蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾

1、 蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定 蛋白質(zhì)分析鑒定是蛋白質(zhì)研究中的一個最基本技術(shù)蛋白質(zhì)分析鑒定是蛋白質(zhì)研究中的一個最基本技術(shù), ,是是確定蛋白質(zhì)產(chǎn)品的是與非的問題確定蛋白質(zhì)產(chǎn)品的是與非的問題, ,尤其是在研究新的蛋白質(zhì)尤其是在研究新的蛋白質(zhì)組分時顯得更重要。研究一個新的蛋白質(zhì)首先要從它的基組分時顯得更重要。研究一個新的蛋白質(zhì)首先要從它的基本性質(zhì)作為突破口，然后根據(jù)它的基本性質(zhì)進(jìn)行分離純化，本性質(zhì)作為突破口，然后根據(jù)它的基本性質(zhì)進(jìn)行分離純化，最終用純品對其進(jìn)行分析鑒定。如果對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)最終用純品對其進(jìn)行分析鑒定。如果對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)尚未搞清楚，工作起來將會困難重重。因此，蛋白質(zhì)研究尚未搞清楚

2、，工作起來將會困難重重。因此，蛋白質(zhì)研究技術(shù)主要是對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)的進(jìn)行分析鑒定。技術(shù)主要是對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)的進(jìn)行分析鑒定。蛋白質(zhì)鑒定的主要參數(shù)蛋白質(zhì)鑒定的主要參數(shù) 蛋白質(zhì)分子是非常復(fù)雜的生物大分子蛋白質(zhì)分子是非常復(fù)雜的生物大分子, ,能代表其特征參能代表其特征參數(shù)很多數(shù)很多. .但在普通實驗室能夠進(jìn)行測定的、最常用的參數(shù)，但在普通實驗室能夠進(jìn)行測定的、最常用的參數(shù)，歸納起來主要有以下幾種。歸納起來主要有以下幾種。(1)(1)蛋白質(zhì)的質(zhì)量鑒定蛋白質(zhì)的質(zhì)量鑒定( (分子量分子量) )(2)(2)蛋白質(zhì)帶電性鑒定（等電點）蛋白質(zhì)帶電性鑒定（等電點）(3)(3)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定( (

3、一、二級結(jié)構(gòu)、晶體、肽譜、一、二級結(jié)構(gòu)、晶體、肽譜、nc-nc-末端末端) )(4)(4)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能鑒定蛋白質(zhì)生物學(xué)功能鑒定( (生物活性、比活、酶促動力學(xué)生物活性、比活、酶促動力學(xué)) )( (5)5)免疫學(xué)鑒定（抗原免疫學(xué)鑒定（抗原- -抗體反應(yīng)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)）抗體反應(yīng)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)） 意義意義n 確定分子大小n 從氨基酸組成分析的結(jié)果求得準(zhǔn)確的氨基酸組成n 驗證已測定的一級結(jié)構(gòu)是否正確常用測定分子量的方法常用測定分子量的方法n sds-pagen 凝膠過濾層析n 質(zhì)譜n 核磁共振 組成組成 該電泳系統(tǒng)由該電泳系統(tǒng)由兩層不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠兩層不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠組成組成上層膠上層膠:

4、 :濃縮膠濃縮膠(stacking or concentration gel)(stacking or concentration gel) 濃濃 度度 2-5%2-5%，緩沖液，緩沖液phph值為值為6.86.8 下層膠：分離膠下層膠：分離膠(seperation or resolving gel)(seperation or resolving gel) 濃濃 度度 5-20%5-20%，緩沖液，緩沖液phph值為值為8.38.3 特點特點 具有很高的分辨力，這是因為它具有以下三種效應(yīng)：具有很高的分辨力，這是因為它具有以下三種效應(yīng)： 樣品濃縮效應(yīng)樣品濃縮效應(yīng) a. a. 分離膠的阻力（孔徑

5、?。?，分離膠的阻力（孔徑小），濃縮作用濃縮作用 b. b. 緩沖液離子成分的不同緩沖液離子成分的不同 （甘氨酸離子（甘氨酸離子 （慢）氯離子（快）（慢）氯離子（快） ，壓縮作用壓縮作用 c .c .濃縮膠與分離膠之間濃縮膠與分離膠之間phph值差值差（分離膠（分離膠phph高，高， 調(diào)節(jié)慢離子的遷移率）調(diào)節(jié)慢離子的遷移率） 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 大分子運動慢，小分子運動快大分子運動慢，小分子運動快 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) 帶電荷多的運動快，帶電荷少的運動慢帶電荷多的運動快，帶電荷少的運動慢電泳儀、電泳儀、 垂直板電泳槽、垂直板電泳槽、 進(jìn)樣器、進(jìn)樣器、 乳頭吸管、乳頭吸管、 50 ml小燒杯小燒杯2

6、. 30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺丙烯酰胺29.2 g， 甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺0.8 g， 加水至加水至100 ml，棕色瓶，棕色瓶4保存。保存。3. 1.5 mol /l tris-hcl分離膠緩沖液分離膠緩沖液ph8.8（4x） 取取18.15 g tris， 用用1m hcl調(diào)調(diào)ph至至 8.8，加水，加水 至至100 ml，4保存保存4. 0.5 mol /l tris-hcl濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液ph6.8 （4x） 取取5.98 g tris，用，用1n hcl調(diào)至調(diào)至ph6.8，加水至，加水至 100 ml，4保存。保存。 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)r-250 2.

7、5 g、 甲醇（可用無水乙醇代替）甲醇（可用無水乙醇代替） 500 ml、70 ml冰乙酸，冰乙酸， 溶解后補(bǔ)足水至總體積溶解后補(bǔ)足水至總體積1000 ml。 甲醇（可用無水乙醇代替）甲醇（可用無水乙醇代替） 300 ml，冰乙酸，冰乙酸70 ml， 補(bǔ)足水至補(bǔ)足水至1000 ml。h2o 2.4 ml，濃縮膠緩沖液，濃縮膠緩沖液1.0 ml、甘油、甘油0.8 ml、10% sds 3.2 ml，b b-硫基乙醇硫基乙醇0.4 ml，0.025%（w/v）溴）溴 酚蘭酚蘭0.2 ml。tetramethylethylenediamine n將分離膠混勻后立即灌注于玻板間隙將分離膠混勻后立即灌注

8、于玻板間隙中，上層小心覆蓋一層正丁醇。將膠中，上層小心覆蓋一層正丁醇。將膠板垂直放于室溫下，待分離膠聚合完板垂直放于室溫下，待分離膠聚合完全后，傾去正丁醇并用濾紙吸干。全后，傾去正丁醇并用濾紙吸干。 取樣品液與等體積樣品緩沖液混合，取樣品液與等體積樣品緩沖液混合，100加熱加熱12分鐘。分鐘。 待濃縮膠聚合完全后，小心移出梳子，然后將膠待濃縮膠聚合完全后，小心移出梳子，然后將膠板固定于電泳裝置上，上下槽各加入電極緩沖液。板固定于電泳裝置上，上下槽各加入電極緩沖液。 用微量進(jìn)樣器加樣。每個樣品孔加入用微量進(jìn)樣器加樣。每個樣品孔加入20ul樣品。樣品。同時加一個標(biāo)準(zhǔn)品。同時加一個標(biāo)準(zhǔn)品。在在100

9、 v的電壓下電泳，當(dāng)樣品全部的電壓下電泳，當(dāng)樣品全部進(jìn)入分離膠時，加大電壓至進(jìn)入分離膠時，加大電壓至100 v，當(dāng)溴，當(dāng)溴酚藍(lán)達(dá)到膠底部，關(guān)閉電源。酚藍(lán)達(dá)到膠底部，關(guān)閉電源。從電泳裝置上卸下玻板，小心橇開玻從電泳裝置上卸下玻板，小心橇開玻板取出凝膠，放入染色液中染色板取出凝膠，放入染色液中染色30 min。移出凝膠放入脫色液中脫色至本底無移出凝膠放入脫色液中脫色至本底無色為止。色為止。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品，大致推測蛋白質(zhì)的分子根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品，大致推測蛋白質(zhì)的分子量。量。 用直尺分別量出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、待測蛋白質(zhì)區(qū)帶中心以及用直尺分別量出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、待測蛋白質(zhì)區(qū)帶中心以及溴酚藍(lán)前沿距分離膠頂端的距離，按下式

10、計算相對遷移率溴酚藍(lán)前沿距分離膠頂端的距離，按下式計算相對遷移率（r r）：）： 相對遷移率相對遷移率 = 樣品遷移距離（樣品遷移距離（cm）/ 指示劑遷移距離（指示劑遷移距離（cm） 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)mmr r的常用對數(shù)（的常用對數(shù)（lg lgmmr r）對）對相對遷移率相對遷移率作圖，作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相對分子量的常用對數(shù)，再換算出其相對分子曲線上查出其相對分子量的常用對數(shù)，再換算出其相對分子量。量。 凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)的原理是根據(jù)蛋

11、白質(zhì)分子量的大小。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠具有特定的蛋的大小。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠具有特定的蛋白質(zhì)分子量范圍，在此范圍內(nèi)，分子量的對數(shù)和洗脫體白質(zhì)分子量范圍，在此范圍內(nèi)，分子量的對數(shù)和洗脫體積之間成線性關(guān)系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質(zhì)積之間成線性關(guān)系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行凝膠層析，以每種蛋白質(zhì)的洗脫體積對它為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行凝膠層析，以每種蛋白質(zhì)的洗脫體積對它們的分子量的對數(shù)作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線。未知蛋們的分子量的對數(shù)作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線。未知蛋白質(zhì)在同樣的條件下進(jìn)行凝膠層析，根據(jù)其所用的洗脫白質(zhì)在同樣的條件下進(jìn)行凝膠層析，根據(jù)其所用的洗脫體積，從標(biāo)準(zhǔn)曲

12、線上可以求出此未知蛋白質(zhì)對應(yīng)的分子體積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可以求出此未知蛋白質(zhì)對應(yīng)的分子量。量。 分離條件溫和分離條件溫和 回收率高回收率高 重復(fù)性好重復(fù)性好 設(shè)備簡單設(shè)備簡單 對樣品的稀釋大對樣品的稀釋大 流速慢流速慢 操作費時操作費時 質(zhì)譜儀是利用電磁學(xué)的原理，使帶電的樣品離子按質(zhì)質(zhì)譜儀是利用電磁學(xué)的原理，使帶電的樣品離子按質(zhì)荷比進(jìn)行分離的裝置。離子電離后經(jīng)過加速進(jìn)入磁場中。荷比進(jìn)行分離的裝置。離子電離后經(jīng)過加速進(jìn)入磁場中。其動能與加速電壓及電荷其動能與加速電壓及電荷z z有關(guān)。有關(guān)。z z：電荷數(shù)：電荷數(shù) zeu=mvzeu=mv2 2/2 e/2 e：電荷：電荷(e = 1.60 x10(e

13、 = 1.60 x10-19-19c)c)u u：加速電壓：加速電壓m m：離子的質(zhì)量：離子的質(zhì)量v v：離子被加速后的運動速度：離子被加速后的運動速度 具有速度具有速度v v的帶電離子進(jìn)入質(zhì)譜儀的電磁場中，根據(jù)所的帶電離子進(jìn)入質(zhì)譜儀的電磁場中，根據(jù)所選擇的分離方式，最終實現(xiàn)各種離子按選擇的分離方式，最終實現(xiàn)各種離子按m/zm/z進(jìn)行分離。進(jìn)行分離。 根據(jù)質(zhì)量分析器的工作原理，可將質(zhì)譜儀分為動態(tài)和靜根據(jù)質(zhì)量分析器的工作原理，可將質(zhì)譜儀分為動態(tài)和靜態(tài)儀器兩大類，靜態(tài)儀器采用穩(wěn)定的電磁場，按空間位置態(tài)儀器兩大類，靜態(tài)儀器采用穩(wěn)定的電磁場，按空間位置來區(qū)別來區(qū)別m/zm/z不同的離子。動態(tài)儀器采用變

14、化的電磁場，按時不同的離子。動態(tài)儀器采用變化的電磁場，按時間不同來區(qū)分間不同來區(qū)分m/zm/z不同的離子。不同的離子。 分離生物大分子多采用電噴質(zhì)譜法，屬于動態(tài)質(zhì)譜儀。分離生物大分子多采用電噴質(zhì)譜法，屬于動態(tài)質(zhì)譜儀?；驹硎巧锎蠓肿釉诤芨叩碾妶鱿码婋x。樣品溶液以基本原理是生物大分子在很高的電場下電離。樣品溶液以很低的流速，在高的電場下使生物分子從毛細(xì)管中流出來。很低的流速，在高的電場下使生物分子從毛細(xì)管中流出來。 樣品溶液以很低的流速樣品溶液以很低的流速(1-20l/(1-20l/分鐘分鐘) )從毛細(xì)管中流出來。從毛細(xì)管中流出來。在毛細(xì)管的柱頭上施加一個高電壓在毛細(xì)管的柱頭上施加一個高電壓

15、(1-5kv)(1-5kv)，使柱頭液體霧化，使柱頭液體霧化成很細(xì)的帶電液滴，這種帶電液滴在逆向干燥氣流中揮發(fā)，使成很細(xì)的帶電液滴，這種帶電液滴在逆向干燥氣流中揮發(fā)，使液滴表面電荷密度增大。直到產(chǎn)生的庫侖斥力與液滴表面張力液滴表面電荷密度增大。直到產(chǎn)生的庫侖斥力與液滴表面張力的雷利極限值相等時，液滴就會發(fā)生爆裂，形成更小的子液滴，的雷利極限值相等時，液滴就會發(fā)生爆裂，形成更小的子液滴，這些子液滴又被蒸發(fā)，又會形成爆裂。如此循環(huán)下去，直到液這些子液滴又被蒸發(fā)，又會形成爆裂。如此循環(huán)下去，直到液滴變得非常小，它的表面的電荷密度變得非常大，形成很強(qiáng)的滴變得非常小，它的表面的電荷密度變得非常大，形成很

16、強(qiáng)的電場，并從液滴中解離出帶多電荷的分子離子。這些離子是靠電場，并從液滴中解離出帶多電荷的分子離子。這些離子是靠吸附上或丟失若干質(zhì)子而形成的，所以正離子或負(fù)離子譜上會吸附上或丟失若干質(zhì)子而形成的，所以正離子或負(fù)離子譜上會觀察到譜峰。生物大分子在觀察到譜峰。生物大分子在esiesi譜上往往是一組帶不同的電荷譜上往往是一組帶不同的電荷的分子離子峰。的分子離子峰。 核磁共振波譜核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy, (nuclear magnetic resonance spectroscopy, nmr).nmr).是將具有磁矩的核放入磁場后

17、，用適宜的頻率的電磁波照射，是將具有磁矩的核放入磁場后，用適宜的頻率的電磁波照射，它們就會吸收能量，發(fā)生原子核能級的躍遷，同時產(chǎn)生核磁共振信它們就會吸收能量，發(fā)生原子核能級的躍遷，同時產(chǎn)生核磁共振信號，得到核磁共振波譜。在有機(jī)化合物中，經(jīng)常用于號，得到核磁共振波譜。在有機(jī)化合物中，經(jīng)常用于1 1h h和和1313c c核的共核的共振吸收波譜。在生物學(xué)方面主要研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和分子量。振吸收波譜。在生物學(xué)方面主要研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和分子量。到目前為止，采用到目前為止，采用1 1h 2d-nmrh 2d-nmr（二維（二維nmrnmr）能解決的最大蛋白質(zhì)分子）能解決的最大蛋白質(zhì)分子量在量在1

18、0000da10000da左右。如果采用雜核多維左右。如果采用雜核多維nmrnmr技術(shù)，能解決的最大蛋白技術(shù)，能解決的最大蛋白質(zhì)分子量大在質(zhì)分子量大在25000da25000da左右。左右。方法方法機(jī)理機(jī)理分子量計算分子量計算關(guān)鍵技術(shù)關(guān)鍵技術(shù)特點特點電泳電泳分子表面電荷分子表面電荷電泳條帶電泳條帶(mr)sds包裹包裹單鏈分子單鏈分子層析層析分子質(zhì)量分子質(zhì)量層析峰的位置層析峰的位置介質(zhì)交聯(lián)度介質(zhì)交聯(lián)度球形分子球形分子質(zhì)譜質(zhì)譜質(zhì)荷比質(zhì)荷比質(zhì)譜峰直接標(biāo)識質(zhì)譜峰直接標(biāo)識樣品質(zhì)子化樣品質(zhì)子化整體分子整體分子核磁核磁核磁共振波譜核磁共振波譜核磁譜線計算核磁譜線計算磁場能量磁場能量整體分子整體分子改變蛋白

19、質(zhì)的藥代動力學(xué)改變蛋白質(zhì)的藥代動力學(xué)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以及活性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以及活性改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象2 反應(yīng)條件的選擇反應(yīng)條件的選擇 考慮因素包括考慮因素包括ph、反應(yīng)溫度、反應(yīng)介質(zhì)以、反應(yīng)溫度、反應(yīng)介質(zhì)以及緩沖液組成及緩沖液組成 允許反應(yīng)順利進(jìn)行允許反應(yīng)順利進(jìn)行 不能造成蛋白質(zhì)的不可逆變性不能造成蛋白質(zhì)的不可逆變性 有利于專一性修飾蛋白質(zhì)有利于專一性修飾蛋白質(zhì) 二硝基氟苯法二硝基氟苯法(fdnb,dnfb): 1945年年sanger提出此方法提出此方法.二甲基氨基萘磺酰氯法二甲基氨基萘磺酰氯法,丹磺酰氨基酸具有強(qiáng)烈的黃色熒丹磺酰氨基酸具有強(qiáng)烈的黃色熒光光,靈敏性

20、是靈敏性是dnfb法的法的100倍倍.巰基的氧化還原反應(yīng)可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分巰基的氧化還原反應(yīng)可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、包涵體的復(fù)性、增加蛋白質(zhì)可溶性等。析、包涵體的復(fù)性、增加蛋白質(zhì)可溶性等。figure inclusion bodies expressed in e.coli.peg是由乙二醇單體聚合而成的線性高分子材料,分子組成為ho-ch2-ch2-(o-ch2-ch2-o)n-ch2-ch2-oh; peg鏈還可以與馬來酸酐進(jìn)一步共聚形成梳狀的peg衍生物,簡稱pm。 peg分子中存在的大量乙氧基能夠與水形成氫鍵,使peg具有良好的水溶性;分子末端剩余的羥基通過適當(dāng)方式活化后可與各類

21、蛋白分子相偶聯(lián)。 由于由于peg無毒無毒,具有良好生物相容性和血液相容性具有良好生物相容性和血液相容性,使它成為一種被廣泛使用的生物修飾材料。對于各種使它成為一種被廣泛使用的生物修飾材料。對于各種具有藥用潛能的蛋白來說具有藥用潛能的蛋白來說,采用采用peg修飾的目的主要有修飾的目的主要有以下三個方面以下三個方面:(1)增加穩(wěn)定性增加穩(wěn)定性,延長血漿半衰期延長血漿半衰期;(2)降低降低免疫原性和抗原性免疫原性和抗原性;(3)降低毒副作用。降低毒副作用。1 增加穩(wěn)定性和延長血漿半衰期增加穩(wěn)定性和延長血漿半衰期 一些以注射方式使用的藥用蛋白一些以注射方式使用的藥用蛋白,由于在血液中存留的由于在血液中

22、存留的時間過短時間過短,在很大程度上限制了其正常藥效的發(fā)揮。通過在很大程度上限制了其正常藥效的發(fā)揮。通過peg修飾修飾,一方面增加了分子量一方面增加了分子量,降低了腎臟的排泄速率降低了腎臟的排泄速率;另另一方面一方面,偶聯(lián)的偶聯(lián)的peg鏈在蛋白分子表面產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)鏈在蛋白分子表面產(chǎn)生空間位阻效應(yīng),減減弱了血液中各種水解酶對蛋白的水解作用弱了血液中各種水解酶對蛋白的水解作用,從而有效地延長從而有效地延長了蛋白在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的保留時間。了蛋白在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的保留時間。2降低抗原性和免疫原性降低抗原性和免疫原性 通過通過peg修飾來消除免疫反應(yīng)活性修飾來消除免疫反應(yīng)活性,將異源性蛋白轉(zhuǎn)化將異源性蛋白

23、轉(zhuǎn)化為非免疫原性的藥用蛋白為非免疫原性的藥用蛋白,主要是利用無免疫原性的主要是利用無免疫原性的peg分分子鏈與蛋白表面的基團(tuán)相偶聯(lián)子鏈與蛋白表面的基團(tuán)相偶聯(lián),進(jìn)而在蛋白表面形成一道屏進(jìn)而在蛋白表面形成一道屏障障,將暴露的抗原結(jié)合位點屏蔽起來。分子構(gòu)型獨特的梳狀將暴露的抗原結(jié)合位點屏蔽起來。分子構(gòu)型獨特的梳狀peg具有更強(qiáng)的屏蔽功能具有更強(qiáng)的屏蔽功能,因而在這方面的應(yīng)用更為普遍。因而在這方面的應(yīng)用更為普遍。3降低毒副作用降低毒副作用 通過基因重組技術(shù)獲得的大規(guī)模生產(chǎn)的通過基因重組技術(shù)獲得的大規(guī)模生產(chǎn)的tnf-a a,il-2 和和ifn-g g等是一類很有前途的抗腫瘤新藥。但由于它們的血漿半等是

24、一類很有前途的抗腫瘤新藥。但由于它們的血漿半衰期短衰期短,為達(dá)到顯著的臨床治療效果不得不加大使用劑量為達(dá)到顯著的臨床治療效果不得不加大使用劑量,這就這就常常引起嚴(yán)重的毒副作用。近年來發(fā)現(xiàn)常常引起嚴(yán)重的毒副作用。近年來發(fā)現(xiàn),利用利用peg修飾技術(shù)對修飾技術(shù)對這些蛋白進(jìn)行處理后這些蛋白進(jìn)行處理后,能夠大大增加其血漿穩(wěn)定性能夠大大增加其血漿穩(wěn)定性,降低使用劑降低使用劑量量;或在大的使用劑量下降低毒副作用。近年來或在大的使用劑量下降低毒副作用。近年來,peg修飾已成修飾已成為提高其抗腫瘤效能、降低毒副作用的有效手段。為提高其抗腫瘤效能、降低毒副作用的有效手段。 蛋白藥物的蛋白藥物的peg修飾已卓有成效

25、，國際知名的制藥公修飾已卓有成效，國際知名的制藥公司已經(jīng)或正在積極推進(jìn)蛋白藥物的司已經(jīng)或正在積極推進(jìn)蛋白藥物的peg修飾，修飾，1991年第一年第一種用種用peg修飾的蛋白藥物修飾的蛋白藥物peg-ada被被fda批準(zhǔn)上市，近幾批準(zhǔn)上市，近幾年上市的有年上市的有peg-ifn、peg-g-csf、peg-生長抑素。目生長抑素。目前處于臨床前研究的前處于臨床前研究的peg修飾的蛋白藥物有幾十種，處于修飾的蛋白藥物有幾十種，處于臨床實驗的有：超氧化物歧化酶（即將上市，臨床實驗的有：超氧化物歧化酶（即將上市，enzon公公司）、白介素司）、白介素-2（期，期，chiron公司）、水蛭素（公司）、水蛭

26、素（期，期，basf ag公司）、抗公司）、抗-tnf-a a抗體片段（抗體片段（期，期，pharmacia公司）、牛血紅蛋白（公司）、牛血紅蛋白（期，期，enzon公司）、抗公司）、抗-pdgf抗抗體片段（體片段（期，期，celltech公司）。公司）。 tnf-a a是一種頗有價值的腫瘤治療藥物是一種頗有價值的腫瘤治療藥物, 一方面直接表一方面直接表現(xiàn)為對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用現(xiàn)為對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用;另一方面可激活宿主的抗腫另一方面可激活宿主的抗腫瘤應(yīng)答并選擇性地引起腫瘤組織內(nèi)部的微循環(huán)障礙。但是瘤應(yīng)答并選擇性地引起腫瘤組織內(nèi)部的微循環(huán)障礙。但是, tnf-a a在體內(nèi)的清除速率很快在體

27、內(nèi)的清除速率很快,要產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效果需要產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效果需要非常大的使用劑量要非常大的使用劑量,由此常引發(fā)一系列由此常引發(fā)一系列嚴(yán)重的毒副作用嚴(yán)重的毒副作用,包包括發(fā)熱、組織炎癥和組織損傷括發(fā)熱、組織炎癥和組織損傷,甚至是致命的內(nèi)毒素性休克甚至是致命的內(nèi)毒素性休克樣綜合征。要將其轉(zhuǎn)化為一種有效的抗腫瘤藥物必須有效樣綜合征。要將其轉(zhuǎn)化為一種有效的抗腫瘤藥物必須有效地降低毒副作用地降低毒副作用,peg修飾正是為達(dá)到這一目的。研究表明修飾正是為達(dá)到這一目的。研究表明,利用利用peg 5000對對tnf-a a進(jìn)行化學(xué)修飾進(jìn)行化學(xué)修飾,通過對修飾條件的優(yōu)通過對修飾條件的優(yōu)化處理化處理,不僅能夠有效減少毒副作用不僅能夠有效減少毒副作用,還可提高其抗腫瘤活性。還可提高其抗腫瘤活性。當(dāng)賴氨酸殘基被修飾的程度分別為當(dāng)賴氨酸殘基被修飾的程度分別為29%和和56%時時,其抗腫瘤其抗腫瘤活性分別增加了活性分別增加了4倍和倍和100倍。與天然倍。與天然tnf-a a相比相比,修飾產(chǎn)物修飾產(chǎn)物的分子量明顯增大的分子量明顯增大,延長了藥物的有效作用時間延長了藥物的有效作用時間,降低了毒副降低了毒副作用作用,促進(jìn)了它作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。促進(jìn)了它作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。figure schematic protocol of pegylation of tfn