農(nóng)業(yè)MS培養(yǎng)基及配制注意事項(xiàng)

1、一、ms培養(yǎng)基母液的配制母液成分規(guī)定量濃縮倍數(shù)稱(chēng)取量（mg）母液體積（ml）配制1升培養(yǎng)基吸取量定容編號(hào)種類(lèi)1大量元素kno3190010190001000 100nh4no316501016500mgso4·7h2o370103700kh2po41701017002cacl2·2h2o44010440010001003微量元素mnso4·4h2o22.31002230100010znso4·7h2o8.6100860h3bo36.2100620ki0.8310083na2moo4·7h2o0.2510025cuso4.5h2o40.02510

2、02.5cocl2.6h2o0.0251002.54鐵鹽na2-edta37.31003730100010feso4.4h2o27.810027805有機(jī)物甘氨酸2.010010050010鹽酸吡哆醇0.510025鹽酸硫銨素0.11005煙酸0.5100256肌酸100100500050010注意：1大量元素按照使用時(shí)高10倍的數(shù)值稱(chēng)取，分別將各種化合物稱(chēng)量后，除cacl2·2h2o單獨(dú)配制外，其余化合物混合在500ml燒杯中加適量蒸餾水溶解，用玻璃棒攪拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，置小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽注明化合物名稱(chēng)（或編號(hào)），濃縮倍數(shù)，配制日期和配制者姓

3、名，cacl2·2h2o配制同上置于另一小口瓶中。2微量元素母液的配制 按要求濃縮100倍的數(shù)值稱(chēng)取，分別將各種化合物稱(chēng)量除鐵鹽（feso4·7h2o和na2-edta.2h2o）作為一組單獨(dú)配制外，其余化合物可混合置于燒杯內(nèi)加少量蒸餾水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽。3鐵鹽配制將feso4·7h2o和na2-edta.2h2o分別溶于450ml蒸餾水中，加熱，（很重要）不斷攪拌，溶解后，兩液混合，調(diào)ph至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，貼上標(biāo)簽。4有機(jī)物母液配制，按母液要求濃縮50倍，除蔗糖按3%單獨(dú)臨時(shí)稱(chēng)量外，其余分別

4、稱(chēng)量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽。5母液最好在24的冰箱中貯存，特別是有機(jī)類(lèi)物質(zhì)，貯存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，無(wú)機(jī)鹽母液最好在一個(gè)月內(nèi)用完，如發(fā)現(xiàn)有霉菌和沉淀產(chǎn)生，就不能再使用。1 制備母液和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基時(shí)，所用蒸餾水或無(wú)離子水必須符合標(biāo)準(zhǔn)要求，化學(xué)藥品必須是高純度的（分析純）。2 稱(chēng)量藥物采用高靈敏度的天平，每種藥品專(zhuān)用一藥匙。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液配制： 為了操作方便，節(jié)約時(shí)間，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也可如同配制母液一樣，先配成原液，這樣配制培養(yǎng)基時(shí)只要稍加計(jì)算，按需要量取即可。 不同藥品在配制時(shí)若不溶于水，可用少量不同的溶劑先溶解，萘乙酸（naa），吲哚乙酸（iaa）,赤霉素（ga3）

5、，2，4-d等生長(zhǎng)素和玉米素（zt）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加熱。激動(dòng)素（kt）和6-芐基嘌呤（ba）可溶于少量1mol/l的鹽酸中，葉酸需用少量稀氨水溶解。稱(chēng)取50mg生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升則含有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)0.5mg，配制后一般要求在低溫（04）保存，配制培養(yǎng)基時(shí)如每升（1000ml）需添加的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑物質(zhì)為0.5mg時(shí)，則取1ml母液即可。二、培養(yǎng)基配制和滅菌一養(yǎng)培養(yǎng)基配制程序(一).母液吸取量的計(jì)算 配制培養(yǎng)基的升數(shù)公式1：母液吸取量= 母液體積（cc）×母液濃縮倍數(shù) 培養(yǎng)基要求的含量 公式2：母液吸取量=

6、 （各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑）母液每cc的含量（二） 各種母液按順序編號(hào)排列a. 大量元素；b.cacl2.2h2o； c.微量元素 ；d.鐵鹽； e.有機(jī)物； f生長(zhǎng)素萘乙酸（naa）：配制0.5mg/ml的naa稱(chēng)取50mg ， naa用少量95% 酒精溶解后加蒸餾水定容至1000ml；g.細(xì)胞分裂素、激動(dòng)素（kt）配制0.5mg/ml的kt 稱(chēng)50mgkt用少量1n hcl溶解后,加蒸餾水定容至100ml。(三)配制培養(yǎng)基（1000ml）1. 瓊脂: 稱(chēng)取57g瓊脂，加入300ml蒸餾水，加熱溶解直至完全溶解為止.2. 蔗糖3%用質(zhì)量較好的白糖代替，稱(chēng)取30g白糖，溶于溶有瓊脂的300ml蒸餾水中

7、。3. 各種母液的吸?。ㄅ囵B(yǎng)基1l）（1） 用50ml量筒量取大量元素母液（a）和cacl2·2h2o母液（b）各100ml（2） 分別用10ml移液管或吸管吸取微量元素（c），鐵鹽（d）母液各10ml（3） 用10ml移液管或吸管吸取有機(jī)物（h）10ml（4） 移取激素 將上述溶液全部混合于瓊脂與蔗糖溶液中，混合均勻后，加熱至80左右，用酸度計(jì)或精密ph試紙測(cè)定培養(yǎng)基的ph一般要求5.86.0，過(guò)酸過(guò)堿則用1n naoh和1n hcl調(diào)整。二分裝：用一個(gè)接有膠管的分裝器趁熱裝培養(yǎng)基，1000ml培養(yǎng)基分裝到25-30個(gè)三角瓶中，每個(gè)三角瓶約30ml左右（一般占試管、三角瓶容量1/4

8、1/3左右）注：培養(yǎng)基勿碰瓶壁。三.包裝：分裝好的三角瓶用封口膜包扎好，標(biāo)明培養(yǎng)基代號(hào)即可進(jìn)行滅菌。 用具清理和洗滌：各種母液按原位置擺整齊，用過(guò)的量筒，移液管、燒杯、鋁鍋等用水洗滌干凈，然后按次序放回原處。三、高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法具體操作步驟：1. 高壓鍋放水至平把架；2. 把包扎好的培養(yǎng)基裝入高壓鍋;3. 蓋上熱壓鍋蓋,上緊螺帽(注意對(duì)角擰緊螺帽)關(guān)上氣閥和安全閥.4. 然后接通電源.5. 壓力計(jì)升至0.05mpa時(shí)，打開(kāi)放氣閥,排除冷空氣(此步很重要)。6. 排除冷空氣后,關(guān)閉放氣閥，待壓力升到0.11mpa位置時(shí)，開(kāi)始計(jì)算滅菌時(shí)間，具體方法：當(dāng)壓力鍋指針升至0.12mpa時(shí)，關(guān)閉電

9、源，待指針下降至0.11mpa時(shí)接通電源，不斷重復(fù)此操作過(guò)程，維持20分鐘。7. 滅菌時(shí)間達(dá)到20分鐘后，除去電源，打開(kāi)放氣閥(注意要逐漸放氣)待高壓鍋內(nèi)的空氣完全排除后，打開(kāi)熱壓滅菌鍋蓋(注意對(duì)角扭松螺帽)稍待冷后再把培養(yǎng)基取出。8.經(jīng)過(guò)滅菌的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基不宜放置太長(zhǎng)，應(yīng)盡早使用，但為了在使用前能檢查培養(yǎng)基有無(wú)微生物污染，可將培養(yǎng)基置于25下保存4天，如果培養(yǎng)基需要貯存較長(zhǎng)時(shí)間，可在4低溫下保存。 滅菌高壓鍋有大型臥式、中型立式、小型手提式等多種型號(hào)和規(guī)格，無(wú)論哪種型號(hào)，操作的步驟都很相近。 進(jìn)水放進(jìn)培養(yǎng)基蓋緊鍋蓋關(guān)上放汽閥檢查安全閥接上加熱源待壓力升至0.05mpa時(shí)排鍋內(nèi)冷空氣，關(guān)上放氣閥

10、0.11mpa(121)下滅菌2025分鐘，保持穩(wěn)定壓力除熱源逐漸打開(kāi)放氣閥鍋內(nèi)空氣排除完后開(kāi)放鍋蓋稍冷后取出培養(yǎng)基。四、無(wú)菌操作技術(shù)（一）植物材料表面消毒劑滅菌從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無(wú)菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過(guò)程叫做接種。1.接種步驟： 第一步：清理材料流水沖洗加入吐溫（或洗衣粉）清洗 自來(lái)水沖洗第二步：對(duì)材料的表面浸潤(rùn)滅菌 ： 70%酒精浸10-30秒無(wú)菌水第三步：滅菌劑處理 0.1-1%升汞5-8 min（或其他滅菌劑） 第四步：無(wú)菌水進(jìn)行沖洗注意事項(xiàng)：.滅菌劑

11、一般要臨時(shí)配制，現(xiàn)配現(xiàn)用升汞可以短期儲(chǔ)存.對(duì)去除較容易的滅菌劑滅菌后無(wú)菌水沖洗-次，升汞一般-次，每次不少于min.滅菌時(shí)要輕輕的攪拌，消除氣泡，使消毒更徹底.滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開(kāi)始，至倒入無(wú)菌水時(shí)為止。.滅菌液要充分浸沒(méi)材料2.無(wú)菌操作可按以下步驟進(jìn)行：（1）在接種3天前用甲醛熏蒸接種室，并于接種前3小時(shí)打開(kāi)其內(nèi)紫外線(xiàn)燈進(jìn)行殺菌；（2）在接種前20分鐘，打開(kāi)超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外線(xiàn)燈；（3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；（4）上工作臺(tái)后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。然后搽拭工作臺(tái)面；（5）先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過(guò)火一遍，然

12、后反復(fù)過(guò)火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過(guò)火烤干；（6）接種時(shí)，接種員雙手不能離開(kāi)工作臺(tái)，不能說(shuō)話(huà)、走動(dòng)和咳嗽等；材料吸干后，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢＃ㄈ缛~片切成0.5cm2的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?-2片葉原基）在接種過(guò)程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。（7）接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外線(xiàn)燈滅菌30分鐘，若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。常用植物激素類(lèi)別名稱(chēng)縮寫(xiě)詞分子量使用濃度范圍母液配制說(shuō)明生長(zhǎng)素2，4二氯苯氧乙酸2，4d221.00.00110mg/l生長(zhǎng)素通常用naoh溶液滴至溶解成溶液。能溶于乙醇iaa易被植物細(xì)胞所氧化。故培養(yǎng)

13、基中很少單獨(dú)使用。萘乙酸naa186.20.00110mg/l吲哚3乙酸iaa175.20.00110mg/l吲哚3丁酸iba203.20.00110mg/l細(xì)胞分裂6芐基氨基嘌呤ba225.2分裂素通常能溶于稀naoh，含水乙醇或稀鹽酸玉米素不耐熱，不能高壓滅菌。6糠基氨基嘌呤kt215.2n異戊烯氨基嘌呤（玉米素）zt219.2赤霉素赤霉素ga3346.4能溶于乙醇不耐熱不能高壓滅菌在愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物的啟動(dòng)和保持生長(zhǎng)時(shí)才需要有時(shí)小植株再生時(shí)也需要四、常用藥品的配置方法1.1mol/l hcl的配制：根據(jù)鹽酸的密度37%鹽酸溶液的密度為1.19克/毫升，假設(shè)要配制1000ml 1mol/l hcl，則需要鹽酸的物質(zhì)的量為1mol，所以需要量取37%的鹽酸為1*36.5/37%/1.19=82ml 2.1mol/l的naoh的配制：稱(chēng)40gnaoh，然后融于1000ml的蒸餾水中。（定容到100ml）3.95%的酒精配制成75%的酒精：用量筒量取750ml的95%酒精加入200ml的蒸餾水即可得到75%的酒精。如果用無(wú)水酒精配制75%的酒精，則量取750ml的無(wú)水酒精，再加水250ml。4.0.1