分離科學(xué)---第八章高效毛細(xì)管電泳

1、高效毛細(xì)管電泳(High performance capillary electrophoresis, HPCE) 高效毛細(xì)管電泳是離子或者荷電粒子以電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，在毛細(xì)管中按照其淌度和/或分配系數(shù)不同，實(shí)現(xiàn)高效、快速分離分析的一種電泳新技術(shù)。第八章 高效毛細(xì)管電泳電泳技術(shù)發(fā)展歷程：1937年瑞典科學(xué)家Tiselius首次采用電泳技術(shù)，分離人血清中5種蛋白。1981年Jorgenson用75m內(nèi)徑毛細(xì)管，利用區(qū)帶電泳實(shí)現(xiàn)了正負(fù)離子的分離分析，成為毛細(xì)管電泳技術(shù)的里程碑。1983年，Hjerten發(fā)展了毛細(xì)管凝膠電泳。1984年，Terabe等發(fā)展了膠束電動(dòng)色譜，使中性化合物的CE分離成為可能。

2、1987年，Hjerten提出了毛細(xì)管等電聚焦電泳。 1.1989年出現(xiàn)商品CE儀器，為推廣應(yīng)用起到了促進(jìn)作用。第八章 高效毛細(xì)管電泳人類基因組研究計(jì)劃中發(fā)揮了巨大的作用毛細(xì)管電泳特點(diǎn)分離模式多，轉(zhuǎn)換容易，適用范圍廣。分離效率高。理論塔板數(shù)40萬(wàn)塊/m。速度快。多數(shù)30min，最快幾秒鐘。試劑和樣品消耗少。分離溶劑僅為幾l，進(jìn)樣量nL（10-9L）級(jí)。成本低，操作簡(jiǎn)便，環(huán)境污染小。應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛。在生命科學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、中藥分析、食品化學(xué)、環(huán)境化學(xué)和法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都得到廣泛的應(yīng)用。第八章 高效毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳基本原理預(yù)備知識(shí)：雙電層和Zeta電勢(shì)雙電層 由界面化學(xué)可知，固體與液體接觸時(shí)，固

3、體表面分子離解或者（和）表面吸附溶液中的離子，在表面形成雙電層。第八章 高效毛細(xì)管電泳-吸附層（緊密層）雙電層模型和相應(yīng)的電勢(shì)分布擴(kuò)散層 0為表面電勢(shì)，緊密層中電勢(shì)線性下降至d。剪切面上的電位稱為Zeta電勢(shì)（），略低于d，一般認(rèn)為與d相等。表面吸附了非離子表面活性劑或大分子后，剪切面外移，與d差別變大，甚至?xí)淖兎?hào)。第八章 高效毛細(xì)管電泳dd0 xV 當(dāng)d衰減到原來(lái)的1/e時(shí)，離緊密層的距離定義為擴(kuò)散層的厚度（）。 Zeta電勢(shì)正比于擴(kuò)散層厚度 。毛細(xì)管壁上的Zeta電勢(shì)為： ew4e為溶液中每單位面積總的過(guò)剩電荷，為介質(zhì)的介電常數(shù)。第八章 高效毛細(xì)管電泳 帶電粒子在其有效半徑所組成的面存

4、在Zeta電勢(shì)：rqe/ 擴(kuò)散層的厚度與電解質(zhì)的濃度有關(guān)，確切地說(shuō)與離子強(qiáng)度有關(guān)。對(duì)于二元電解質(zhì)，近似有：cmZC12/17103第八章 高效毛細(xì)管電泳電泳（Electrophoresis） 在半導(dǎo)電流體中，帶電粒子在外加電場(chǎng)作用下的泳動(dòng)現(xiàn)象叫電泳。帶電粒子的移動(dòng)速度可以表示為：Eve6Eve4球形粒子： 棒狀粒子： 第八章 高效毛細(xì)管電泳影響電泳速度的因素：u 電場(chǎng)強(qiáng)度Eu 介質(zhì)特性（介電常數(shù)和粘度）u 粒子的有效電荷u 粒子大小和形狀因此，荷質(zhì)比差異是電泳分離的基礎(chǔ)。第八章 高效毛細(xì)管電泳淌度（Mobility, ） 因?yàn)殡娪舅俣扰c外加電場(chǎng)強(qiáng)度有關(guān)，所以，在電泳中常用淌度而不用速度來(lái)表示帶

5、電粒子的電泳行為和特性。 Evap絕對(duì)淌度（absolute mobility,mab） 無(wú)限稀釋條件下單位電場(chǎng)強(qiáng)度下離子的平均遷移速度。它是該離子在一定溶液中的一個(gè)特征物理常數(shù)。在手冊(cè)中可以查到一些離子的絕對(duì)淌度。第八章 高效毛細(xì)管電泳有效淌度（effective mobility,ef） 有效淌度是實(shí)驗(yàn)測(cè)出的離子淌度，它是所有產(chǎn)物的離解度（i）和分子的第i離子形式的絕對(duì)淌度乘積之總和：iiiefef取決于許多因素，包括離子半徑，溶劑化作用，介電常數(shù)，溶劑粘度，離子形狀、電荷、pH、離解度和溫度等。 第八章 高效毛細(xì)管電泳電滲流（Electroosmotic flow, EOF） 在毛細(xì)管中

6、，電滲流指的是體相溶液在外加電場(chǎng)下整體朝一個(gè)方向運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。塞子流層流AB（A）EOF不存在流速場(chǎng)，無(wú)展寬；（B）HPLC存在流速場(chǎng)，展寬大。第八章 高效毛細(xì)管電泳電滲流在CE中的意義p 將正、負(fù)離子和中性分子一起朝一個(gè)方向產(chǎn)生差速遷移p 通過(guò)EOF的大小和方向的控制，還可以影響CE 的分離效率，選擇性和分離度p EOF的細(xì)微變化會(huì)影響CE分離的重現(xiàn)性（遷移時(shí)間和峰面積）。 第八章 高效毛細(xì)管電泳EOF速度的大小與毛細(xì)管管壁的Zeta電勢(shì)有關(guān)： Evweo0Eveoeo式中為0真空介電常數(shù)。 類似于電泳，常用電滲流系數(shù)或電滲淌度來(lái)表示EOF大?。旱诎苏?高效毛細(xì)管電泳影響電滲流的因素主要有：l

7、 電場(chǎng)強(qiáng)度El 毛細(xì)管材料l 溶液的pHl 電解質(zhì)溶液的成分和濃度l 添加劑l 溫度 第八章 高效毛細(xì)管電泳eoEeo E關(guān)系曲線電場(chǎng)的影響第八章 高效毛細(xì)管電泳EOF和pH的關(guān)系曲線 毛細(xì)管材料以及pH的影響 eopH3456710-4cm2V-1s-142玻璃石英聚四氟乙烯第八章 高效毛細(xì)管電泳電解質(zhì)溶液的成分和濃度eoB4O72-Cit3-Ac-PO43-HCO3-電流（電流（ A）137.4246.574.5162.069.0（10-5cm2V-1s-1）41.247.749.049.751.8 相同濃度的不同的電解質(zhì)，溶液的介電常數(shù)、離子強(qiáng)度以及粘度不同； 同一緩沖液，濃度增大、離子

8、強(qiáng)度增加，雙電層變薄，Zeta電勢(shì)下降，因此EOF變小。50mmol/L鈉鹽緩沖液中測(cè)得的電流和電滲淌度（pH8.0）第八章 高效毛細(xì)管電泳添加劑對(duì)EOF的影響n 中性鹽（K2SO4），雙電層變薄，EOF降低；n 兩性離子（四甲基氯化銨）增加溶液粘度，降低pH，EOF降低；n 有機(jī)溶劑甲醇、乙腈等降低離子強(qiáng)度（有利于提高Zeta電勢(shì)）、粘度。但通過(guò)氫鍵或偶極作用于管壁，改變表面電荷，這些共同作用的結(jié)果一般使EOF變小。n 表面活性劑，顯著改變毛細(xì)管內(nèi)壁的電荷特性。當(dāng)表面活性劑的濃度超過(guò)臨界膠束濃度以后，將形成膠束，這個(gè)時(shí)候CE的分離機(jī)理會(huì)發(fā)生變化。第八章 高效毛細(xì)管電泳eo3456110-4c

9、m2V-1s-15020-51231. 癸烷基三甲基溴化銨；2. 十二烷基三甲基溴化銨3. 十四烷基三甲基溴化銨濃度（mmol/L）陽(yáng)離子表面活性劑濃度對(duì)eo的影響（pH9.1） 第八章 高效毛細(xì)管電泳溫度對(duì)EOF的影響 溫度對(duì)EOF的影響是線性的。EOF隨溫度的變化主要是溫度影響粘度變化的結(jié)果。溫度升高時(shí)，溶液粘度下降，因此EOF變大。 由于焦耳熱的存在，毛細(xì)管內(nèi)溶液的溫度會(huì)發(fā)生變化引起柱效下降，以及分離時(shí)間重現(xiàn)性較差，因此，良好的散熱是非常必要的。一般有空氣冷卻和液體冷卻兩種方式。第八章 高效毛細(xì)管電泳調(diào)控EOF的方法：p 改變緩沖液成分和濃度p 改變pHp 加入添加劑p 毛細(xì)管內(nèi)壁改性（

10、物理或化學(xué)方法涂層及動(dòng)態(tài)去活）p 改變溫度p 外加徑向電場(chǎng)（改變管壁的Zeta電勢(shì)）第八章 高效毛細(xì)管電泳溶質(zhì)有效遷移速度和表觀淌度 在CE中由實(shí)驗(yàn)決定的實(shí)際的離子遷移速度，稱為有效遷移速度（vef）：meftlvVLtlmEEvvvapeoefeoefap)(ap稱為表觀淌度（apparent mobility），或者凈淌度（net mobility）。 第八章 高效毛細(xì)管電泳分離效率和分離度理論塔板數(shù) Giddings方程定義為：22lN 縱向擴(kuò)散是區(qū)帶展寬的最主要因素mDt22VlLEltapapmDLVlNap2)(2eoefDLVlNn 使用高電場(chǎng)n EOF速度快n 擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)

11、第八章 高效毛細(xì)管電泳分離度 2/1)(24)(4)(4DLVlNvvNReoefefapefs 外加電壓（V）； 有效長(zhǎng)度和總長(zhǎng)度之比（l/L）； 電泳有效淌度差（ef）； EOF淌度（eo）。 第八章 高效毛細(xì)管電泳區(qū)帶增寬的因素（1）擴(kuò)散 徑向擴(kuò)散影響小，縱向擴(kuò)散影響大（2）進(jìn)樣1222injinjWminjDtW2（3）溫度效應(yīng) 焦耳熱散時(shí)形成徑向溫度梯度22ECLrVIGb為當(dāng)量電導(dǎo)第八章 高效毛細(xì)管電泳由焦耳熱引起的分散系數(shù)可表示為：dTdDkrEDbj222623072一般情況下，如果滿足下述方程，那么焦耳熱熱就不會(huì)引起太嚴(yán)重的譜帶展寬Ed(c)1/39但是極端pH下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)

12、變化甚至水解。 l 加入中性鹽，抑制靜電吸附作用，但焦耳熱大l 加入兩性離子化合物如(CH3)3N+CH2CH2CH2SO3-抑制蛋白質(zhì)吸附l 毛細(xì)管內(nèi)壁涂層 動(dòng)態(tài)或者靜態(tài)地對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行涂層處理 抑制吸附的方法在一定程度上會(huì)影響EOF，實(shí)際樣品分析中，應(yīng)該根據(jù)具體情況綜合考慮。 第八章 高效毛細(xì)管電泳（5）電分散 電分散來(lái)源于樣品塞與緩沖溶液之間電場(chǎng)強(qiáng)度的差異。sbbsCCsbbsbsCCEEs樣品b背景電解質(zhì)樣品和背景電解質(zhì)的ef相近電分散小，峰對(duì)稱。 ef比背景電解質(zhì)小很多的溶質(zhì)峰拖尾，ef比背景電解質(zhì)大很多的溶質(zhì)峰向前傾斜。第八章 高效毛細(xì)管電泳（6）檢測(cè)器 峰的寬度或區(qū)帶寬度為時(shí)間

13、寬度（Wt），實(shí)際長(zhǎng)度相等的區(qū)帶產(chǎn)生時(shí)間寬度不等的峰，需校正，否則會(huì)給計(jì)算柱效和定量分析帶來(lái)誤差。mtstlWW檢測(cè)器的空間寬度（Wd）不同，紫外檢測(cè)器幾百微米，電導(dǎo)檢測(cè)器小于50微米，需校正dmtsWtlWW第八章 高效毛細(xì)管電泳（7）其它增寬因素層流兩端緩沖溶液不在一個(gè)水平面上，高度差誘導(dǎo)產(chǎn)生層流。對(duì)于擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)，以及內(nèi)徑大的毛細(xì)管，這種層流的影響非常顯著。a. 場(chǎng)放大CE中的層流效應(yīng)。在場(chǎng)放大CE中，由于電場(chǎng)強(qiáng)度（由緩沖溶液濃度不同引起）的非均勻分布，導(dǎo)致局部EOF速度差異，在濃度界面兩側(cè)產(chǎn)生電滲壓，此壓力差使得在高、低濃度區(qū)域產(chǎn)生層流。第八章 高效毛細(xì)管電泳影響CE分析因素 電泳

14、：pH，緩沖液種類和離子強(qiáng)度，電場(chǎng)強(qiáng)度，溫度，添加劑，有機(jī)溶劑等。 電滲流： pH，緩沖液種類和離子強(qiáng)度，電場(chǎng)強(qiáng)度，溫度，添加劑，有機(jī)溶劑和毛細(xì)管壁的改性等。第八章 高效毛細(xì)管電泳毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE） （capillary zone electrophoresis）原理： 在充滿電解質(zhì)溶液的毛細(xì)管中，荷質(zhì)比大小不同的組分在電場(chǎng)的作用下，按照遷移速度的不同而進(jìn)行分離的。 毛細(xì)管電泳中使用最為廣泛的一種技術(shù)。第八章 高效毛細(xì)管電泳以球形粒子為例6)(6)(6ErqErqEve荷質(zhì)比不同是CZE分離的基礎(chǔ)。樣品分子本身荷質(zhì)比不同（pH調(diào)控）a. 與其他試劑作用后產(chǎn)生荷質(zhì)比差異（配位、形成主客體化

15、合物等）硼酸根-糖；磺化環(huán)糊精-樣品第八章 高效毛細(xì)管電泳CZE分離的調(diào)控因素（1）操作電壓)(2eoefDLVlNVIVopt歐姆定律曲線（最佳電壓的選擇） 第八章 高效毛細(xì)管電泳恒壓-最常用，tm與電壓的倒數(shù)成正比。如果考慮到焦耳熱效應(yīng)，這種函數(shù)關(guān)系不成立。恒電流-理論證明，tm與電流I成正比，在緩沖溶液濃度較大或者散熱差的情況下，使用恒電流操作會(huì)得到較好的結(jié)果。恒功率-嚴(yán)格地講，毛細(xì)管內(nèi)焦耳熱的多少與毛細(xì)管內(nèi)產(chǎn)生的功率成正比，恒功率模式操作可獲得好的重現(xiàn)性。程序改變電壓、電流或功率，從而提高分離度，改善峰形，優(yōu)化分析時(shí)間。第八章 高效毛細(xì)管電泳（2）緩 沖 液緩沖溶液類型-影響溶質(zhì)的流體

16、力學(xué)半徑濃度-離子強(qiáng)度不同，粘度不同I.pH-離解程度不同，電荷不同 pH7.0條件下分離丹?；被釙r(shí)，相同濃度的NaH2PO4比KH2PO4的分離度高，分析時(shí)間短。AB分離glycoformsA ： 乙 酸 鹽0.1mmol/L，Ph4.0；B：乙酸鹽-磷酸鹽，0.1mmol/L，Ph4.0； 第八章 高效毛細(xì)管電泳緩沖液選擇方法：有好的緩沖容量盡可能選擇濃度大而產(chǎn)生電流小緩沖溶液，即分子大而荷電小的緩沖介質(zhì)表觀淌度接近樣品的表觀淌度不影響檢測(cè)a. 常用的緩沖溶液有磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、三羥甲基氨基甲烷（Tris）以及一些兩性有機(jī)離子化合物如2-N-環(huán)己基乙磺酸等。第八章 高效毛細(xì)管電

17、泳（3）添加劑q 控制EOF大小和方向q 抑制吸附q 穩(wěn)定溶質(zhì)的結(jié)構(gòu)如蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)q 增加疏水溶質(zhì)的溶解度a. 擴(kuò)大分離對(duì)象，如添加手性物質(zhì)進(jìn)行手性分離，添加絡(luò)和劑分離中性分子等。第八章 高效毛細(xì)管電泳表面活性劑-濃度低于其臨界膠束濃度，用作助溶劑和離子對(duì)試劑，或壁表面改性劑中性鹽-減弱靜電作用，抑制管壁對(duì)生物大分子的吸附作用，某些鹽如LiCl可穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用兩性離子添加劑-抑制管壁對(duì)生物大分子的吸附作用有機(jī)溶劑-EOF降低、粘度降低、離子強(qiáng)度降低，電導(dǎo)率降低、脂溶性樣品溶解度增加。例如在30%有機(jī)溶劑存在下，SO42-/NO3-的遷移順序會(huì)發(fā)生反轉(zhuǎn)。手性添加劑-環(huán)糊精衍生物、

18、冠醚衍生物進(jìn)行手性物質(zhì)分離尿素等起到助溶和改變分離選擇性的作用。第八章 高效毛細(xì)管電泳（4）溫度溫度增加，粘度減小，淌度增加，分析速度加快，但擴(kuò)散增加溫度高時(shí)進(jìn)樣體積大。壓力進(jìn)樣，溶液粘度小了，因此進(jìn)樣體積大。電遷移進(jìn)樣，離子淌度大了，毛細(xì)管電流大，進(jìn)樣體積同樣增大引起生物大分子結(jié)構(gòu)和生物特性發(fā)生變化i.影響溶質(zhì)化學(xué)平衡第八章 高效毛細(xì)管電泳20oC30oC40oC50oC112122溫度對(duì)肌紅蛋白分離的影響原因是血紅素中的Fe由Fe（III）還原成Fe（II），溫度升高加速還原的發(fā)生和進(jìn)行（氨基酸殘基作為還原劑）。 第八章 高效毛細(xì)管電泳20oC30oC40oC50oC11213,43,41

19、222344350mmol/LNa2B4O7（pH9.3） 1、甘露糖；2、半乳糖；3、葡萄糖；4、木糖 20C時(shí)，峰顯著寬而且葡萄糖與木糖分不開(kāi)。溫度升高，分離效率明顯增大。原因是絡(luò)和反應(yīng)平衡速度加快，產(chǎn)生更加窄的峰。溫度對(duì)單糖CZE分離的影響第八章 高效毛細(xì)管電泳CZE動(dòng)態(tài)分離 前面講的CZE，是樣品在均勻電場(chǎng)下進(jìn)行分離的。類似于液相色譜中的梯度淋洗，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)背景電解質(zhì)的組成（濃度、pH），可以在CE分離中形成梯度變化，或者局部基質(zhì)動(dòng)態(tài)變化，即在非穩(wěn)態(tài)介質(zhì)中和非均勻電場(chǎng)下進(jìn)行CZE分離。第八章 高效毛細(xì)管電泳非均勻電場(chǎng)下的CZE分離： 外加電壓前，毛細(xì)管充滿電解質(zhì)1，稱為初始電解質(zhì)。其電阻

20、率為r1，R=Lr1為毛細(xì)管內(nèi)電阻。因?yàn)樘畛涞氖蔷鶆螂娊赓|(zhì)，因此縱向的電場(chǎng)是均勻的。在外加電壓下，電解質(zhì)2將從陽(yáng)極連續(xù)流入毛細(xì)管，2稱為置換電解質(zhì)，電阻率為r2。當(dāng)r1與 r2不相等時(shí)，毛細(xì)管內(nèi)電場(chǎng)就隨著時(shí)間變化，形成非均勻電場(chǎng)。 1212第八章 高效毛細(xì)管電泳非均勻電場(chǎng)的特性置換電解質(zhì)前沿到達(dá)毛細(xì)管出口之前的任何時(shí)刻，毛細(xì)管內(nèi)存在兩個(gè)不同電場(chǎng)；a. 電場(chǎng)強(qiáng)度隨置換電解質(zhì)進(jìn)入毛細(xì)管的速度而變化。當(dāng)置換電解質(zhì)充滿毛細(xì)管后，毛細(xì)管內(nèi)又重新建立起均勻電場(chǎng)分布。 12) (LLLR設(shè)時(shí)間t時(shí)置換電解質(zhì)進(jìn)入毛細(xì)管的長(zhǎng)度為L(zhǎng)，則有：第八章 高效毛細(xì)管電泳在置換電解質(zhì)中的電勢(shì)差和電場(chǎng)強(qiáng)度分別為：122) (

21、) (LLLVLVLLLVLLLVLVELL) 1() (122) () (12第八章 高效毛細(xì)管電泳同樣可以得到充有初始電解質(zhì)的部分的電場(chǎng)強(qiáng)度為:LLVELL) 1() (由上述式子可知：（1） ，置換電解質(zhì)與初始電解質(zhì)相同，是均勻電場(chǎng)的情況；（2） ，縱向電場(chǎng)強(qiáng)度不均勻，而且隨時(shí)間變化。多數(shù)情況下，CZE中離子強(qiáng)度較小，可以用濃度比代替電阻率來(lái)計(jì)算。11第八章 高效毛細(xì)管電泳r=1.25r=0.8LEEL不同時(shí)電場(chǎng)強(qiáng)度隨置換長(zhǎng)度的變化情況第八章 高效毛細(xì)管電泳非均勻電場(chǎng)下不同溶質(zhì)的遷移速度 下面考慮 ，即 情況下離子的遷移速度。由于非均勻場(chǎng)強(qiáng)下，電滲流EOF不能保持恒定，為了簡(jiǎn)化，采用平均

22、EOF表示。 對(duì)于陽(yáng)離子， ，其表觀速度大，在置換電解質(zhì)前面遷移。因?yàn)?比均勻電場(chǎng)低，而且越來(lái)越小，因此它的遷移速度越來(lái)越慢；對(duì)于陰離子，其遷移方向和EOF方向相反， ，表觀速度慢，總是在置換電解質(zhì)區(qū)域遷移，而且在置換電解質(zhì)充滿毛細(xì)管后才流出。負(fù)電荷少的先流出，多的后流出。非均勻電場(chǎng)強(qiáng)度的使用可以改善選擇性，更有價(jià)值的是利用非均勻電場(chǎng)進(jìn)行樣品堆積，提高檢測(cè)靈敏度。1) () (12,LLLEEEvveoap) (LLEEvveoap第八章 高效毛細(xì)管電泳CZE中pH梯度動(dòng)態(tài)分離 在CZE裝置中，控制由電極池進(jìn)入毛細(xì)管中的H+離子的流動(dòng)速率，或者是通過(guò)溫度誘導(dǎo)pH變化，能夠在毛細(xì)管內(nèi)形成pH梯度

23、。I1I2VinjoutC三極式pH梯度CZE分離裝置 毛細(xì)管安裝在兩個(gè)電極部件之間，上端有兩個(gè)電極槽，其中一個(gè)與下端緩沖溶液相同，另一個(gè)不同（pH不同，如HCl）。通過(guò)電流比率控制器C改變兩個(gè)電極槽的電流比，從而控制H+離子流入毛細(xì)管的速率，實(shí)現(xiàn)pH梯度。 第八章 高效毛細(xì)管電泳pH1pH2L進(jìn)樣檢測(cè)tH+abcca+bpH梯度CZE分離示意圖 第八章 高效毛細(xì)管電泳瞬間離子基體效應(yīng)CZE動(dòng)態(tài)分離 離子的有效淌度受到周?chē)x子的影響，由其周?chē)x子所形成的包圍圈，稱為離子基體。常規(guī)CZE中離子基體都是恒定不變化的，因此在恒電場(chǎng)下遷移速度恒定。 如果在某一個(gè)時(shí)間間隔上遇到一個(gè)不同組成的離子基體區(qū)帶

24、，這個(gè)離子基體區(qū)帶就會(huì)對(duì)樣品組分產(chǎn)生影響，使它們的淌度以及淌度差發(fā)生瞬時(shí)變化，從而選擇性地影響溶質(zhì)的遷移和分離。 第八章 高效毛細(xì)管電泳 瞬時(shí)離子基體（transient ionic matrix，TIM）不是固定在某一位置，而是從柱子的一端移動(dòng)到另一端，是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程。每一次分離都要產(chǎn)生一個(gè)TIM。TIM在分離柱外添加，然后電遷移進(jìn)入柱子并在柱子中移動(dòng)。其方向可以和樣品方向相同也可以相反。相同的話要求它的淌度比樣品大。離子基體由任何溶劑化離子和絡(luò)和離子形成。第八章 高效毛細(xì)管電泳t進(jìn)樣檢測(cè)LABCAB+CTIM利用TIM效應(yīng)進(jìn)行CZE分離的示意圖，這里TIM方向和樣品遷移方向相反 第八章 高

25、效毛細(xì)管電泳。DNB和 DNS的淌度幾乎相同，在0.01mol/L的NaNO3溶液中不能分離。加入0.01mol/LCu(NO3)2作為絡(luò)和離子后得到分離。Cu2+和DNS絡(luò)和，使DNS淌度減小，遷移速度降下來(lái)。由于Cu2+比Na+淌度大，因此先到達(dá)檢測(cè)點(diǎn)，對(duì)檢測(cè)無(wú)影響。DNS,DNBCu2+DNBDNS3，5-二硝基苯甲酸（DNB）和3，5-二硝基水楊酸（DNS）的分離第八章 高效毛細(xì)管電泳毛細(xì)管區(qū)帶電泳操作小結(jié)毛細(xì)管恒溫，確保遷移時(shí)間重復(fù)性樣品均能溶于緩沖液，防止沉淀堵塞柱子分析蛋白質(zhì)等，常采用涂漬柱或添加劑抑制吸附選擇最佳操作電壓用緩沖液組成(或pH及添加劑濃度等)對(duì)淌度作圖以選擇最佳的

26、緩沖液體系緩沖液宜經(jīng)常更換樣品和緩沖液貯器均要加蓋，注意蒸發(fā)問(wèn)題樣品溶液的電導(dǎo)率宜等于或小于本底電解質(zhì)為克服樣品蒸發(fā)及CE定量重現(xiàn)性，應(yīng)采用一個(gè)內(nèi)標(biāo)對(duì)未涂漬的毛細(xì)管，宜用0.1N的NaOH定期清洗a. 連續(xù)多次進(jìn)樣確定平衡建立與否，實(shí)驗(yàn)是否有效第八章 高效毛細(xì)管電泳膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜MEKC（micellar electrokinetic chromatography） 以膠束為假固定相的一種電動(dòng)色譜，是電泳技術(shù)和色譜技術(shù)的巧妙結(jié)合。MEKC是基于溶質(zhì)在膠束中的不同分配進(jìn)行分離的，其突出的優(yōu)點(diǎn)是除了能夠分離帶電荷的離子化合物外，還可以分離不帶電荷的中性分子。 但是，MEKC對(duì)樣品分子量大小局限

27、在小于5000，而CZE則沒(méi)有這個(gè)限制。第八章 高效毛細(xì)管電泳基本原理溶質(zhì)和膠束的相互作用涉及到靜電力、范德華力（定向力、誘導(dǎo)力、色散力）和氫鍵作用力等。第八章 高效毛細(xì)管電泳遷移時(shí)間窗口及其擴(kuò)展（1）遷移時(shí)間窗口 中性溶質(zhì)的遷移時(shí)間（t0）與完全溶于膠束的溶質(zhì)遷移時(shí)間（tmc）之間的時(shí)間間隔（t0-tmc）； 在膠束中有一定溶解力的溶質(zhì)的遷移時(shí)間落在時(shí)間窗口內(nèi)，即t0tRtmc。 遷移時(shí)間窗口常用遷移時(shí)間比t0/tmc來(lái)表示，t0/tmc越小，時(shí)間窗口越寬。第八章 高效毛細(xì)管電泳（2）遷移時(shí)間窗口的測(cè)定 測(cè)定t0的標(biāo)記物必須是中性的，而且完全不溶于膠束。甲醇在膠束中的作用幾乎可以忽略，所以常

28、用作測(cè)定t0的標(biāo)記物。 用作膠束的標(biāo)記物要求100%溶于膠束，因此，凡不溶于水，能完全溶于膠束的化合物都可以。 蘇丹III或蘇丹IV是常用的膠束標(biāo)記物。對(duì)于陰離子SDS膠束，鹽酸喹啉也是很好的標(biāo)記物。第八章 高效毛細(xì)管電泳（3）遷移時(shí)間窗口的擴(kuò)寬 MEKC 的一個(gè)主要問(wèn)題是遷移時(shí)間窗口的范圍有限。因?yàn)镸EKC中的峰容量（定義為給定的保留時(shí)間范圍內(nèi)能夠被分辨的峰的最大數(shù)目n）與ln(t0/tmc)直接相關(guān)。)/ln(410ttNnmc因此，擴(kuò)大遷移時(shí)間窗口，對(duì)于復(fù)雜樣品的分離有重要的意義。第八章 高效毛細(xì)管電泳eomcefeomcefeoeomcmcvvtt/1)()()(0從上式可以看出，擴(kuò)展

29、時(shí)間窗口的途徑有兩個(gè)： q 改變膠束遷移速度q 改變電滲流速度一般情況下，膠束電泳方向和電滲流方向相反，但速度小于電滲流。第八章 高效毛細(xì)管電泳 改變膠束速度：短鏈的表面活性劑，膠束小、電泳速度高、時(shí)間窗口寬；但保留時(shí)間重現(xiàn)性差，CMC高，分離電流大，焦耳熱嚴(yán)重，柱效低。加入高濃度尿素，可以減小t0/tmc。a) 辛基葡糖苷硼酸鹽絡(luò)和作用形成帶負(fù)電的膠束，改變硼酸鹽濃度，pH等可以方便地改變膠束表面的電荷密度，從而影響其Zeta電勢(shì)，改變淌度，達(dá)到擴(kuò)大遷移時(shí)間窗口的目的。第八章 高效毛細(xì)管電泳 擴(kuò)大遷移時(shí)間窗口的更為有效的辦法是調(diào)節(jié)EOF大小。CZE中影響EOF大小的因素在MEKC中同樣適用。

30、 緩沖溶液的組分、濃度，pH、有機(jī)添加劑、溫度、毛細(xì)管內(nèi)壁涂層，以及加徑向電場(chǎng)梯度直接控制Zeta電勢(shì)等方法都可以用來(lái)改變EOF大小從而擴(kuò)寬遷移時(shí)間窗口。第八章 高效毛細(xì)管電泳容量因子和分離因子 MEKC中容量因子定義為樣品進(jìn)入膠束和在水相中的量之比。即：)(CMCSVKVVKnnkmoldaqmcdaqmc其中Kd為溶質(zhì)在膠束和水相之間的分配系數(shù)，Vmc、Vaq分別為膠束和水相的體積、Vmol為膠束的摩爾體積，S為膠束的濃度，CMC為臨界膠束濃度。容量因子反映了溶質(zhì)和膠束的作用程度。(37)第八章 高效毛細(xì)管電泳 對(duì)于中性分子，容量因子與S成線性關(guān)系。對(duì)于離子化合物，由于存在多種形式，因此其

31、容量因子是各中形式的貢獻(xiàn)的加權(quán)平均。 分離因子又稱為選擇性因子，定義為：2121ddKKkk表示了兩組分之間分配系數(shù)大小的相對(duì)差異。 第八章 高效毛細(xì)管電泳 分配系數(shù)是給定體系的特征參數(shù)，通過(guò)改變膠束類型或者水相，可以改變分配系數(shù)，從而控制分離選擇性。 影響MEKC的選擇性的因素有： （1）溫度； （2）表面活性劑類型； （3）膠束的修飾，如采用混合膠束； （4）水相修飾，如改變緩沖溶液pH等； （5）加入不同的添加劑。第八章 高效毛細(xì)管電泳淌度和遷移時(shí)間 )()()()1(mcefmcefmcaqmcnefkknnn 在電解質(zhì)-膠束體系中，中性溶質(zhì)的有效淌度為：所以中性溶質(zhì)的表觀淌度為：)(

32、)(nefeomcap第八章 高效毛細(xì)管電泳Evnefeonap)()()()(0)()()()1()(mcefeoeonefeoeoeonefeonaprkktVlLVlLvlt11)(111100)(0)(0kttktkktkkkttmceomcefeoeomcefr通過(guò)控制外加電壓、電滲淌度和膠束有效淌度等參數(shù)來(lái)改變遷移時(shí)間。第八章 高效毛細(xì)管電泳分離效率和分離度 柱內(nèi)效應(yīng)主要有:縱向擴(kuò)散膠束增溶作用中的吸附-解吸動(dòng)力學(xué)水相中膠束間的質(zhì)量傳輸徑向溫度梯度效應(yīng)a) 膠束的電泳分散第八章 高效毛細(xì)管電泳eomcmcaqlvkttDkDH1)/(1)(20deomcmcmcKvkkttkttH

33、2020) 1()/(1 )/1 (2aqeomcmcaqDvdkttttkkH4)/(1)/1 (1202024222242064)(24)/1 (TkavIBDkDkttHeomcaqmcTdeomcmcepKvkttkttH)/(1)/1 (026. 0020縱向擴(kuò)散項(xiàng)：吸附-解吸 ：傳質(zhì)：溫度：電分散：第八章 高效毛細(xì)管電泳基于色譜原理導(dǎo)出MEKC分離度方程為：假設(shè)兩組分相當(dāng)靠近，21kk )/(1/111400kttttkkNRmcmcs用函數(shù)f(k)表示后兩項(xiàng)，得到：)/(1/11) (00kttttkkkfmcmc第八章 高效毛細(xì)管電泳以不同遷移時(shí)間窗口t0/tmc值作f(k)k

34、曲線圖，得：0.10.5 1510501000.20.40.60.81.00.10.250.20.30f(k) k關(guān)系曲線，t0/tmc從上到下分別為0，0.1，0.2，0.25，0.3圖中t0/tmc等于0的曲線，相當(dāng)于常規(guī)色譜的情況。k越大，分離度越高。然而，從MEKC的分離角度表明，k不是越大越好。第八章 高效毛細(xì)管電泳最佳的k依賴于t0/tmc，理論研究表明，最優(yōu)化分離度對(duì)應(yīng)的k為：2/10)()/(ttkmcRopts第八章 高效毛細(xì)管電泳MEKC中的膠束假相q 對(duì)溶質(zhì)的作用力不同，從而影響分離選擇性。q 影響電滲，甚至轉(zhuǎn)向等。q 改變遷移窗口，因而可改變系統(tǒng)的峰容量。q 混合膠束的

35、使用可增加分離的選擇性。第八章 高效毛細(xì)管電泳表面活性劑可以分為以下幾類： 陰離子表面活性劑; 陽(yáng)離子表面活性劑； 兩性離子表面活性劑；非離子表面活性劑非離子型常和離子型一起使用形成混合膠束 膽汁鹽，是肝中合成的一種天然生物活性劑，具有甾體結(jié)構(gòu)。膽汁鹽與SDS相比： 極性高，對(duì)多數(shù)溶質(zhì)可得到較小的k值； 手性，能用于某些光學(xué)異構(gòu)體化合物的分離。第八章 高效毛細(xì)管電泳膠束假固定相的選擇與改良： 形成穩(wěn)定的膠束，而且與溶質(zhì)的締合速度盡可能快； CMC低，CMC太高，導(dǎo)致離子強(qiáng)度增大，電泳電流大，焦耳熱影響大； 形成的膠束必須是均勻、透明的溶液，不影響檢測(cè)； 膠束粘度小，以保持大的EOF速度。第八章

36、 高效毛細(xì)管電泳 選擇方法：對(duì)大多數(shù)中性溶質(zhì)，SDS具有廣泛的適用性；對(duì)于極性溶質(zhì)，含有不同極性基團(tuán)的表面活性劑表現(xiàn)出不同的選擇性，甚至改變出峰順序；對(duì)易被管壁吸附的大分子的分離，可以選擇陽(yáng)離子膠束體系，這個(gè)時(shí)候要注意EOF方向；a) 對(duì)于離子溶質(zhì)的分離，疏水性和電荷都影響分配系數(shù)，電荷極性不同的膠束體系產(chǎn)生不同的選擇性，所以要選擇與溶質(zhì)帶電荷相反的膠束，才能產(chǎn)生強(qiáng)的相互作用進(jìn)入膠束。第八章 高效毛細(xì)管電泳對(duì)于強(qiáng)疏水性溶質(zhì)，可以選用極性強(qiáng)的膠束體系，如膽汁鹽等。對(duì)于手性物質(zhì)的分離，需要手性膠束如膽汁鹽、十二烷基脯氨酸等。某些膠束具有特殊的選擇性，如全氟化的烷烴鏈表面活性劑對(duì)氟化物表現(xiàn)出強(qiáng)的選擇

37、性，有些場(chǎng)合用非離子性或者兩性離子表面活性劑能夠得到很好的分離。第八章 高效毛細(xì)管電泳膠束改良技術(shù)： 膠束的類型、濃度及其組成，影響膠束的大小，聚集數(shù)及幾何形狀，因而影響其與溶質(zhì)的相互作用或增溶作用。為了獲得更理想的膠束假相，發(fā)展了膠束改良技術(shù)。 常用的有采用混合膠束和改變表面活性劑的對(duì)離子。第八章 高效毛細(xì)管電泳將非離子型表面活性劑加到離子性表面活性劑中形成混合膠束，體積增大但是表面電荷減小，因此膠束的電泳淌度降低，遷移時(shí)間窗口變窄，選擇性明顯改變。例如用非離子性手性表面活性劑如甘草酸、b-七葉酸等與SDS混合后用于拆分手性異構(gòu)體。用有機(jī)離子對(duì)試劑可以改善分離度。例如在SDS中加入四烷基銨，

38、作為一個(gè)對(duì)離子與負(fù)離子SDS膠束結(jié)合，因而顯著改變膠束的特性。對(duì)于復(fù)雜樣品的分離有用。第八章 高效毛細(xì)管電泳影響MEKC分離的因素 膠束濃度 實(shí)驗(yàn)表明，容量因子與表面活性劑的濃度成線性關(guān)系。膠束含量增加，溶質(zhì)遷移時(shí)間增加，分離選擇性增加。但溶液的電導(dǎo)率增高，產(chǎn)生有害的熱效應(yīng)，影響高電壓的使用。 實(shí)際操作中，濃度不低于CMC的1.1倍，上限根據(jù)體系的總離子強(qiáng)度大小、粘度及電流大小等因素，一般控制在200mmol/L之內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)條件為：30-100 mmol/L。濃度太低，穩(wěn)定性差，樣品容量小，重現(xiàn)性差。第八章 高效毛細(xì)管電泳 pH值 除了影響電泳、電滲流外，pH在MEKC中影響遷移時(shí)間窗口，溶質(zhì)和

39、膠束的相互作用。如：-荼酚胺為例，在低pH時(shí)，氨基會(huì)質(zhì)子化，因此，會(huì)加強(qiáng)和膠束的靜電吸引作用，從而增加遷移時(shí)間。反之，酸性組分在pH較大時(shí)會(huì)失去H+，成為帶負(fù)電的粒子。與SDS膠束帶相同的電荷，產(chǎn)生一種排斥效應(yīng)，溶解度減小，保留時(shí)間提前。 離子強(qiáng)度： 和CZE相似，影響電滲流、電泳和焦耳熱。第八章 高效毛細(xì)管電泳添加劑 有機(jī)溶劑：（1）會(huì)降低Zeta電勢(shì)，使電滲流降低，擴(kuò)大遷移窗口，增加峰容量。例如，在0.05mmol/L膽酸鈉中加入12%的甲醇，成功地分離了聯(lián)萘酚BNOH，聯(lián)萘酚磷酸脂BNPO4的對(duì)映體。ABA：0.05mol/L 膽酸鈉 B：0.05mol/L膽酸鈉+12%甲醇 第八章 高

40、效毛細(xì)管電泳（2）影響溶質(zhì)的分配系數(shù)，可以優(yōu)化分離度。 加入有機(jī)溶劑，分配平衡向水相移動(dòng)。疏水性較弱的溶質(zhì)相對(duì)于疏水性強(qiáng)的平衡移動(dòng)大些，在膠束中分配系數(shù)減小得更多一些，從而可以優(yōu)化分離。SDS不加甲醇，無(wú)法分離。加入20%甲醇時(shí)，由于氘代DNS-NHCD3的平衡分配系數(shù)更多地移向水相，容量因子減小更多而和DNS-NHCH3分離。NCH3CH3SNCH3OONCH3CH3SNCD3OO第八章 高效毛細(xì)管電泳（3）使膠束的結(jié)構(gòu)疏松而使溶質(zhì)進(jìn)出膠束的傳質(zhì)過(guò)程加快，可提高分離效率。（4）阻止溶質(zhì)和膠束的強(qiáng)相互作用，有利于強(qiáng)疏水性溶質(zhì)的分離（5）減小毛細(xì)管壁的吸附作用。（6）實(shí)現(xiàn)MEKC梯度淋洗。 甲醇

41、和乙腈用得最多，濃度控制在5-25之間為宜。第八章 高效毛細(xì)管電泳環(huán)糊精改良的MEKC（CD-MEKC）： 環(huán)糊精是由6-8葡萄糖單元組成的圓筒狀手性分子，分別稱為-CD、 -CD、-CD。其外部是親水性羥基，內(nèi)腔是疏水性的。 當(dāng)CD加入到膠束溶液中時(shí)，體系有三個(gè)相，水相、CD相和膠束相，溶質(zhì)在三相之間分配，從而產(chǎn)生不同的溶質(zhì)遷移和手性分離。第八章 高效毛細(xì)管電泳 尿素：q增溶，大多數(shù)溶質(zhì)有效果q對(duì)SDS膠束，可以改變其遷移時(shí)間，隨尿素濃度增大而增加，但是EOF速度不發(fā)生明顯變化，因此遷移時(shí)間窗口增大，有利于改善分離度。q對(duì)于大多數(shù)溶質(zhì)，假如高濃度尿素可降低保留因子。q有助于加快溶質(zhì)從水相到膠

42、束相的輸送過(guò)程。q電流線性減小，粘度稍有增加。第八章 高效毛細(xì)管電泳金屬離子和硼酸鹽： 金屬離子可以靜電吸附在膠束表面，與溶質(zhì)產(chǎn)生選擇性絡(luò)和作用，因而可控制分離的選擇性。硼酸鹽可以和一些溶質(zhì)形成帶負(fù)電荷絡(luò)和物，從而影響分離。第八章 高效毛細(xì)管電泳MEKC達(dá)到高效快速分離的原因：o 電滲流的扁平流型，大大減小了徑向速度梯度；o 毛細(xì)管柱的細(xì)管徑以其極高的散熱效率減小了由高電場(chǎng)強(qiáng)度引起的熱效應(yīng)；o 膠束本身是動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，因而溶質(zhì)進(jìn)出方便迅速，使傳質(zhì)速度加快。第八章 高效毛細(xì)管電泳毛細(xì)管凝膠電泳（CGE） 在自由溶液區(qū)帶電泳中派生出一種用凝膠物質(zhì)作為支持物進(jìn)行電泳的方式，被稱為凝膠電泳。凝膠作為一種固

43、態(tài)膠體分散體系，具有多孔性，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。因此它有一種類似于分子篩的作用，通過(guò)它的物質(zhì)會(huì)按照分子的大小逐一被分離開(kāi)。 應(yīng)用最多的是交聯(lián)和非交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel, PAG）。第八章 高效毛細(xì)管電泳 CGE是蛋白質(zhì)、多肽、寡核苷酸、DNA等生物大分子分離分析的有力工具。特別是和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，成為DNA快速測(cè)序的優(yōu)選方案。 CGE中主要存在兩個(gè)問(wèn)題：（1）常用的丙烯酰胺單體在毛細(xì)管中聚合成凝膠時(shí)極易形成氣泡；（2）電泳期間毛細(xì)管中也常常形成氣泡。 按照材料來(lái)源的不同，凝膠實(shí)際上又可分為無(wú)機(jī)凝膠和有機(jī)凝膠兩大類，多孔硅膠和多孔玻璃屬于前者，葡聚糖、交聯(lián)聚

44、丙烯酰胺和瓊脂糖等屬于后者。第八章 高效毛細(xì)管電泳聚丙烯酰胺凝膠毛細(xì)管的制備（1）毛細(xì)管內(nèi)壁處理： 用堿溶液、酸溶液、甲醇清洗后，沖入雙功能團(tuán)試劑如-甲基丙烯酰氧基三甲氧基硅烷（MAPS），室溫反應(yīng)至少3小時(shí)，然后用甲醇和水沖洗。這樣處理后得到鍵和有雙鍵的表面，在丙烯酰胺聚合時(shí)雙鍵參與聚合從而將凝膠固定增加穩(wěn)定性。第八章 高效毛細(xì)管電泳（2）聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺（Acr）、交聯(lián)劑甲撐雙丙烯酰胺（Bis），在過(guò)硫酸胺（APS）-四甲基乙二胺（TEMED）化學(xué)聚合或者核黃素-TEMED光聚合系統(tǒng)催化下聚合完成。溶液需脫氣（3）聚合溶液引入毛細(xì)管，進(jìn)一步與管壁雙鍵進(jìn)行反應(yīng)。第八章 高效毛細(xì)管

45、電泳 氣泡的消除：n加壓條件下或者減壓條件下聚合n采用逆向電泳法聚合：在充滿聚合溶液的毛細(xì)管中，通過(guò)逆向電泳將催化劑和引發(fā)劑從毛細(xì)管一端引入進(jìn)行交聯(lián)，聚合時(shí)凝膠收縮產(chǎn)生的溶液空缺由從容器中引入的單體溶液得到實(shí)時(shí)補(bǔ)充。n加入消泡劑或變性劑，如乙二醇、甲酰胺等。第八章 高效毛細(xì)管電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)：凝膠粘度大，抗對(duì)流，能減少溶質(zhì)的擴(kuò)散，峰型尖銳，柱效極高，達(dá)到107塔板/米。分離度達(dá)到可以分辨DNA片段單堿基的能力。遷移時(shí)間重現(xiàn)性好。穩(wěn)定性和壽命與凝膠本身有關(guān)，好的凝膠可以重復(fù)使用150200次。當(dāng)被分離的分子的大小與凝膠的孔徑相當(dāng)時(shí)，其淌度與尺寸大小有關(guān)，淌度隨蛋白質(zhì)分子量的增加而遞減。

46、1.毛細(xì)管凝膠電泳比平板凝較電泳具有更好的自動(dòng)化和定量分析性能。第八章 高效毛細(xì)管電泳影響CGE分離的因素：管壁預(yù)處理后（硅烷化），得到更加對(duì)稱的峰形；凝膠濃度低，孔徑大，溶質(zhì)遷移速率增大，分離速度快；1. 緩沖溶液pH：pH影響溶質(zhì)的淌度。制備凝膠的溶液pH與操作緩沖溶液pH不相同時(shí)，需要平衡一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間。平衡時(shí)間對(duì)分離度、峰序和流出時(shí)間有影響。這些現(xiàn)象的原因還不十分清楚，但提醒人們，除非特殊情況，否則聚合溶液pH與操作緩沖溶液pH盡可能相同。第八章 高效毛細(xì)管電泳溫度升高，電阻降低，在恒壓模式下電流增大。對(duì)于DNA限制片段，柱效降低。電場(chǎng)強(qiáng)度越高，遷移速率越快。對(duì)于較小分子，遷移速度與

47、E成正比；但對(duì)于較大的分子，則偏離線性，遷移速度比預(yù)期的更快。第八章 高效毛細(xì)管電泳假設(shè)相鄰峰峰寬相同，分離度可以近似表示為：顯著依賴兩組分的相對(duì)淌度差（ ）和峰的總方差。電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)相對(duì)淌度差的影響和分子大小有關(guān)。對(duì)于較小的分子，相對(duì)淌度差受E影響小，隨著E增大，分離度增大。當(dāng)E進(jìn)一步增大時(shí)，由于焦耳熱導(dǎo)致的溫度效應(yīng)而降低；對(duì)于大分子，相對(duì)淌度差隨E增大顯著減小，從而導(dǎo)致分離度降低，這就是分子量很大的分子需要在低電壓下分離的原因。5 . 02)(4TslR第八章 高效毛細(xì)管電泳凝膠柱的操作特點(diǎn)毛細(xì)管柱接到儀器上后，應(yīng)立即使其通入緩沖液，以避免脫水，防止膠的干裂。先用標(biāo)準(zhǔn)化合物運(yùn)行一遍以確保儀器

48、和柱子性能正常。凝膠電泳通常采用電動(dòng)進(jìn)樣，如果采用壓力進(jìn)樣，膠可能被從毛細(xì)管中擠出。1. 柱子可以在較高溫度下運(yùn)行。（擴(kuò)散系數(shù)小）第八章 高效毛細(xì)管電泳使用的電場(chǎng)強(qiáng)度需低于400Vcm，否則易使柱內(nèi)凝膠龜裂。樣品溶液的離子強(qiáng)度要低，以盡可能增大進(jìn)樣量。離子強(qiáng)度對(duì)定量和分離效率特別重要，它的變化還會(huì)導(dǎo)致響應(yīng)因子的變化。采用系列標(biāo)準(zhǔn)物以確保相對(duì)遷移時(shí)間的重復(fù)性。緩沖液宜經(jīng)常更換。第八章 高效毛細(xì)管電泳其他篩分介質(zhì)瓊脂糖（AG），空隙大，機(jī)械強(qiáng)度高，生物惰性，有很好的抗對(duì)流性。分離DNA時(shí)，分離度稍差，但遷移速度快Hydrolink膠，與PAG相比，有較高的機(jī)械強(qiáng)度和樣品負(fù)載，但柱子的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性

49、和分離性能有待提高。1. 高聚物溶液篩分介質(zhì)：葡聚糖和聚乙二醇等。特點(diǎn)是裝柱容易，不會(huì)出現(xiàn)氣泡，電泳后能夠方便地從毛細(xì)管中排出。此外是紫外透明的。選擇性和柱效與線性PAG相當(dāng)。(無(wú)膠篩分)第八章 高效毛細(xì)管電泳 無(wú)膠篩分電泳中，較為常用的是甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素。這些聚合物溶于水后，在濃度較高時(shí)，可形成類似于凝膠的多孔結(jié)構(gòu)，從而進(jìn)行篩分分離。 纖維素衍生物種類較多，分子量大小及粘度各異，對(duì)不同大小的DNA片段分析。 無(wú)膠篩分電泳操作簡(jiǎn)單，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，正受到愈來(lái)愈廣泛的重視。 第八章 高效毛細(xì)管電泳溶質(zhì)在凝膠柱中的遷移模型Ogston模型 假設(shè)基質(zhì)由互相連接的無(wú)規(guī)則網(wǎng)絡(luò)所組

50、成，其空隙平均孔徑為x。遷移的溶質(zhì)就象一個(gè)半徑Rg的不變形粒子。因此，較小的分子有更多的孔隙可以利用而遷移速度快。根據(jù)這種假設(shè)，溶質(zhì)在凝膠中的電泳淌度為：204exprRg0是溶質(zhì)在自由溶液中的淌度，r是股繩厚度。第八章 高效毛細(xì)管電泳 Ogston模型未考慮電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)粒子形狀的影響，因此只適合低電場(chǎng)強(qiáng)（ ）的場(chǎng)合。當(dāng)也不適用。0EgRRgO1O2Ogston模型 爬行模型第八章 高效毛細(xì)管電泳爬行模型 假設(shè)溶質(zhì)向線性鏈條一樣在網(wǎng)絡(luò)中運(yùn)行，用固定的障礙O1、O2等來(lái)描述網(wǎng)絡(luò)。溶質(zhì)要避開(kāi)這些障礙前進(jìn)，象蛇一樣爬行（reptation）。在零電場(chǎng)情況下，有 ，n為高分子重復(fù)單元個(gè)數(shù)。表明在低電場(chǎng)下

51、，淌度和溶質(zhì)質(zhì)量成反比。 修正后的爬行模型可以推廣到高電場(chǎng)。在電場(chǎng)作用下，溶質(zhì)分子被拉伸，電場(chǎng)越強(qiáng)，拉伸越強(qiáng)，極限情況下成為棒狀。此時(shí)，淌度不再依賴分子大小，于是有K常數(shù)，f是x、溶質(zhì)電荷和穩(wěn)定性的函數(shù)。n1)1(2fEnK第八章 高效毛細(xì)管電泳毛細(xì)管涂層技術(shù)涂層改性的目的q 改變EOFq 抑制樣品吸附方法 動(dòng)態(tài)方法：改變pH、離子強(qiáng)度、加入添加劑 涂層：物理吸附或化學(xué)鍵合方法第八章 高效毛細(xì)管電泳涂層要求o 容易制備o 批-批涂層處理的毛細(xì)管之間重現(xiàn)性好o 在寬的pH范圍內(nèi)有高的分離效率o在寬的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定性好o 有效抑制吸附，控制EOF第八章 高效毛細(xì)管電泳涂層種類（1）物理吸附：方法簡(jiǎn)

52、單，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差。（2）化學(xué)鍵合：利用有機(jī)硅烷的親水基團(tuán)與硅羥基反應(yīng)化學(xué)鍵合，然后再用不同的物質(zhì)去活。穩(wěn)定性好，應(yīng)用最多。 常用的涂層物質(zhì)有：甲基纖維素，聚丙烯酰胺，聚乙二醇、聚乙烯基吡咯酮、聚甲基硅氧烷等。第八章 高效毛細(xì)管電泳涂層性質(zhì)及對(duì)溶質(zhì)保留的影響q 大多數(shù)降低管壁表面電荷，降低EOF；q 荷正電的聚乙烯亞胺（PEI）涂層使EOF反向；q 乳清蛋白涂層等呈兩性，EOF隨pH和操作參數(shù)改變而變化q 減小蛋白質(zhì)的吸附，得到較高的分離度和好的峰形。如交聯(lián)的聚丙烯酰胺涂層，在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)EOF十分平穩(wěn)，分離蛋白質(zhì)的重現(xiàn)性也很好。操作600次后仍能得到很好的精度。第八章 高效毛細(xì)管電泳毛細(xì)管

53、進(jìn)樣技術(shù)常規(guī)進(jìn)樣常規(guī)進(jìn)樣 流體力學(xué)進(jìn)樣：通過(guò)虹吸、在進(jìn)樣端加壓、或者檢測(cè)端抽空等方法。LtPaVinjinj84HgP虹吸進(jìn)樣時(shí)優(yōu)點(diǎn)：對(duì)樣品沒(méi)有歧視現(xiàn)象，即保持各組分在樣品瓶中的濃度比不變化。第八章 高效毛細(xì)管電泳 電動(dòng)（電遷移）進(jìn)樣：將進(jìn)樣端的緩沖溶液瓶換成樣品瓶然后加電壓實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣。進(jìn)樣量為特點(diǎn)：產(chǎn)生進(jìn)樣歧視，但方法簡(jiǎn)單，當(dāng)緩沖溶液粘度大的時(shí)候，特別是CGE情況下很適合。injieoieftCaEQ2)()(第八章 高效毛細(xì)管電泳預(yù)濃縮進(jìn)樣預(yù)濃縮進(jìn)樣q毛細(xì)管進(jìn)樣體積小，對(duì)檢測(cè)器靈敏度要求高q低濃度樣品檢測(cè)的需要q 場(chǎng)放大進(jìn)樣 樣品溶解在與操作緩沖溶液成分相同的稀緩沖溶液或純水中，樣品溶液的電

54、阻率s將高于毛細(xì)管中背景電解質(zhì)的電阻率b。sbbsbsCCEE/第八章 高效毛細(xì)管電泳樣品堆積：樣品塞中的離子以快的速度遷移至區(qū)帶前沿，直至進(jìn)入到電場(chǎng)強(qiáng)度為Eb的高濃度緩沖溶液區(qū)域而變慢下來(lái)，于是導(dǎo)致樣品塞中離子堆積（stacking）在高濃度的緩沖溶液界面上。 通過(guò)濃度界面的離子流必須保持平衡：因?yàn)樗詁sbsEE )()(ibepibisepisvCvCisibCCEv 第八章 高效毛細(xì)管電泳樣品離子數(shù)必須保持恒定，因此樣品帶寬必須相應(yīng)地縮短倍：injefWWq正、負(fù)離子都適用，通常陽(yáng)離子堆積在樣品塞前沿，陰離子堆積在樣品塞后沿。q忽略了電滲流的影響。由于局部電場(chǎng)不均勻，會(huì)引起層流，產(chǎn)生附

55、加的峰增寬，抵消一部分堆積效果。 第八章 高效毛細(xì)管電泳 幾種場(chǎng)放大進(jìn)樣方式 導(dǎo)入樣品塞后切換極性，排出樣品基體（陰離子）溶解在水中的樣品導(dǎo)入毛細(xì)管；加反極性電壓，EOF將水塞排出，陰離子以非常高的速度堆積到高濃度緩沖溶液區(qū)域；電流值達(dá)到初始值的95%，極性切換到分離模式；極限情況下可將整個(gè)分離柱都充滿樣品緩沖液。分離前排除了樣品緩沖溶液，消除了層流效應(yīng)，保持了高分離度。i.對(duì)陽(yáng)離子，可以將電滲流反向后操作。濃縮因子可以達(dá)到1000倍。第八章 高效毛細(xì)管電泳電遷移場(chǎng)放大進(jìn)樣：進(jìn)樣前注入一個(gè)短的稀緩沖溶液塞或水柱在稀緩沖溶液中制備的樣品電遷移進(jìn)樣換操作的高濃度緩沖液進(jìn)行分離（對(duì)于陰離子用反極性導(dǎo)

56、入樣品）與常規(guī)電遷移進(jìn)樣比較，這種方法可以得到很大的信號(hào)增強(qiáng)。場(chǎng)放大極性切換進(jìn)樣：進(jìn)樣前先注入一段稀緩沖溶液塞正極性導(dǎo)入陽(yáng)離子，切換極性，導(dǎo)入陰離子換成緩沖溶液進(jìn)行分離可同時(shí)分離正負(fù)離子，但電動(dòng)進(jìn)樣歧視現(xiàn)象明顯第八章 高效毛細(xì)管電泳ITP-CZE耦合進(jìn)樣 樣品注入到前導(dǎo)電解質(zhì)（即較高電泳淌度）和尾隨電解質(zhì)（較低淌度）之間，按其淌度大小連續(xù)排列，建立一種穩(wěn)態(tài)遷移模式（CZE中區(qū)帶會(huì)被背景電解質(zhì)稀釋）。低濃度樣品組分將遵循Kohlrausch調(diào)整函數(shù)：LSKCCLSSLRLKL、S、R分別為前導(dǎo)離子、樣品和對(duì)離子。濃縮因子可以達(dá)到1001000色譜富集進(jìn)樣：CE前接色譜濃縮預(yù)柱第八章 高效毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法 檢測(cè)器是CE儀器的核心部件之一。由于CE進(jìn)樣量非常小（約幾nl），因此檢測(cè)靈敏度要求高。 紫外、熒光、電化學(xué)、質(zhì)譜等 第八章 高效毛細(xì)管電泳（1）紫外檢測(cè)器 CE常規(guī)檢測(cè)器，靈敏度較低，通用性好。結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，商品化檢測(cè)器已達(dá)到較高的性能，