài)高真空狀態(tài)分析離子（分析離子（m/zm/z） 去除液相色譜導(dǎo)入去除液相色譜導(dǎo)入的溶劑的溶劑 將待分析物離子化

33、將待分析物離子化關(guān)鍵技術(shù)關(guān)鍵技術(shù) 大氣壓狀態(tài)大氣壓狀態(tài)低真空區(qū)域低真空區(qū)域+ + + + + + +機械泵機械泵 渦淪分子泵渦淪分子泵tmp1 渦淪分子泵渦淪分子泵tmp2ms質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器高真空區(qū)域高真空區(qū)域lc/ms系統(tǒng)硬件主要構(gòu)造系統(tǒng)硬件主要構(gòu)造離子源離子源離子化接口離子化接口大氣壓下的離子化api方法的優(yōu)勢電噴霧電噴霧electrospray(esi)w適于極性樣品的分析；適于極性樣品的分析；w推薦使用半微量流速，在霧化氣條件下推薦使用半微量流速，在霧化氣條件下lc可實現(xiàn)高至可實現(xiàn)高至 1ml/min的流速的流速； w用該種離子源能形成多電荷離子用該種離子源能形成多電荷離子，擴展

34、了所能檢測的分子量范圍；擴展了所能檢測的分子量范圍；大氣壓下化學(xué)電離大氣壓下化學(xué)電離atmospheric pressure chemical ionization(apci)w低極性化合物；低極性化合物；w推薦使用半微量流速，在霧化氣條件下推薦使用半微量流速，在霧化氣條件下lc流速可實現(xiàn)高流速可實現(xiàn)高至至2ml/min；w比熱噴霧具有更好的穩(wěn)定性；比熱噴霧具有更好的穩(wěn)定性；大氣壓下光電離大氣壓下光電離atmospheric pressure photo ionization(appi)atmospheric pressure photo ionization(appi)w弱極性和非極性化合物

35、弱極性和非極性化合物w直接直接appi離子化及摻雜物離子化及摻雜物appi離子化方式的正確選擇離子化方式的正確選擇- 干燥氣體干燥氣體- 保護保護tmp 1tmp 2旋轉(zhuǎn)泵旋轉(zhuǎn)泵廢液管廢液管檢測器檢測器四極桿四極桿前桿前桿入口鏡入口鏡聚焦鏡聚焦鏡八極八極q-陣列陣列skimmer保護閥保護閥來自來自lc霧化氣體霧化氣體esi或或apci或或appi源源 cdl干燥氣體干燥氣體 島津島津qoq設(shè)計設(shè)計允許流速：允許流速：0.0011 ml/min；操作溫度：室溫；操作溫度：室溫；霧化氣流速霧化氣流速n2 ：1.5 l/min 高電壓高電壓 霧化氣霧化氣+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-

36、+-+ 大氣壓下的離子化大氣壓下的離子化(api) 原理原理電噴霧離子化電噴霧離子化 esiesi液相流出組份液相流出組份1)1)帶電液滴帶電液滴2)溶劑蒸發(fā)溶劑蒸發(fā)3)離子蒸發(fā)離子蒸發(fā)大氣壓下的離子化大氣壓下的離子化 (api)原理原理大氣壓下化學(xué)離子化大氣壓下化學(xué)離子化 (apci) 高壓放電針高壓放電針 離子離子- -分子反應(yīng)分子反應(yīng)允許流速：允許流速：0.05 2 ml/min加熱模塊加熱模塊: : 400oc霧化氣流速霧化氣流速n2 ： 2.5 l/minapci液相流出組份液相流出組份霧化氣霧化氣大氣壓下的離子化大氣壓下化學(xué)離子化 (apci) 1) lc 流份在霧化氣作用下進入加

37、熱模塊；流份在霧化氣作用下進入加熱模塊；2) 流動相蒸發(fā)；流動相蒸發(fā)；3)3) 高壓放電條件下，質(zhì)子化溶劑被離子化高壓放電條件下，質(zhì)子化溶劑被離子化 ( (產(chǎn)生反應(yīng)離子產(chǎn)生反應(yīng)離子) )；4) 樣品和已產(chǎn)生的反應(yīng)離子發(fā)生離子樣品和已產(chǎn)生的反應(yīng)離子發(fā)生離子- -分子反應(yīng)生成質(zhì)子化分子反應(yīng)生成質(zhì)子化分子分子離子離子- -分子反應(yīng)分子反應(yīng)schematic diagram of appi cdluvlampheaternebulizergasfromhplcesiapciappipolarityvery polarnonpolarmolecular weight10,0001,000100正離子或負

38、離子模式采集數(shù)據(jù)? p質(zhì)譜數(shù)據(jù)以正離子還是負離子模式采集，需考慮被測樣品結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)以正離子還是負離子模式采集，需考慮被測樣品結(jié)構(gòu)和特性等特性等 由于由于c-o、c-n、雙鍵、三鍵及堿性化合物具有較強的質(zhì)子親雙鍵、三鍵及堿性化合物具有較強的質(zhì)子親和力，上述基團或化合物更傾向于形成正離子和力，上述基團或化合物更傾向于形成正離子； 含含cooh, -f, -cl, -hso3 的偏酸性化合物由于具有較強的質(zhì)子的偏酸性化合物由于具有較強的質(zhì)子給予能力，更傾向于形成負離子給予能力，更傾向于形成負離子；還有許多化合物既可形成正離子，也能生成負離子；還有許多化合物既可形成正離子，也能生成負離子；lc/m

39、s 2010ev的硬件結(jié)構(gòu)正交設(shè)計的離子源正交設(shè)計的離子源加熱的毛細管加熱的毛細管q-array八極桿八極桿octapole四極桿質(zhì)量分析器四極桿質(zhì)量分析器檢測器檢測器離子轉(zhuǎn)移離子轉(zhuǎn)移質(zhì)量過濾質(zhì)量過濾cdl(curved desolvation line )單元和qoq系統(tǒng)加熱模塊加熱模塊block heater端口端口tip廢液孔廢液孔cdl 單元單元q-array q-陣列陣列八極桿透鏡八極桿透鏡qctopole四極桿四極桿quadrupoleq-陣列陣列側(cè)面?zhèn)让姘藰O桿透鏡八極桿透鏡四極桿側(cè)面四極桿側(cè)面 qoq系統(tǒng)是一套包含系統(tǒng)是一套包含q- 陣列陣列(q-array) + + 八極八極桿

40、透鏡桿透鏡(qctopole lens) + +四極桿四極桿(quadrupole)。 這套離子光學(xué)系統(tǒng)是島津公司集這套離子光學(xué)系統(tǒng)是島津公司集30年質(zhì)譜設(shè)計、年質(zhì)譜設(shè)計、生產(chǎn)經(jīng)驗的結(jié)果，具有優(yōu)異的離子傳輸和離子會生產(chǎn)經(jīng)驗的結(jié)果，具有優(yōu)異的離子傳輸和離子會聚性能聚性能 。qoq 系統(tǒng)介紹q-array（ （q-陣列）陣列）三排四極板平行排列，形成一錐形區(qū)域，使離子能被三排四極板平行排列，形成一錐形區(qū)域，使離子能被有效地引入八極桿。有效地引入八極桿。octopole lens（ （八極桿透鏡）八極桿透鏡）八極桿透鏡實現(xiàn)穩(wěn)定的離子會聚八極桿透鏡實現(xiàn)穩(wěn)定的離子會聚, 不易受不易受系統(tǒng)真空變化的影響。

41、系統(tǒng)真空變化的影響。quadrupole（ （四極桿）四極桿）帶有預(yù)桿的鉬制雙曲線四極桿系統(tǒng)作為帶有預(yù)桿的鉬制雙曲線四極桿系統(tǒng)作為 質(zhì)量過濾器。預(yù)桿保護主四極桿免受污染，質(zhì)量過濾器。預(yù)桿保護主四極桿免受污染，并延長使用壽命。島津公司多年來并延長使用壽命。島津公司多年來 不斷不斷改進、優(yōu)化改進、優(yōu)化四極桿系統(tǒng)的性能四極桿系統(tǒng)的性能, 最終實現(xiàn)最終實現(xiàn)優(yōu)異的離子傳輸效率，質(zhì)量數(shù)的穩(wěn)定性和優(yōu)異的離子傳輸效率，質(zhì)量數(shù)的穩(wěn)定性和峰形。峰形。qqoq-array中離子軌道示意圖 上圖顯示具有不同入射角度的離子集穿過上圖顯示具有不同入射角度的離子集穿過q-array的軌跡的軌跡。離子的運行路線被校正離子的運

42、行路線被校正后后，匯聚在中心的匯聚在中心的skimmer入口處入口處。 。這一離子運行軌道是依據(jù)這一離子運行軌道是依據(jù)optdesign模型（島津研模型（島津研發(fā)中心）計算優(yōu)化得到的。發(fā)中心）計算優(yōu)化得到的。各種方向運動矢各種方向運動矢量的離子集量的離子集通過通過q-array后的離子集，后的離子集，經(jīng)會聚作用具有同一矢量經(jīng)會聚作用具有同一矢量 三排四極板成錐形平行排列，三排四極板成錐形平行排列， 使離子被會聚于一狹窄區(qū)域。使離子被會聚于一狹窄區(qū)域。 這與具有高頻電壓這與具有高頻電壓的四極桿工作原理類似。的四極桿工作原理類似。錐形設(shè)計提高了離子會聚能力，這也是提高靈敏度的關(guān)錐形設(shè)計提高了離子會

43、聚能力，這也是提高靈敏度的關(guān)鍵。鍵。 performance of the q-array and related optics is up to 10 times more sensitive than other designs.典型的lc/ms質(zhì)譜圖nnnosch3nh2(h3c)3cmetribuzin c8h14n4osexact mass: 214.09mol. wt.: 214.29nnnhosch3(h3c)3cdesaminometribuzin (da)c8h13n3osexact mass: 199.08mol. wt.: 199.27nnhnoonh2(h3c)3cdi

44、ketometribuzin (dk) c7h12n4o2exact mass: 184.10mol. wt.: 184.20nnhnhoo(h3c)3cdesaminodiketmetoribuzin (dadk) c7h11n3o2exact mass: 169.09mol. wt.: 169.1850100150200250300350400450m/z0e350e3100e3150e3200e3250e3300e3350e3int.185197207227391105295167257142268317425280369128155243404341497668246945357482

45、50100150200250300350400450m/z0e3100e3200e3300e3400e3500e3int.183243168153265207113228281893562973681413221934612504354844164054997150apci正離子模式正離子模式apci負離子模式負離子模式co-sense for ba-lcmsco-sense for ba-lcms分析血分析血漿樣漿樣品品通過在通過在co-sense for baco-sense for ba系統(tǒng)上連接系統(tǒng)上連接lcms-2010evlcms-2010ev，成為更強有力的生物樣品分析系統(tǒng)，成為

46、更強有力的生物樣品分析系統(tǒng)lcmslcms所具有的高選擇性檢測，在有復(fù)雜的基底的生物樣品的分析中，發(fā)揮威力所具有的高選擇性檢測，在有復(fù)雜的基底的生物樣品的分析中，發(fā)揮威力。分析條件 pretreatmentcolumnshim-pack mayi-ods (4.6mmi.d. x 10mm)extraction mobile phase10mm ammonium acetate/acetonitrile = 95/5flow rate3ml/mincolumn temperature45cinjection volume5, 10 or 50lextraction time1 or 2mind

47、ilution factor8 foldanalysiscolumnphenomenex mercury ms (4.0mmi.d. x 10mm, 5m)mobile phasea : 10mm ammonium acetate, b : acetonitrilegradient programextraction time 1min5%b(0-0.5min) 90%b(3-4min) - 5%b(4.01min)- stop(5min) orextraction time 2min5%b(0-1.5min) 90%b(4-5min) - 5%b(5.01min)- stop(6min)fl

48、ow rate0.8ml/minsplit ratio1 : 3 (mass spectrometer : waste)column temperature45cionizationelectrospray ionizationprobe voltage+4.5 kv or 3.5kvnebulizing gas flow4.5l/min1234min500e31000e31500e32000e32500e3int.1 :1 :倍他樂克 m/z 268m/z 2682 :2 :普萘洛爾 m/z 260m/z 2603 :3 :利多卡因 m/z 235m/z 2354 :4 :狄布卡因 m/z

49、344m/z 3445 :5 :布比卡因 m/z 289m/z 289123451 g/ml each, 5 lsim chromatograms of standards rsd, % (n=5)compoundstandardplasma spikedmetoprolol1.21.0propranolol1.01.4lidocaine0.92.6dibucaine1.62.5bupivacaine0.71.5each 1ug/ml, 5ul重現(xiàn)性2.5min500e31000e31500e32000e32500e3int.2.5min500e31000e31500e32000e32500e

50、3int.標準 血漿中的藥物倍他樂克95.0% 普萘洛爾97.4%利多卡因94.0%狄布卡因107.7%布比卡因97.1%each 1ug/ml, 5ul, n=5回收率05000000100000001500000000.20.40.60.811.2conc.( g/ml)area1 :倍他樂克r=0.999542 :普萘洛爾r=0.999583 :利多卡因r=0.999814 :狄布卡因r=0.999785 :布比卡因r=0.999860.01 1ug/ml, 10ul, n=5, plasma spiked12345校正曲線 提取液中含乙腈對回收率的影響a. 提取液 : 10mm 乙酸銨

51、/乙腈 = 95/5b. 提取液 : 10mm 醋酸銨c co om mp po ou un nd d r re ec co ov ve er ry y w wi it th h a ac cc cn n, , % %a a r re ec co ov ve er ry y w wi it th ho ou ut t a ac cc cn n, , % %b b 倍倍他他樂樂克克 9 95 5. .0 0 7 79 9. .3 3 普普萘萘洛洛爾爾 9 97 7. .4 4 8 80 0. .6 6 利利多多卡卡因因 9 94 4. .0 0 8 88 8. .6 6 狄狄布布卡卡因因 1 1