紫外分光光度法和熒光分析法

1、一、紫外一、紫外可見光分光光度法可見光分光光度法光譜分析法光譜分析法二、熒光分析法二、熒光分析法 基本原理基本原理儀器主要部件儀器主要部件主要應(yīng)用主要應(yīng)用基本原理概述：紫外概述：紫外-可見分光光度法是通過被測物可見分光光度法是通過被測物質(zhì)在紫外質(zhì)在紫外-可見光區(qū)的特定波長或一定波長可見光區(qū)的特定波長或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性和范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。主要用于藥品的鑒別、定量分析的方法。主要用于藥品的鑒別、檢查和含量測定。檢查和含量測定。范圍：范圍： 可見光區(qū)（可見光區(qū)（400760nm） 紫外光區(qū)（紫外光區(qū)（200400nm）Beer-Lambor

2、t 定律A=log=Ecl1T*A為吸收度；*T為透光率；*E為吸收系數(shù)（以以 表示，溶液濃度為表示，溶液濃度為1%（g/ml），厚度為），厚度為1cm時的吸光度值時的吸光度值）*c為溶液濃度；*l為樣品總厚度。Ecm%11適用條件：入射光為單色光入射光為單色光溶液是稀溶液溶液是稀溶液固體、固體、 液體和氣體樣品在同一波長液體和氣體樣品在同一波長下，各組分吸光度具有加和性下，各組分吸光度具有加和性儀器主要部件儀器主要部件單色器單色器光源光源檢測器檢測器吸收池吸收池信號顯信號顯示系統(tǒng)示系統(tǒng)儀器分類單光束紫外可見分光光度計(jì)準(zhǔn)雙光束紫外可見分光光度計(jì)雙光束紫外可見分光光度計(jì)雙波長紫外可見分光光度計(jì)主

3、要應(yīng)用 利用藥物與雜質(zhì)對光的選擇性吸收性質(zhì)的差異，若藥物在雜質(zhì)的最大吸收波長處沒有吸收，則可在此波長處測樣品溶液的吸收度，通過控制樣品溶液吸收度來控制雜質(zhì)的量。例：地蒽酚中二羥基蒽醌的檢查 二羥基蒽醌的三氯甲烷溶液 在432nm處有最大吸收，而 地蒽酚在該處幾乎無吸收。1、藥物的雜質(zhì)檢查2、藥物的含量測定 如巴比妥類藥物的含量測定（巴比妥類藥物在堿性介質(zhì)中電離為具有紫外吸收特征的結(jié)構(gòu)）、芳酸及其脂類藥物含量測定、維生素A含量測定（在325328nm的波長范圍內(nèi)有最大吸收）等。三點(diǎn)校正法 本方法是在三個波長處測得吸光度，根據(jù)校正公式計(jì)算吸光度校正值后，再計(jì)算含量。其原理主要基于以下兩點(diǎn)： 雜質(zhì)的

4、無關(guān)吸收再310340nm的波長范圍內(nèi)幾乎呈一條直線，且隨波長的增大吸光度下降。 物質(zhì)對光吸收呈加和性的原理，即在某一樣品的吸收曲線上，各波長的吸光度是維生素A與雜質(zhì)吸光度的代數(shù)和，因而吸收曲線也是二者吸收的疊加。3、藥物的鑒別 對比吸收光譜特征數(shù)據(jù)對比吸收光譜特征數(shù)據(jù) 對比吸收度（或吸收系數(shù)）的比值對比吸收度（或吸收系數(shù)）的比值 對比吸收光譜的一致性對比吸收光譜的一致性 例苯磺舒：用含鹽酸的乙醇取鹽酸溶液（9-1000）2ml，加乙醇制成100ml制成沒1ml中含20ug的溶液，在225nm與249nm的波長處有最大吸收，在249nm波長處的吸收度為0.67 。甾體激素類藥物：丙酸倍氯米松的

5、乙醇溶液（20ug/ml），在239nm的波長處應(yīng)有最大吸收，吸光度為0.570.60;在239nm與263nm波長處的吸光度比值應(yīng)為2.252.451.判別物質(zhì)的異構(gòu)體，如互變異構(gòu)體，順反異構(gòu)體，開鏈和成環(huán)異構(gòu)體，旋光異構(gòu)體，空間異構(gòu)體等。反式異構(gòu)體空間位阻小，共軛程度較完全。最大吸收峰波長，最大摩爾吸收系數(shù)，大于順式。2.推測物質(zhì)的共軛體系和部分骨架一般需與色譜，紅外，質(zhì)譜，波譜等多種儀器聯(lián)合作物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析。4.結(jié)構(gòu)分析紫外分光光度測定方法普通測定分光光度法普通測定分光光度法 1.單組分的測定單組分的測定 通常采用 A-C 標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定。2.多組分的同時測定多組分的同時測定 若各組

6、分的吸收曲線互不重疊，則可在各自最大吸收波長處分別進(jìn)行測定。這本質(zhì)上與單組分測定沒有區(qū)別。 若各組分的吸收曲線互有重疊，則可根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。A1= a1bca b1bcb A2= a2bca b2bcb 差示分光光度法差示分光光度法普通分光光度法一般只適于測定微量組分，當(dāng)待測組分含量較高時，將產(chǎn)生較大的誤差。需采用示差法。 即提高入射光強(qiáng)度，并采用濃度稍低于待測溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液。設(shè)：待測溶液濃度為cx，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為cs(cs cx)。則： Ax= b cx As = b cs x s =b(cx cs ）=bc 測得的吸光度相當(dāng)于普通法中待測溶液

7、與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度之差。示差法測得的吸光度與c呈直線關(guān)系。由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的c值，則待測溶液濃度cx ： cx = cs + c 雙波長分光光度法不需空白溶液作參比；但需要兩個單色器獲得兩束單色光(1和2)；以參比波長1處的吸光度A1作為參比，來消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復(fù)雜試樣時顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測量精密度等方面都比單波長法有所提高。 A 2 A 1 （2 1 ) b c 兩波長處測得的吸光度差值與待測組分濃度成正比（例子：課本366頁）導(dǎo)數(shù)分光光度法導(dǎo)數(shù)分光光度法在多組分同時測定、渾濁樣品分析、消除背景干擾、加強(qiáng)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜光譜的辨析等方面，顯示了

8、很大的優(yōu)越性。 利用吸光度利用吸光度(或透光度或透光度)對波長的導(dǎo)數(shù)曲線來進(jìn)行分對波長的導(dǎo)數(shù)曲線來進(jìn)行分析：析： 0 e-bc假定入射光強(qiáng)度0 在整個波長范圍內(nèi)保持恒定： dI 0 /d0則：dI/d0 bc e -bc d/d 0 bc d/d（例子：課本（例子：課本233頁）頁）其他卡爾曼濾波法 偏最小二乘法 小波變換三波長分光光度法 系數(shù)倍率法與紫外與紫外-可見法異同點(diǎn)可見法異同點(diǎn)應(yīng)用應(yīng)用 原理原理原理 熒光熒光分子吸收電磁波后，從其最低激發(fā)分子吸收電磁波后，從其最低激發(fā)態(tài)重新發(fā)射紫外線或可見光的現(xiàn)象態(tài)重新發(fā)射紫外線或可見光的現(xiàn)象 利用某些物質(zhì)被一定波長的光照射后所產(chǎn)利用某些物質(zhì)被一定波

9、長的光照射后所產(chǎn)生的，能夠反映該物質(zhì)特性的熒光來進(jìn)行生的，能夠反映該物質(zhì)特性的熒光來進(jìn)行定性定量的分析方法定性定量的分析方法熒光分析法。熒光分析法。在溶液中，當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度較低時,其熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度通常有良好的正比關(guān)系,即IF=KC 光照光照 分子基態(tài)分子基態(tài) 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài) 輻射躍遷輻射躍遷 熒光熒光 若光源是：若光源是： 由熒光波長可確定物質(zhì)分子由熒光波長可確定物質(zhì)分子 可見可見-紫外光源紫外光源 分子熒光分析法分子熒光分析法 具有結(jié)構(gòu)具有結(jié)構(gòu) 由熒光強(qiáng)度可測物質(zhì)的含量由熒光強(qiáng)度可測物質(zhì)的含量 原子特征光譜作光源原子特征光譜作光源 原子熒光分析原子熒光分析 X射線作光源射線作光源 X

10、射線熒光分析射線熒光分析構(gòu)件構(gòu)件光源光源 ： 為高壓汞蒸氣燈或?yàn)楦邏汗魵鉄艋螂綦?，后者能發(fā)射出強(qiáng)度較大的連續(xù)，后者能發(fā)射出強(qiáng)度較大的連續(xù)光譜，且在光譜，且在300nm400nm 范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，故較常用范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，故較常用 。激發(fā)單色器激發(fā)單色器 ： 置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或第一單置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或第一單色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。 發(fā)射單色器：發(fā)射單色器：置于樣品室和檢測器之間的為發(fā)射單色器或第二置于樣品室和檢測器之間的為發(fā)射單色器或第二單色器，常采用光柵為單色器。篩選出特定的發(fā)射光譜單色器，常采用光柵為單色器。

11、篩選出特定的發(fā)射光譜 樣品室：樣品室： 通常由石英池通常由石英池(液體樣品用液體樣品用)或固體樣品架或固體樣品架(粉末或片狀樣粉末或片狀樣品品)組成。組成。 檢測器：檢測器： 一般用光電管或光電倍增管作檢測器?？蓪⒐庑盘柗糯笠话阌霉怆姽芑蚬怆姳对龉茏鳈z測器?？蓪⒐庑盘柗糯蟛⑥D(zhuǎn)為電信號。并轉(zhuǎn)為電信號。 熒光分析法與紫外熒光分析法與紫外-可見分析法異同點(diǎn)可見分析法異同點(diǎn) 熒光分析法與紫外熒光分析法與紫外-可見比較：可見比較： 均屬于分子光譜均屬于分子光譜 儀器構(gòu)造儀器構(gòu)造 基本相似基本相似 熒光熒光 可見可見-紫外紫外 本質(zhì)本質(zhì) 發(fā)射光譜發(fā)射光譜 吸收光譜吸收光譜 靈敏度靈敏度 10-10-10-

12、12 g/ml 10-4-10-7g/ml 選擇性選擇性 高高 一般一般應(yīng)用應(yīng)用硫色素?zé)晒夥y定維生素硫色素?zé)晒夥y定維生素B1 維生素維生素B1 在堿性溶液中被鐵氰化鉀氧化成硫色素，在紫（在堿性溶液中被鐵氰化鉀氧化成硫色素，在紫（365nm）照射下呈藍(lán)色熒光（照射下呈藍(lán)色熒光（435nm）通過與對照品熒光強(qiáng)度比較。即可測得供試品）通過與對照品熒光強(qiáng)度比較。即可測得供試品含量（課本含量（課本260頁）頁）熒光分光光度法測定維生素?zé)晒夥止夤舛确y定維生素E 采用同步熒光掃描法測定血清中維生素采用同步熒光掃描法測定血清中維生素E，有效的消除溶劑拉曼，有效的消除溶劑拉曼光譜的干擾，提高靈敏度和準(zhǔn)確性。（課本光譜的干擾，提高靈敏度和準(zhǔn)確性。（課本277頁）頁）時間分辨熒光光譜時間分辨熒光光譜 基于不同發(fā)光體發(fā)光衰減速度不同.壽命不同.在進(jìn)行這種測量時要求帶有時間延遲設(shè)備的脈沖光源和帶有門控時間電路的檢測器件,從而可在固定延遲時間td和門控時間tg,用發(fā)射單色器進(jìn)行掃描.可得到時間分辨發(fā)射光譜。同步掃描 根據(jù)激發(fā)光和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關(guān)系參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)劉文英，藥物分析劉文英，藥物分析.袁觀宇，生物物理學(xué)袁觀宇，生物物理學(xué).李昌厚，紫外分光光度計(jì)李昌厚，紫外分光