黃連總生物堿提取工藝的優(yōu)化研究

1、南 陽 理 工 學(xué) 院本科生畢業(yè)論文學(xué) 院（系）： 生物與化學(xué)工程學(xué)院 專 業(yè)： 生物工程 學(xué) 生： 賈建軍 指 導(dǎo) 老 師： 李杰（講師） 完成日期 2014 年 5 月南陽理工學(xué)院本科生畢業(yè)論文黃連總生物堿提取工藝的優(yōu)化研究Study on the Extraction Technology of Total Alkaloid from Coptis Chinensis總 計(jì):畢業(yè)論文24頁表 格: 9個(gè) 插 圖： 11幅南 陽 理 工 學(xué) 院 本 科 畢 業(yè) 論 文黃連總生物堿提取工藝的優(yōu)化研究Study on the Extraction Technology of Total Alk

2、aloid from Coptis Chinensis學(xué) 院： 生物與化學(xué)工程學(xué)院 專 業(yè)： 生物工程 學(xué) 生 姓 名： 賈建軍 學(xué) 號(hào)： 105010540075 指導(dǎo)教師（職稱）： 李杰（講師） 評(píng) 閱 教 師： 完 成 日 期： 2014年5月 南陽理工學(xué)院Nanyang Institute of Technology黃連總生物堿提取工藝的優(yōu)化研究 黃連總生物堿提取工藝的優(yōu)化研究 生物工程專業(yè) 賈建軍摘 要本論文主要對(duì)黃連總生物堿的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究。首先，通過單因素試驗(yàn)研究提取時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度、料液比等因素對(duì)黃連總生物堿得率的影響，然后進(jìn)行析因試驗(yàn)篩選出對(duì)黃連總生物堿得率

3、影響顯著的因子，再通過Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示黃連總生物堿的最佳提取條件為：提取時(shí)間120 min，乙醇濃度60%，提取溫度81，料液比1：41。在最佳提取條件下黃連總生物堿得率可達(dá)73.21mg/g，與預(yù)測(cè)值73.44mg/g一致，證明試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為黃連總生物堿的提取工藝研究提供參考。關(guān)鍵詞黃連總生物堿；提取工藝；響應(yīng)面分析Study on the Extraction Technology of Total Alkaloid from Coptis ChinensisBiological engineering Major Jia JianjunAbs

4、tract: This paper is to optimize the extraction conditions of total alkaloids from Coptis chinensis. First, single factor experiments were done to examine the impact of ethanol concentration, extrating time, extracting temperature, ratio of solid to liquid and other effect on the extraction of Copti

5、s chinensis alkaloids. Then factorial experiments were done to filter out the significant factors. Finally, Box-Behnken experiments were done to optimize the extraction conditions. The optimal extraction conditions of total alkaloids from Coptis chinensis are obtained as follows: ethanol concentrati

6、on 60%,extraction time 120 min,extraction temperature 81 and the material liquid ratio of 1:41. The total coptis alkaloids yield could reach 73.21mg/g under the optimum technological conditions, which is similar with the predicted 73.44 mg/g. It proved that the test results are accurate, reliable an

7、d could provide the reference for the extraction of total alkaloids from Coptis chinensis.Key words: total alkaloid of Coptis Chinensis ;extraction condition; response surface methodologyii黃連總生物堿提取工藝的優(yōu)化研究目 錄 1緒論11.1黃連生物堿的研究現(xiàn)狀11.1.1黃連的自然分布和特性11.1.2黃連的主要化學(xué)成分11.2黃連生物堿的藥理活性11.3黃連生物堿的應(yīng)用現(xiàn)狀21.4黃連生物堿的提取技術(shù)的研

8、究現(xiàn)狀及進(jìn)展41.5總生物堿含量的分析測(cè)定方法51.6響應(yīng)面分析法簡(jiǎn)述51.7本論文的選題依據(jù)及研究?jī)?nèi)容61.7.1本論文的選題依據(jù)61.7.2本論文研究的主要內(nèi)容62黃連總生物堿的提取工藝優(yōu)化研究72.1 材料72.1.1原料72.1.2試劑72.1.3儀器設(shè)備72.2 方法82.2.1黃連總生物堿的提取82.2.2黃連總生物堿的檢測(cè)82.2.3鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制82.2.4黃連總生物堿得率的計(jì)算82.2.5單因素試驗(yàn)92.2.6析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)92.2.7響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)102.2.8最佳工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)102.3 結(jié)果及分析102.3.1鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及結(jié)果102.3.2

9、單因素試驗(yàn)結(jié)果分析112.3.3析因試驗(yàn)及結(jié)果132.3.4響應(yīng)面結(jié)果及分析142.3.5響應(yīng)曲面圖分析162.3.6黃連總生物堿提取工藝最優(yōu)值的預(yù)測(cè)182.3.7最佳工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)193 結(jié)論與展望203.1主要結(jié)論203.2展望20參考文獻(xiàn)22致謝24II黃連總生物堿提取工藝的優(yōu)化研究1 緒論生物堿是一類堿性含氮有機(jī)化合物并廣泛存在于自然界中，普遍含有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通常以鹽或游離態(tài)兩種形式存在，有顯著的抗腫瘤、抗菌、抗過敏、抗炎癥等藥理活性，是一種重要的中草藥有效成分，具有極為重要的藥用價(jià)值和保健功能1。近年來，生物堿類化合物一直成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。1.1 黃連生物堿的研究現(xiàn)狀1.

10、1.1 黃連的自然分布和特性黃連通常是指毛莨科植物味連、雅連或云連的干燥根莖，主要含異喹啉類生物堿，具有瀉火解毒、清熱燥濕的功效，對(duì)胃腸潰瘍也有顯著療效。作為一種常用中藥材，最早的記載見于神農(nóng)本草經(jīng)，因其根莖呈黃色連珠狀，所以稱之為“黃連”，根據(jù)其形狀的不同又可分為味連、云連和雅連，其中味連大多聚集成簇且形狀彎曲似雞爪，習(xí)慣上稱之為“雞爪連”，主產(chǎn)于中國四川、重慶、貴州、湖北、陜西等省，云連多彎曲呈鉤狀，形如“蝎尾”，多為細(xì)小的單枝，主產(chǎn)于中國云南省，雅連多呈微彎曲的圓柱形，形似“蠶狀”的 單枝，主產(chǎn)地為中國四川省2。黃連是一種大宗名貴中藥材，因此具備相當(dāng)?shù)拈_發(fā)潛力，其開發(fā)利用備受關(guān)注。1.1

11、.2 黃連的主要化學(xué)成分黃連的化學(xué)研究表明3、4，其主要藥理成分除異喹啉類生物堿外，還含有木蘭花堿、黃柏酮、黃柏內(nèi)酯、阿魏酸和多種微量元素，其中異喹啉類生物堿主要包括小檗堿、黃連堿、甲基黃連堿、掌葉防己堿、非洲防己堿和藥根堿。季銨型生物堿小檗堿的含量最高，約為8%10%，是其主要成分，具有抗菌、抗腫瘤和抗心律失常等生物活性。其他異喹啉類生物堿，如黃連堿、藥根堿和掌葉防己堿等，也具有降血糖、抗菌、抗腫瘤、保護(hù)胃黏膜等活性。1.2 黃連生物堿的藥理活性（1）抗腫瘤、抗癌作用 黃連生物堿多具有顯著的抗腫瘤和抗癌作用，但由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、作用機(jī)制繁雜且作用位點(diǎn)較多，因而對(duì)某些病癥缺乏選擇性和針對(duì)性，又由

12、于尚不清楚一些生物堿的作用機(jī)制，因此進(jìn)一步分離、純化、篩選生物堿，加強(qiáng)深層次針對(duì)性的病理、藥理和毒性研究，對(duì)于新藥的研發(fā)與應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。試驗(yàn)證明5、6，黃連生物堿具有抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞中環(huán)氧合酶、腫瘤壞死因子、人肝細(xì)胞中激活蛋白酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、活性及食道癌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的作用。（2）抗焦慮作用 Krom hout7等人的一系列實(shí)驗(yàn)證明濃度為40g/ml的黃連丁醇提取物，可阻斷生物合成兒茶酚胺。經(jīng)柱層析分離純化后的提取物，F(xiàn)r和Fr中均含有異喹啉類生物堿，如小檗堿和巴馬汀堿。濃度為40g/ml的Fr能使嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12）細(xì)胞中多巴胺的合成減少77，其半數(shù)抑制量（IC50）為195

13、g/ml。這說明這些異喹啉類生物堿能夠抑制PC12細(xì)胞中的酪氨酸羥化酶活性而阻止兒茶酚胺合成，因此具有抗焦慮作用。（3）抗氧化和自由基清除作用來自于陽光、紫外線、化學(xué)反應(yīng)、物理輻射和新陳代謝的自由基會(huì)引起人機(jī)體的多種病理損害，如細(xì)胞的老化、癌癥的發(fā)生以及動(dòng)脈粥樣硬化、血栓的形成等。黃連生物堿對(duì)小鼠紅細(xì)胞溶血和脂質(zhì)過氧化過程具有顯著的抑制作用，并且具有極強(qiáng)的自由基清除活性。YANG DM8等考察了中國和地中海沿岸20種傳統(tǒng)藥材的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)濃度為100g/ml時(shí)的黃連提取液對(duì)自由基的清除性能高于其它植物。（4）保護(hù)胃粘膜的作用黃連中的黃連堿具有顯著的保護(hù)胃粘膜作用，而所含有的其它異喹啉類生物

14、堿，如黃連素、氧化黃連素、巴馬汀堿則對(duì)胃粘膜損傷不具有保護(hù)作用。韋記青9等人研究表明小檗堿有利于腸道的收縮幅度的增加，黃柏酮?jiǎng)t能使張力和振幅都有所增加，而黃柏內(nèi)酯則使腸管弛緩。黃柏的甲醇提取物對(duì)大鼠胃腸潰瘍具有明顯抑制作用，并且強(qiáng)于小檗堿及黃連堿。（5）抑制堿性磷酸化酶作用鹽酸小檗堿對(duì)堿性磷酸酶的抑制作用與濃度呈正相關(guān)，其在濃度為0.1-6mol/L時(shí)抑制作用較強(qiáng)，此范圍內(nèi)的線性公式為Y=4310X56255（r=0.97）。因此，測(cè)定血液中小檗堿的濃度可根據(jù)小檗堿對(duì)堿性磷酸酶的抑制作用這一原理，同樣這一原理也可用于控制黃連的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 9。1.3黃連生物堿的應(yīng)用現(xiàn)狀由于黃連生物堿的這些生物活性

15、使對(duì)其的研究進(jìn)人了一個(gè)新的階段，不僅促進(jìn)了黃連生物堿類化合物研究、開發(fā)利用，也促使其在醫(yī)藥、化妝品、食品等工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用。（1）黃連生物堿在食品工業(yè)中的應(yīng)用天然甜味劑柚皮苷屬二氫黃連生物堿，經(jīng)過加氫處理可以轉(zhuǎn)變?yōu)槎洳闋柾哂刑鹞?，因此可為糖尿病人食用且不引起血糖的升高，是具有保健作用的良好食品甜味添加劑替代產(chǎn)品。天然抗氧化劑由于黃連生物堿均具有較強(qiáng)的抗氧化能力。其中以巴馬亭的抗氧化效果最為顯著，又由于其具有更多的生理活性，且無毒副作用，因此可以作為抗氧化劑在食品工業(yè)中廣泛的應(yīng)用。天然色素黃連生物堿多呈黃色，同時(shí)又由于其良好的溶解性，既能溶解于水等極性溶劑，又能溶解于多種非極性溶劑，所以

16、可以根據(jù)不同的需要來選擇適宜的黃連生物堿作為食品工業(yè)的著色劑。（2）黃連生物堿在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用隨著分離純化提取技術(shù)的發(fā)展，一些微量黃連生物堿被不斷發(fā)現(xiàn)，生理活性被不斷的研究，開發(fā)了數(shù)種含有黃連生物堿類物質(zhì)的產(chǎn)品。在醫(yī)藥方面，根據(jù)其在抗腫瘤、抗菌、抗癌等方面的藥理作用，很多以黃連生物堿為主要成分的藥物已經(jīng)上市推廣。用于抗癌抗腫瘤藥物以黃連提取物為主要成分的一些藥物在國內(nèi)外先后研制開發(fā)，對(duì)于癌癥腫瘤等疾病均有良好的療效。利用黃連生物堿開發(fā)的藥劑可用于治療各種良性惡性腫瘤的預(yù)防與治療。用于抗菌藥物黃連生物堿均具有明顯的抗菌活性。其中小檗堿具有最大的抑菌活性,黃連堿和巴馬亭堿次之，且對(duì)革蘭氏陽性菌的

17、抑制活性相對(duì)于酵母菌大。因此黃連生物堿廣泛地應(yīng)用于抑制革蘭氏陽性菌的藥物。（3）黃連生物堿類化合物在化妝品行業(yè)中的應(yīng)用醫(yī)學(xué)美容事業(yè)的課題之一便是消除脂褐素(老年斑)。黑色素細(xì)胞的密度和黑色素的量等因素決定了皮膚膚色的深淺，而黑色素的生成與酪氨酸酶活性有直接關(guān)系。所以，抗自由基氧化的同時(shí)抑制酪氨酸酶的活性對(duì)于去斑增白具有重要作用，黃連生物堿恰好適宜，因此廣泛應(yīng)用于美容化妝品中。另外黃連生物堿在化妝品中還可用作天然防曬劑、增白劑、皮膚調(diào)理劑 1、3、10。1.4黃連生物堿的提取技術(shù)的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展生物堿又稱為植物堿，通常是指生物體內(nèi)存在的一類含氮堿性有機(jī)化合物，在植物體內(nèi)通常以游離態(tài)或與無機(jī)酸有機(jī)

18、酸結(jié)合成的鹽的形式存在，所以植物體粉末可以直接用水、稀酸、有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑水溶液等冷浸、滲漉或回流提取生物堿。黃連生物堿的主要提取方法有：稀酸提取技術(shù)、回流提取技術(shù)、超聲波輔助技術(shù)、微波輔助提取技術(shù)等。（1）稀酸提取法稀酸提取法的原理是利用小檗堿的無機(jī)酸鹽溶解度大于其有機(jī)酸鹽和游離態(tài)單體的性質(zhì)，將植物體在硫酸酸化條件下提取。如寧娜11等以黃連須根邊角料為原料，采用冷浸提取、鹽酸鹽析和重結(jié)晶等過程，得到的小檗堿和藥根堿，純度可達(dá)到95以上。胡保平12等研究了提取純化黃連中小檗堿的工藝，詳細(xì)考察了實(shí)驗(yàn)過程所涉及到的各種因素，較為系統(tǒng)完善的優(yōu)化了鹽析法提取純化小檗堿的工藝，為近一步實(shí)現(xiàn)工業(yè)化打下基

19、礎(chǔ)。（2）回流提取法水、乙醇等低沸點(diǎn)提取劑是回流提取常用的提取劑，加熱不但有利于提取而且使提取劑不斷汽化，提取劑經(jīng)冷凝，再回到提取器中繼續(xù)進(jìn)行浸提，直至有效成分回流提取完全。徐蓉20等以乙醇為提取劑回流提取總生物堿，采用紫外分光光度法測(cè)定提取液中總生物堿的含量，并以此優(yōu)化提取工藝，優(yōu)化得到的工藝生物堿的提取效率高，穩(wěn)定性好，總生物堿平均含量為15.06。（3）超聲輔助提取法超聲輔助提取是在溶質(zhì)顆粒與溶劑之間產(chǎn)生聲波空化作用，致使溶液內(nèi)氣泡的形成、膨脹和破裂，從而更加充分的使樣品顆粒分散，增加溶質(zhì)顆粒與溶劑間的接觸面積，提高生物活性成分從固體顆粒轉(zhuǎn)移到液體提取劑的傳質(zhì)速率。如黃羅生13等采用正交

20、設(shè)計(jì)法對(duì)超聲波提取小檗堿進(jìn)行研究，小檗堿得率達(dá)8.38。（4） 微波輔助提取法 微波具有良好的穿透能力，能夠透過細(xì)胞壁直達(dá)植物的腺細(xì)胞和維管束，又由于其較強(qiáng)的加熱作用使細(xì)胞內(nèi)的游離水加熱沸騰，使細(xì)胞內(nèi)部壓力逐漸增大，當(dāng)超過細(xì)胞壁的承受能力，將致使細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)自由流出傳遞至周圍的提取劑中溶解。從而有利于有效成分的浸出。1.5 總生物堿含量的分析測(cè)定方法目前，生物堿的分析檢測(cè)主要包括比色法、碘量法和高效液相色譜法。（1）比色法 間接比色法 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用鹽酸小檗堿，依次加入1ml一定濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，5ml檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.5），2ml溴甲酚綠指示液，搖勻，室溫下靜置10 m

21、in，用分光光度記在最大吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)，一般在416nm處有最大吸收峰14。直接比色法將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液在紫外可見光譜區(qū)進(jìn)行測(cè)定，確定最大吸收波長(zhǎng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定總生物堿含量，最大吸收峰一般為350nm 14。（2）碘量法對(duì)照品采用鹽酸小檗堿，按中國藥典中鹽酸小檗堿項(xiàng)下國標(biāo)方法測(cè)定總生物堿含量，測(cè)定過程應(yīng)注意準(zhǔn)確多次滴定15。（3）高效液相色譜法提取液中的總生物堿含量采用高效液相色譜法測(cè)定時(shí)，通常以鹽酸小檗堿為單一對(duì)照品，也可用一定比例的鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿和鹽酸黃連堿三種物質(zhì)共同作為對(duì)照品16、17、18。以上三類方法中，HPLC法較為精確，但對(duì)提取物的純度有較高的要求。黃連生物堿因

22、其分子結(jié)構(gòu)的不同，而對(duì)不同波段的光具有不同的吸收度，又因最大吸光值相差不大，所以對(duì)提取物的總生物堿進(jìn)行整體評(píng)價(jià)可用直接測(cè)定法，對(duì)測(cè)種生物堿的具體結(jié)構(gòu)可采用間接測(cè)定法，測(cè)定方法不同，結(jié)果會(huì)有所差異。因此對(duì)于測(cè)定提取液總生物堿含量，應(yīng)根據(jù)不同目的，選擇恰當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行19。1.6 響應(yīng)面分析法簡(jiǎn)述 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方法(Response Surface Methodology, RSM)這種回歸分析方法可用于研究幾種因素間交互作用。通過一定的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法和試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用響應(yīng)面分析法將多因子試驗(yàn)中因子與指標(biāo)的相互關(guān)系擬合多元二次回歸方程，依此對(duì)函數(shù)的響應(yīng)面和等高線進(jìn)行分析，研究因子與響應(yīng)面之間以及因子與因

23、子之間的相互關(guān)系。其可以在較短的時(shí)間內(nèi)通過少量的試驗(yàn)對(duì)所選的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面研究，通過對(duì)回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法20、21、22。響應(yīng)面分析法可作為最優(yōu)化方法，可將體系的響應(yīng)作為一個(gè)或多個(gè)因素的函數(shù)，以圖像形式將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來，通過直觀觀察來選擇試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)化條件。克服了正交設(shè)計(jì)只能處理離散的水平值，而存在無法對(duì)各因素的連續(xù)作用具體的最優(yōu)值缺陷，且求得的回歸方程的精度高。本研究選擇Minitab15數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)試驗(yàn)安排進(jìn)行設(shè)計(jì)及對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定優(yōu)化后的試驗(yàn)結(jié)果。1.7本論文的選題依據(jù)及研究?jī)?nèi)容1.7.1本論文的選題依據(jù)通過化學(xué)合成的產(chǎn)品

24、有一定的毒副作用，而且在生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生不必要的污染。化學(xué)合成產(chǎn)品在化妝品、醫(yī)藥、食品領(lǐng)域的安全性也越來越備受人們的關(guān)注。由于人們逐漸增強(qiáng)的追求綠色健康、回歸自然的生活的觀念，因此天然產(chǎn)物逐漸受到人們的青睞與厚愛。我國具有豐富的動(dòng)植物資源，從動(dòng)植物中提取的天然生物堿無毒安全,可用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域，這符合人們對(duì)于綠色健康的生活追求，將有很大的應(yīng)用前景。研究表明，黃連根莖含多種生物堿，主要成分為小檗堿，其次為黃連堿、甲基黃連堿、藥根堿、非洲防己堿。也含黃柏酮、黃柏內(nèi)酯、阿魏酸等。生物堿是黃連在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，通常以游離態(tài)或化合態(tài)的形式存在，不僅數(shù)量種類繁多，而且結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜

25、多樣，表現(xiàn)出多種多樣的藥理活性，具有抗炎抑菌、抗氧化、延緩衰老抗腫瘤以及增強(qiáng)免疫能力等藥理作用。近年來，世界上掀起了植物藥開發(fā)的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點(diǎn)倍受青睞，而生物堿類化合物更是以其廣譜的藥理作用備受世人矚目。本題目主要是對(duì)黃連生物堿的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為黃連生物堿的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。1.7.2本論文研究的主要內(nèi)容本文以市售黃連為原料提取生物堿，首先分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考查不同的提取溶劑、提取溶劑濃度、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)、料液比對(duì)黃連總生物堿得率的影響；然后在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行析因試驗(yàn)，篩選出顯著性因子；最后結(jié)合單因素試驗(yàn)和析因試驗(yàn)確定Box-Benhnken

26、響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素與水平22。以黃連總生物堿得率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析及等高線分析對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，在較優(yōu)條件下進(jìn)行提取，以提高黃連總生物堿的提取率，進(jìn)而達(dá)到降低成本改進(jìn)生產(chǎn)工藝的目的，為新藥的開發(fā)提供新的參考資料，為黃連資源的有效利用提供理論依據(jù)。2黃連總生物堿的提取工藝優(yōu)化研究2.1 材料2.1.1原料黃連購自校醫(yī)院，清洗干凈，去除雜質(zhì)，放在烘箱中80進(jìn)行烘干。烘干后在粉碎機(jī)中粉碎放入干燥潔凈的密封袋中，密封保存。2.1.2試劑表 2-1主要試劑Table 2-1 Main reagents 材料與試劑級(jí)別產(chǎn)地氫氧化鈉分析純天津化學(xué)試劑廠甲醇分析純天津化學(xué)試劑廠乙

27、酸乙酯AR天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司正丁醇AR天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司濃硫酸AR天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司濃鹽酸AR天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司無水乙醇分析純天津化學(xué)試劑廠蒸餾水實(shí)驗(yàn)室自制2.1.3 儀器設(shè)備表 2-2 試驗(yàn)儀器Table 2-2 Experimental instrument名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家電子天平BS-210S北京塞多利斯天平有限公司自動(dòng)純水蒸餾器SZ-96上海亞榮生化儀器廠電熱恒溫干燥箱CS101-A北京市永光明醫(yī)療儀器廠循環(huán)水式多用真空泵SHB-鄭州杜甫儀器廠可見光分光光度計(jì)UV-l100上海精密儀器廠恒溫水浴鍋HH-S鞏義設(shè)備有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-

28、52 AAB上海亞榮生化儀器廠雙人單面凈化工作臺(tái)SW-CJ-1CU蘇州凈化設(shè)備有限公司恒溫振蕩器PYX-DHS-50X65-S上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠2.2 方法2.2.1黃連總生物堿的提取黃連生物堿溶解性因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)的不同有很大差異，一般游離態(tài)緩溶于冷水（1:20）和冷乙醇（1:100），在熱乙醇和熱水中溶解度較大，難溶或不溶于氯仿、丙酮、乙醚和苯等有機(jī)溶劑。其鹽在冷水中溶解度較小，例如：鹽酸鹽微溶于冷水（1:500）、硫酸鹽緩溶于冷水（1:100），但在熱水和熱乙醇中溶解度較大。考慮到乙醇更易濃縮且對(duì)黃連生物堿溶解性合適，因此選擇乙醇加熱恒溫條件下震蕩提取23。2.2.2黃連總生物堿的檢測(cè)黃

29、連生物堿均屬異喹啉類季胺堿，其分子內(nèi)含有相同的基團(tuán)使各種黃連生物堿在350nm的紫外光下均有最大吸收峰，因此可以根據(jù)粗提取液在350nm下吸光度的不同對(duì)照鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定浸提液中總生物堿的濃度，進(jìn)而計(jì)算出黃連總生物堿的得率20。2.2.3 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取102干燥至恒重的鹽酸小檗堿對(duì)照品2.81mg，于50mL容量瓶中以蒸餾水搖勻定容，得濃度為0.056 2 mg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。分別吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液0，0. 4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.4，2.8，3.2，3.6mL于10 mL量瓶中，以0.05 moL/L 硫酸水溶液定容至刻

30、度，350nm測(cè)吸光度值。以溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得回歸方程y=0.0653x+0.0856 r=0.998（n=10），線性范圍2.248-20.232 ug/mL20。2.2.4黃連總生物堿得率的計(jì)算 根據(jù)黃連總生物堿含量標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的回歸方程y=0.0653x+0.0856 ，計(jì)算提取液中的黃連總生物堿含量。黃連總生物堿得率計(jì)算公式如下：t= t提取液中的黃連總生物堿含量（mg）y黃連總生物堿測(cè)定中提取物的吸光度v黃連提取液的體積(mL)Y=Y黃連總生物堿得率（mg/g)t提取液中黃連總生物堿含量（mg）m黃連粉末的質(zhì)量（g）2.2.5 單因素試驗(yàn)（1）不同提取溶劑對(duì)黃連總

31、生物堿得率的影響分別準(zhǔn)確稱取1.0g經(jīng)過預(yù)處理的黃連粉末，控制料液比為1：30，提取溫度70，提取時(shí)間1h，,提取1次，在不同的提取劑（蒸餾水，甲醇，70%乙醇，乙酸乙酯和正丁醇）條件下提取，測(cè)定提取液吸光值，并計(jì)算黃連總生物堿得率。（2）乙醇濃度對(duì)黃連總生物堿得率的影響分別準(zhǔn)確稱取1.0g經(jīng)過預(yù)處理的黃連粉末，控制料液比1：30，提取時(shí)間1h，提取溫度70，提取1次，不同乙醇濃度(50%，60%，70%，80%和90%)的條件下提取，測(cè)定提取液吸光值，并計(jì)算黃連總生物堿得率。（3）料液比對(duì)黃連總生物堿得率的影響分別準(zhǔn)確稱取1.0g經(jīng)過預(yù)處理的黃連粉末，控制提取溫度70，提取時(shí)間1 h，乙醇濃

32、度70%，提取1次，不同料液比(1：10，l：20，l：30，1：40和1：50)條件下提取，測(cè)定提取液吸光值，并計(jì)算黃連生物堿得率。（4）提取溫度對(duì)黃連總生物堿得率的影響分別準(zhǔn)確稱取1.0g經(jīng)過預(yù)處理的黃連粉末，控制料液比1：30，提取時(shí)間為1h，乙醇濃度為70%，提取1次，在不同提取溫度(65，70，75，80和85)條件下提取，測(cè)定提取液吸光值，并計(jì)算黃連總生物堿得率。（5）提取時(shí)間對(duì)黃連總生物堿得率的影響分別準(zhǔn)確稱取1.0g經(jīng)過預(yù)處理的黃連粉末，控制提取溫度為70 ，料液比為1：30，乙醇濃度為70%，提取1次，不同提取時(shí)間(40，60，80，100和120min)條件下提取，測(cè)定提取

33、液吸光值，并計(jì)算黃連總生物堿得率。（6）提取次數(shù)對(duì)黃連總生物堿得率的影響分別準(zhǔn)確稱取1.0g經(jīng)過預(yù)處理的黃連粉末，控制料液比為1：30，提取時(shí)間為1h，提取溫度70，乙醇濃度為70%，不同提取次數(shù)（1次，2次和3次）的條件下提取，提取液吸光值，并計(jì)算黃連總生物堿得率。2.2.6 析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)析因試驗(yàn)是一種將兩個(gè)或多個(gè)因素的不同水平交叉分組進(jìn)行試驗(yàn)，以期檢驗(yàn)各因素內(nèi)部不同水平間或因素間是否存在交互作用及其顯著性的設(shè)計(jì)方法。若因素間存在交互作用，則一個(gè)因素的變化將會(huì)引起具有交互作用的其他因素的變化。依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定乙醇為提取溶劑，利用Minitab 15軟件試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的Plaekett-

34、Burman設(shè)計(jì)，來篩選主要因素。Plackett-Burman設(shè)計(jì)方法通過對(duì)每個(gè)因子取兩水平來進(jìn)行分析，它可用最少的試驗(yàn)次數(shù)達(dá)到使因素的主效應(yīng)盡可能精確的估計(jì)，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出重要因子供進(jìn)一步研究。其中1取每個(gè)因素里最高響應(yīng)值Y(得率)所對(duì)應(yīng)的水平，-1則取每個(gè)因素里最低響應(yīng)值Y所對(duì)應(yīng)的水平24。因素水平如表2-3所示：表2-3析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子及編碼值Table2-3 Analyzes the factor of design and coding value因素編碼值A(chǔ)提取溫度 B料液比 C 提取時(shí)間 D 乙醇濃度 -1 65 1:10(g/ml) 40min 80

35、%1 80 1:50(g/ml) 120min 60%2.2.7 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)和析因試驗(yàn)結(jié)果，以黃連總生物堿得率為響應(yīng)值，選取提取時(shí)間、料液比、提取溫度為自變量，并在每個(gè)因素中最大提取率區(qū)域選取合適的水平，運(yùn)用Minitab 15軟件進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，3個(gè)為零點(diǎn)，重復(fù)三次零點(diǎn)，用以計(jì)算試驗(yàn)誤差25。因素的水平設(shè)計(jì)見表2-4（1、0、-1依次表示自變量中的高、中、低三水平）。 表2-4 響應(yīng)面法的因素和水平Table2-4 The factors and levels of response surface

36、 methodology 因素 水平 Level Factor -1 0 1A 料液比(%) 1:30 1:40 1:50B 提取時(shí)間(min) 80 100 120C 提取溫度() 75 80 852.2.8 最佳工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)利用Minitab 15的響應(yīng)優(yōu)化器進(jìn)行分析，求取在模型預(yù)測(cè)穩(wěn)定狀態(tài)下黃連總生物堿的最優(yōu)提取條件。為了驗(yàn)證最優(yōu)值的可靠性，進(jìn)行最佳工藝條件的驗(yàn)證試驗(yàn)。由于試驗(yàn)條件有限和方便試驗(yàn)操作，將最優(yōu)條件進(jìn)行取整數(shù)后，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得提取率后取平均值。通過實(shí)測(cè)平均值與預(yù)測(cè)值間的比較，證明預(yù)測(cè)是否準(zhǔn)確可靠，具有應(yīng)用價(jià)值。2.3 結(jié)果及分析2.3.1 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪

37、制及結(jié)果圖2-1 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2-1 The standard curve of berberine hydrochloride2.3.2單因素試驗(yàn)結(jié)果分析（1）不同提取溶劑對(duì)黃連總生物堿得率的影響圖2-2 不同提取溶劑對(duì)黃連總生物堿得率的影響Fig.2-2 Effect of different extraction solvent on the yield of totalalkaloids from Rhizoma Coptidis由圖2-2可以看出浸提效果最好的是甲醇，其次是蒸餾水，70%乙醇的浸提效果略低于蒸餾水，乙酸乙酯和正丁醇

38、的浸提效果比較差，綜合考慮提取劑的毒性、經(jīng)濟(jì)性及沸點(diǎn)，選擇一定的乙醇水溶液為浸提劑。（2）乙醇濃度對(duì)黃連總生物堿得率的影響圖2-3乙醇濃度對(duì)黃連總生物堿得率的影響Fig.2-3 Effects of ethanol concentration on yield of total alkaloids from Rhizoma Coptidis由圖2-3可知，在一定條件下，隨著乙醇濃度的增大，黃連總生物堿的得率也隨之增加，達(dá)到最高的乙醇濃度為60%，之后又出現(xiàn)下降。其原因是乙醇的濃度增大，黃連生物堿類浸出率相應(yīng)增大，而此時(shí)有機(jī)雜質(zhì)也更易浸出，使提取液濃度不斷增大，不利于黃連生物堿的浸出，

39、因此選擇最優(yōu)乙醇濃度為60%。（3）料液比對(duì)黃連總生物堿得率的影響圖2-4 料液比對(duì)黃連總生物堿得率的影響Fig.2-4 The effect of ratio of solid to liquid on yield of total alkaloids from Rhizoma Coptidis 由圖2-4可知：增大料液比，黃連總生物堿得率逐漸增大，當(dāng)料液比達(dá)1:40（g/ml）后再增大料液比，總生物堿得率上升緩慢。其原因是樣品量一定時(shí),增加溶劑的量可以有效擴(kuò)大物料顆粒與提取液間溶質(zhì)的濃度差，有利于生物堿由固相原料向浸提液的擴(kuò)散，有利于有效成分的溶出；但料液比過大得率上升不明顯，不僅造成提取

40、劑的浪費(fèi)也影響濃縮過程的進(jìn)行，因此取料液比在1:50（g/ml）左右為宜。（4）提取溫度對(duì)黃連總生物堿得率的影響圖2-5提取溫度對(duì)黃連總生物堿得率的影響Fig.2-5The effect of extraction temperature on yield of total alkaloids from Rhizoma Coptidis由圖2-5可知：溫度的升高，有利于黃連總生物堿得率的提高。這是因?yàn)樯邷囟热苜|(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度加快，提取液的擴(kuò)散系數(shù)增加，促進(jìn)了有效成分的浸出。然而，當(dāng)溫度超過80，再升高溫度，黃連總生物堿得率明顯下降，過高的溫度會(huì)使生物堿變性，且提取劑揮發(fā)加快，從而導(dǎo)致生物堿得率

41、下降，因此選擇提取溫度為80。（5）提取時(shí)間對(duì)黃連總生物堿得率的影響圖2-6 提取時(shí)間對(duì)黃連總生物堿得率的影響Fig.2-6 The effect of extraction time on yield of total alkaloids from Rhizoma Coptidis由圖2-6可知：提取時(shí)間在40min到120min內(nèi)，黃連總生物堿得率逐漸上升，然后逐漸趨于穩(wěn)定。出現(xiàn)這種情況，可能是因?yàn)閷?duì)于一定量的提取溶劑所能溶解的生物堿的量有限，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)溶液中生物堿的量逐漸增加，當(dāng)溶液中的生物堿的量已經(jīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，將不再溶出。所以提取時(shí)間選擇在120min左右為宜。（6）提取次數(shù)對(duì)

42、黃連總生物堿得率的影響 圖2-7 提取次數(shù)對(duì)黃連總生物堿得率的影響Fig .2-7 The effect of extraction times on yield of total alkaloids from Rhizoma Coptidis由圖2-7可知：黃連總生物堿得率隨著提取次數(shù)的增加而增加，但當(dāng)提取次數(shù)大于兩次后，總生物堿得率增加幅度較小，且以第一次浸提后的得率值相當(dāng)于第三次浸提后的得率的89.38%，從節(jié)約成本、操作時(shí)間及提高提取率的角度綜合考慮，選擇一次浸提 26。2.3.3 析因試驗(yàn)及結(jié)果根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)為4因素2水平，由Plackett-Burman設(shè)計(jì)方

43、案所得的試驗(yàn)結(jié)果見表2-5，各因素的方差分析見表2-6。析因試驗(yàn)的各因素的方差分析見表2-6，當(dāng)P<0.05說明考查因素有顯著影響，當(dāng)P<0.01說明考查因素有極顯著的影響。從方差分析表中可以看出，料液比、提取溫度、提取時(shí)間三因素為顯著性影響因子，其中料液比為極顯著影響因子，而乙醇濃度影響不顯著，故選擇料液比、提取溫度、提取時(shí)間這3個(gè)因素作為主要因素作進(jìn)一步的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以確定這些因素所對(duì)應(yīng)的最優(yōu)水平27。乙醇濃度依據(jù)效應(yīng)分析和節(jié)約成本的原則，將其控制在較好水平上進(jìn)行試驗(yàn)，即60%。 表 2-5 N=4的析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Table2-5 Analyzes the facto

44、r of experimental design and response value (N=4)試驗(yàn)號(hào)A提取溫度B料液比C提取時(shí)間D乙醇濃度得率Y（mg/g）11-11-145.94211-1146.313-111-146.2041-11145.96511-1146.326111-146.797-111146.588-1-11145.779-1-1-1145.59101-1-1-145.7111-11-1-146.0112-1-1-1-145.66表 2-6 各因素的方差分析表Table2-6 Variance analysis of factors項(xiàng) 效應(yīng) 系數(shù) 系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤 T P常量 1

45、.07475 0.04199 25.59 0.000A 0.20017 0.10008 0.04199 2.38 0.049B 0.59683 0.29842 0.04199 7.11 0.000 C 0.27350 0.13675 0.04199 3.26 0.014D 0.27350 0.01725 0.04199 0.41 0.6942.3.4 響應(yīng)面結(jié)果及分析 表2-7 Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果Table2-7 Box-Behnken design and experimental results試驗(yàn)號(hào) A料液比 B提取時(shí)間 C提取溫度 得率Y(mg/g)1 -1 -1 0

46、64.792 1 -1 071.383 -1 1069.024 11070.855 -1 0-1 62.016 10-1 69.177 -10165.858 10167.249 0 -1 -168.1810 01 -169.0611 0 -1167.3112 0 1170.9313 0 0072.6314 0 0072.8515 0 0072.83表2-8回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table2-8 Significance test of regression coefficient項(xiàng) 系數(shù) 系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤 T P常量 72.7700 0.11978 607.508 0.000A 2.1213 0.0

47、7335 28.918 0.000B 1.0250 0.07335 13.974 0.000C 0.3637 0.07335 4.959 0.004A*A -3.2813 0.10797 -30.390 0.000B*B -0.4787 0.10797 -4.434 0.007C*C -3.4212 0.10797 -31.686 0.000A*B -1.1900 0.10374 -11.471 0.000A*C -1.4425 0.10374 -13.905 0.000B*C 0.6850 0.10374 6.603 0.001 “×”表示A、B、C以及D之間的交互作用R-Sq =

48、 99.84% R-Sq（調(diào)整） = 96.24%表2-9 回歸方程的方差分析Table2-9 Anova for regression equation來源 自由度 Seq SS Adj SS Adj MS F P回歸 9 138.377 138.3766 15.3752 357.19 0.000線性 3 45.461 45.4611 15.1537 352.04 0.000平方 3 77.051 77.0509 25.6836 596.67 0.000交互作用 3 15.865 15.8645 5.2882 122.85 0.000殘差誤差 5 0.215 0.2152 0.0430失擬

49、3 0.186 0.1856 0.0619 4.18 0.199純誤差 2 0.030 0.0296 0.0148合計(jì) 14 138.592根據(jù)表2-7結(jié)果可得回歸方程為：Y=72.7700+2.1213X1+1.0250X2+0.3637X3 -3.2813X12-0.4787X22-3.4212X32-1.1900X1X2-1.4425X1X3+0.6850X2X3上式中的Y為黃連總生物堿得率的預(yù)測(cè)值，X1、X2、X3為自變量的編碼值。對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，見表2-9，由表可以看出建立的模型具有較高的決定系數(shù)R2 =0.9624，說明二次回歸方程與試驗(yàn)結(jié)果擬合度較好，誤差較小。對(duì)此方程的回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，可以看出：自變量線性項(xiàng)效果顯著，即料液比（A）、提取時(shí)間（B）和提取溫度(C)能夠顯著的影響黃連生物堿的提取工藝(P<0.05)。失擬表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率，反應(yīng)擬合出來的模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的接近程度。從表2-9可知：模型失擬檢驗(yàn)的P值為0.199，大于0.050，因此，回歸模型擬合較好，不需要對(duì)回歸方程調(diào)整。因此該回歸方程給黃連總生物堿的提取工藝提供了一個(gè)良好的模型28。2.3.5 響應(yīng)曲面圖分析通過令一些因素水平值為定值，只考慮其中兩個(gè)因素對(duì)得率的影響，可以更為直觀的了解兩個(gè)因素同時(shí)對(duì)總生物堿得率的影響，得到相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高線圖。通過Minitab