病毒遺傳分析課件

1、1第四章第四章 病毒的遺傳分析病毒的遺傳分析 學(xué)習(xí)要點(diǎn)學(xué)習(xí)要點(diǎn): : 1 1 噬菌體的突變型及基因重組的特點(diǎn)；噬菌體的突變型及基因重組的特點(diǎn)； 2 2 噬菌體的互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)與順反子測(cè)定；噬菌體的互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)與順反子測(cè)定； 3 3 用兩點(diǎn)測(cè)交與三點(diǎn)測(cè)交測(cè)定噬菌體交換值用兩點(diǎn)測(cè)交與三點(diǎn)測(cè)交測(cè)定噬菌體交換值; ; 4 4 噬菌體基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；噬菌體基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)； 5 5 噬菌體的線狀染色體與環(huán)狀連鎖圖。噬菌體的線狀染色體與環(huán)狀連鎖圖。2background 一、細(xì)菌和病毒在遺傳研究中的優(yōu)越性繁殖世代所需時(shí)間短；易于管理和進(jìn)行化學(xué)分析；遺傳物質(zhì)較簡(jiǎn)單，便于用作研究基因結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機(jī)制的材料。 便于研究

2、基因的突變；便于研究基因的作用；可作為研究高等生物的簡(jiǎn)單模型；3二、細(xì)菌和病毒的擬有性過程 細(xì)菌和病毒均屬于原核生物不存在嚴(yán)格意義上的有性過程。 細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)除了染色體外還有核外dna物質(zhì)結(jié)構(gòu)(如噬菌體和質(zhì)粒)，它們可以在細(xì)胞間傳遞，并且形成細(xì)菌染色體間以及細(xì)菌染色體與核外遺傳因子間的重組體，類似于真核生物減數(shù)分裂過程中形成的重組體結(jié)構(gòu)。4第一節(jié)第一節(jié) 噬菌體的繁殖和突變型噬菌體的繁殖和突變型噬菌體的繁殖噬菌體的繁殖 （一）（一）烈性噬菌體的感染周期烈性噬菌體的感染周期 遺傳學(xué)上應(yīng)用最廣泛的烈性噬菌體是大腸遺傳學(xué)上應(yīng)用最廣泛的烈性噬菌體是大腸桿菌（桿菌（ e.coli ）的）的t噬菌體。它們的結(jié)

3、構(gòu)噬菌體。它們的結(jié)構(gòu)大同小異，外貌一般呈蝌蚪狀。大同小異，外貌一般呈蝌蚪狀。t偶列和偶列和t奇列有些不同，以奇列有些不同，以t 4的結(jié)構(gòu)最為典型的結(jié)構(gòu)最為典型. 5（二）（二）溫和性噬菌體的感染周期溫和性噬菌體的感染周期 溫和性噬菌體具有溶原性（溫和性噬菌體具有溶原性（lisogeny）的生活）的生活周期。這類噬菌體侵入細(xì)菌以后，細(xì)菌細(xì)胞并周期。這類噬菌體侵入細(xì)菌以后，細(xì)菌細(xì)胞并不馬上裂解。不馬上裂解。 溫和性噬菌體有兩種類型。溫和性噬菌體有兩種類型。 （1）以）以為代表為代表 （2）p 1 噬菌體噬菌體 裂解周期：裂解周期： 溶源性細(xì)菌溶源性細(xì)菌自發(fā)或經(jīng)誘發(fā)自發(fā)或經(jīng)誘發(fā)裂解細(xì)菌裂解細(xì)菌 釋放

4、釋放 子噬菌體。子噬菌體。6structure of t4 bacteriophaget4 噬菌體浸染時(shí)的尾殼收縮contraction of the tail sheath of t4 (when infection of host cell)頭頭尾釘尾釘（刺突）（刺突）尾尾尾絲尾絲尾鞘尾鞘一、結(jié)構(gòu)一、結(jié)構(gòu)7 t4t4病毒粒子含有線形雙鏈病毒粒子含有線形雙鏈dnadna，基因組長(zhǎng)度，基因組長(zhǎng)度166kb(166kb(千堿基對(duì)千堿基對(duì)) )； 其基因組其基因組dnadna含含5-5-羥甲羥甲基胞嘧啶以代替胞嘧啶，而且羥甲基是葡基胞嘧啶以代替胞嘧啶，而且羥甲基是葡糖化了的。糖化了的。 t4t4

5、dnadna聚合酶是在生物中發(fā)現(xiàn)直接參與聚合酶是在生物中發(fā)現(xiàn)直接參與dnadna復(fù)制的第一種酶。復(fù)制的第一種酶。 8 二、遺傳圖譜二、遺傳圖譜9 三、研究方法 1、噬菌斑 2.一步生長(zhǎng)曲線試驗(yàn) 3. 單菌釋放實(shí)驗(yàn)10噬菌體生長(zhǎng)的測(cè)定一步生長(zhǎng)曲線一步生長(zhǎng)曲線一步生長(zhǎng)曲線：定量描述一群菌體內(nèi)毒性噬菌體生：定量描述一群菌體內(nèi)毒性噬菌體生長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線。長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線。感染后培養(yǎng)過程感染后培養(yǎng)過程被噬菌體侵染的被噬菌體侵染的菌群培養(yǎng)過程菌群培養(yǎng)過程定時(shí)取培養(yǎng)液與敏感菌混合平板培養(yǎng)不同取樣時(shí)間培養(yǎng)液與敏感菌混合不同取樣時(shí)間培養(yǎng)液與敏感菌混合平板培養(yǎng)產(chǎn)生的噬菌斑數(shù)量的動(dòng)態(tài)平板培養(yǎng)產(chǎn)生的噬菌斑數(shù)量的動(dòng)態(tài)

6、11 四、基本術(shù)語 1.涂布效率（e.o.p）=噬菌斑/感染噬菌體顆粒數(shù) 2.感染復(fù)數(shù)m=噬菌體顆粒數(shù)/細(xì)菌數(shù)量 3.裂解量裂解量每個(gè)被感染細(xì)菌釋放新的每個(gè)被感染細(xì)菌釋放新的噬菌體噬菌體的平均數(shù)的平均數(shù) 12131415一、一、 噬菌體的突變噬菌體的突變型型( (一一) )快速溶菌突變型（快速溶菌突變型（r r）: : 噬菌斑大于野生性并且噬菌斑大于野生性并且邊緣更為清晰，突變率為邊緣更為清晰，突變率為1010-4-41010-3-3。 正常噬菌體，r+，產(chǎn)生的菌斑小而邊緣模糊 突變噬菌體，r -，產(chǎn)生的菌斑大兩倍而邊緣清晰第二節(jié)第二節(jié) 突變的類型突變的類型16 benzer所用所用 t4的的

7、 r ii突變就是遺傳學(xué)研究突變就是遺傳學(xué)研究中所用的第一個(gè)條件致死突變型。中所用的第一個(gè)條件致死突變型。 t4噬菌體有多個(gè)迅速裂解突變型，分別稱為噬菌體有多個(gè)迅速裂解突變型，分別稱為 rl， r ii，riii等，它們位于等，它們位于 t4染色體染色體 dna的不同區(qū)的不同區(qū)段，這段，這 3組突變型由于在大腸桿菌不同菌株上的組突變型由于在大腸桿菌不同菌株上的反應(yīng)不同可以相互區(qū)別。反應(yīng)不同可以相互區(qū)別。 t4 r ii突變使所侵染細(xì)胞迅速裂解形成大噬菌突變使所侵染細(xì)胞迅速裂解形成大噬菌斑，所以稱為斑，所以稱為 r ii突變型。突變型。 17（二（二) )宿主范圍突變型（宿主范圍突變型（h h）

8、：突變率為）：突變率為1010-6-6，不同的菌株中突變性不一樣。不同的菌株中突變性不一樣。 正常噬菌體，正常噬菌體，h+，只能以大腸桿菌，只能以大腸桿菌b株株(ttor)為宿主為宿主 突變噬菌體，突變噬菌體，h-，能以，能以b株和株和b/4株株(ttos)為宿主為宿主18( (三三) ) 條件致死突變型條件致死突變型 1 1 溫度敏感突變型溫度敏感突變型 2 2 抑制因子敏感突變（抑制因子敏感突變（sussus） 噬菌體噬菌體 細(xì)菌細(xì)菌 正常基因正?；?sus+ su-sus+ su- 突變基因突變基因 sus su+sus su+ 19（1 1）抑制因子敏感突變的概念：）抑制因子敏感突變

9、的概念：例如：噬菌體例如：噬菌體mrnamrna基因基因 細(xì)菌細(xì)菌trnatrna基因反密碼子基因反密碼子 正常正常 突變突變 突變突變 正常正?；颍夯颍?ta5tac c 3 35ta5tag g 3 3 3 3atatc c 5 533atatg g 5 5 mrna 5uamrna 5uac c 3 5ua 3 5uag g 3 3 3 3aucauc 5 3 5 3augaug 5 5 表型：酪氨酸表型：酪氨酸 終止終止 5uag 35uag 3 酪酪氨酸氨酸 酪酪氨酸氨酸33auauc c 5 5 酪酪氨酸氨酸20表表5-25-2攜帶不同專一性抑制基因宿主中攜帶不同專一性抑制基因

10、宿主中sussus突變噬菌體的表現(xiàn)突變噬菌體的表現(xiàn)噬菌體基因型噬菌體基因型 宿主菌基因型宿主菌基因型susu- - su su+ +amb suamb su+ +och suoch su+ +opop野生型野生型sus ambersus ambersus ochresus ochresus opalsus opal + + + + + + + + - + + - + + - - - - + - - - + - - - - + - - - +（2 2）噬）噬菌體的抑制因子敏感突變型類型及表現(xiàn)菌體的抑制因子敏感突變型類型及表現(xiàn) 琥珀型（琥珀型（amberamber）uaguag 赭石型（赭石型（o

11、cherocher）uaauaa 乳白型（乳白型（opalopal） uga uga 21（四）無義突變與無義抑制突變無義突變：無義突變：指一個(gè)為氨基酸編碼的密碼變?yōu)榻K止密碼指一個(gè)為氨基酸編碼的密碼變?yōu)榻K止密碼的突變。的突變。 無義抑制突變：無義抑制突變：指能抑制無義突變表現(xiàn)的突變。指能抑制無義突變表現(xiàn)的突變。 表表5-3 55-3 5種琥珀抑制基因的性質(zhì)種琥珀抑制基因的性質(zhì)琥珀型抑琥珀型抑 插入的插入的 合成的蛋白質(zhì)合成的蛋白質(zhì) 赭石型抑赭石型抑 制基因制基因 氨基酸氨基酸 占野生型占野生型% % 制基因制基因 su su1 1+ + 絲氨酸絲氨酸 2828 - - su su2 2+ +

12、谷氨酰胺谷氨酰胺 1414 - - su su3 3+ + 酪氨酸酪氨酸 5555 - - su su4 4+ + 酪氨酸酪氨酸 1616 + + su su5 5+ + 賴氨酸賴氨酸 5 5 + +22第三節(jié)第三節(jié) 噬菌體突變的重組試驗(yàn)噬菌體突變的重組試驗(yàn)一一 t t2 2突變型及特性突變型及特性 細(xì)細(xì) 菌菌 b/2b/2 快速溶菌突變型：快速溶菌突變型：r r 大噬菌斑；大噬菌斑； 野生型：野生型：r+ r+ 小噬菌斑；小噬菌斑； t t2 2宿主范圍野生型宿主范圍野生型: h + - : h + - 半透明半透明 t t2 2宿主范圍突變型宿主范圍突變型: h- + + : h- + +

13、 透明透明23二二 t t2 2突變型的兩點(diǎn)試驗(yàn)突變型的兩點(diǎn)試驗(yàn)( (一一) ) 噬菌體雜交噬菌體雜交 h-r+ x h+r-h-r+ x h+r- ecoli becoli b 表現(xiàn)型表現(xiàn)型 基因型基因型透明透明, ,小小 h-r+ h-r+ 親組合親組合半透明半透明, ,大大 h+r- h+r- 親組合親組合 透明透明, ,大大 h-r- h-r- 重組合重組合半透明半透明, ,小小 h+r+ h+r+ 重組合重組合 (二二) 噬菌體重組值的計(jì)算噬菌體重組值的計(jì)算 重組噬菌斑數(shù)重組噬菌斑數(shù)重組值重組值 = 總噬菌斑數(shù)總噬菌斑數(shù)ecoliecoli：b + b/2b + b/2100%100

14、%24三三 t4t4突變型的三點(diǎn)試驗(yàn)突變型的三點(diǎn)試驗(yàn)表表5-5 t45-5 t4的的 m r tu x + + + m r tu x + + + 三點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果三點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果 類類 型型 噬菌斑數(shù)噬菌斑數(shù) % % 重組頻率重組頻率% % m-r r-tu m-tu m-r r-tu m-tu親本類型親本類型 m r tu 3467 m r tu 3467 + + + 3279 + + + 3279單交換型單交換型 m + + 520m + + 520 + r tu 474 + r tu 474單交換型單交換型 m r + 853m r + 853 + + tu 965 + + tu 965雙交換型

15、雙交換型 m + tu 162m + tu 162 + r + 172 + r + 172 合合 計(jì)計(jì) 103421034269.6%69.6%9.6% 9.6% 17.5% 17.5% 3.3% 3.3% 作圖：作圖： m m 12.912.9 r r 20.8 20.8 tu tu 27.127.112.912.920.820.825第四節(jié)第四節(jié) 噬菌體突變型的互補(bǔ)試驗(yàn)噬菌體突變型的互補(bǔ)試驗(yàn)一一 x x174174條件致死突變型的互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)條件致死突變型的互補(bǔ)測(cè)驗(yàn) 1 1 互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)原理互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)原理 在限制條件下，能長(zhǎng)出噬菌斑：在限制條件下，能長(zhǎng)出噬菌斑： 說明：兩個(gè)突變型能發(fā)生功能互補(bǔ)，是兩

16、個(gè)基因。說明：兩個(gè)突變型能發(fā)生功能互補(bǔ)，是兩個(gè)基因。 在限制條件下，不能長(zhǎng)出噬菌斑：在限制條件下，不能長(zhǎng)出噬菌斑： 說明：兩個(gè)突變型不能發(fā)生功能互補(bǔ)，是同一基因。說明：兩個(gè)突變型不能發(fā)生功能互補(bǔ)，是同一基因。 262.1 互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)原理和方法互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)原理和方法 基礎(chǔ)遺傳學(xué)研究首先須有突變型，然后基礎(chǔ)遺傳學(xué)研究首先須有突變型，然后分析突變型間的關(guān)系。重組測(cè)驗(yàn)與互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)分析突變型間的關(guān)系。重組測(cè)驗(yàn)與互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)是確定這種關(guān)系的兩個(gè)基本方法。是確定這種關(guān)系的兩個(gè)基本方法。重組測(cè)驗(yàn)以重組測(cè)驗(yàn)以遺傳圖距遺傳圖距確定突變的空間關(guān)確定突變的空間關(guān)系，而互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)則是確系，而互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)則是確定突變的功能關(guān)系定突變的功能

17、關(guān)系。27如如 rii區(qū)有區(qū)有 3 000多個(gè)突變型都有相同表型多個(gè)突變型都有相同表型. 這些這些突變型對(duì)突變型對(duì)e.coli k()寄主細(xì)胞致死寄主細(xì)胞致死，但可在，但可在e.coli b菌株細(xì)胞中增殖菌株細(xì)胞中增殖。 既然它們有相同表型，是否它們都影響同一種既然它們有相同表型，是否它們都影響同一種遺傳功能？遺傳功能？rii中這中這3 000多個(gè)突變型是屬于一個(gè)基因多個(gè)突變型是屬于一個(gè)基因還是屬于幾個(gè)基因？為劃分這種功能單位界線，要進(jìn)還是屬于幾個(gè)基因？為劃分這種功能單位界線，要進(jìn)行互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)。行互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)。28用不同用不同rll突變型成對(duì)組合同時(shí)感染大腸桿菌突變型成對(duì)組合同時(shí)感染大腸桿菌k()菌

18、菌株：株：如果被雙重感染的細(xì)菌中產(chǎn)生兩種親代基因型的如果被雙重感染的細(xì)菌中產(chǎn)生兩種親代基因型的子代噬菌體，那么必然是兩個(gè)突變型稱子代噬菌體，那么必然是兩個(gè)突變型稱彼此互補(bǔ)彼此互補(bǔ)（complementation）。）。 如果雙重感染的細(xì)菌不產(chǎn)生子代噬菌體，那么這兩如果雙重感染的細(xì)菌不產(chǎn)生子代噬菌體，那么這兩種突變型一定有一個(gè)相同功能受到損傷。種突變型一定有一個(gè)相同功能受到損傷。29 該方法測(cè)定重組頻率極敏感，重組檢出率達(dá)該方法測(cè)定重組頻率極敏感，重組檢出率達(dá)1/106，理論上可，理論上可測(cè)得測(cè)得0.002%的重組值，實(shí)際上所觀察的最小重組頻率為的重組值，實(shí)際上所觀察的最小重組頻率為0.02%。

19、根據(jù)二點(diǎn)雜交的結(jié)果，可作成連鎖圖。根據(jù)二點(diǎn)雜交的結(jié)果，可作成連鎖圖 。 30互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rii突變型可分成突變型可分成 r iia和和 r iib兩個(gè)互補(bǔ)群。兩個(gè)互補(bǔ)群。凡屬凡屬riia的突變之間不能互補(bǔ)；同理屬于的突變之間不能互補(bǔ)；同理屬于rllb的的突變之間也不能互補(bǔ)，只有突變之間也不能互補(bǔ)，只有riia的突變和的突變和rllb的突變間的突變間可互補(bǔ)，雙重感染可互補(bǔ)，雙重感染e.coli k()菌株后可產(chǎn)生子代。菌株后可產(chǎn)生子代。說明說明 r 11a和和 r 11b是兩個(gè)獨(dú)立的功能單位，分別具是兩個(gè)獨(dú)立的功能單位，分別具不同的功能，但它們又是功能互補(bǔ)的，要在不同的功

20、能，但它們又是功能互補(bǔ)的，要在.colik( )菌株中增殖，兩種功能缺一不可?？梢娋曛性鲋常瑑煞N功能缺一不可。可見r ii是由于這兩是由于這兩種遺傳功能喪失而成的。種遺傳功能喪失而成的。312.2 順反子順反子反式排列反式排列:如果分別位于兩條染色體上，組如果分別位于兩條染色體上，組合方式稱反式排列，合方式稱反式排列，順式排列順式排列:如果兩個(gè)突變同時(shí)位于一條染色如果兩個(gè)突變同時(shí)位于一條染色體上，則稱順式排列。體上，則稱順式排列。32 benzer用反式構(gòu)型檢驗(yàn)突變間的關(guān)系。在用反式構(gòu)型檢驗(yàn)突變間的關(guān)系。在互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)中兩個(gè)隱性突變?nèi)绫憩F(xiàn)出互補(bǔ)效應(yīng)，互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)中兩個(gè)隱性突變?nèi)绫憩F(xiàn)出互補(bǔ)效應(yīng)，則證明

21、這兩個(gè)突變型分屬于不同基因；如不能則證明這兩個(gè)突變型分屬于不同基因；如不能互補(bǔ)，則證明這兩個(gè)突變型在同一基因內(nèi)?；パa(bǔ)，則證明這兩個(gè)突變型在同一基因內(nèi)。反式構(gòu)型反式構(gòu)型33順式排列作對(duì)照，在順式排列中，不論是順式排列作對(duì)照，在順式排列中，不論是兩個(gè)基因的突變，還是同一個(gè)基因內(nèi)兩個(gè)兩個(gè)基因的突變，還是同一個(gè)基因內(nèi)兩個(gè)位點(diǎn)的突變，在互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)中均表現(xiàn)互補(bǔ)效位點(diǎn)的突變，在互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)中均表現(xiàn)互補(bǔ)效應(yīng)。應(yīng)。順式排列順式排列34說明基因是一個(gè)獨(dú)立功能單位：在順式排列里說明基因是一個(gè)獨(dú)立功能單位：在順式排列里兩個(gè)突變位點(diǎn)集中在一個(gè)功能單位時(shí)，另一等位基兩個(gè)突變位點(diǎn)集中在一個(gè)功能單位時(shí)，另一等位基因的功能完全正常，

22、所以表現(xiàn)互補(bǔ)；在反式排列中因的功能完全正常，所以表現(xiàn)互補(bǔ)；在反式排列中兩個(gè)等位基因各有一位點(diǎn)發(fā)生突變，都喪失功能，兩個(gè)等位基因各有一位點(diǎn)發(fā)生突變，都喪失功能，所以不能互補(bǔ)。所以不能互補(bǔ)。benzer將不同突變間沒有互補(bǔ)的功能區(qū)稱為將不同突變間沒有互補(bǔ)的功能區(qū)稱為順反子（順反子（cistron）。一個(gè)順反子就是一個(gè)功能水）。一個(gè)順反子就是一個(gè)功能水平上的基因，因此常用順反子作為基因的同義詞。平上的基因，因此常用順反子作為基因的同義詞。35第五節(jié)第五節(jié) 缺失作圖缺失作圖 benzer研究研究 r ii突變型時(shí)發(fā)現(xiàn)一些突變由于核苷突變型時(shí)發(fā)現(xiàn)一些突變由于核苷酸對(duì)發(fā)生改變，稱酸對(duì)發(fā)生改變，稱點(diǎn)突變點(diǎn)突

23、變(point mutation)。而。而另一些突變由于缺失相鄰的許多核苷酸對(duì)，稱另一些突變由于缺失相鄰的許多核苷酸對(duì)，稱缺缺失突變失突變(deletion mutation)。36 盡管兩種突變形成相同表型效應(yīng)，但有區(qū)別：盡管兩種突變形成相同表型效應(yīng)，但有區(qū)別： 點(diǎn)突變是單個(gè)位點(diǎn)突變，缺失突變是多個(gè)點(diǎn)突變是單個(gè)位點(diǎn)突變，缺失突變是多個(gè)位點(diǎn)突變（位點(diǎn)突變（multisitemutation）；）； 點(diǎn)突變可發(fā)生回復(fù)突變，而缺失突變不可點(diǎn)突變可發(fā)生回復(fù)突變，而缺失突變不可逆；逆； 點(diǎn)突變與其他點(diǎn)突變間可發(fā)生重組，而缺點(diǎn)突變與其他點(diǎn)突變間可發(fā)生重組，而缺失突變同另一個(gè)點(diǎn)突變間失突變同另一個(gè)點(diǎn)突變間

24、不能重組不能重組。一、缺失突變的特點(diǎn)一、缺失突變的特點(diǎn)37二、缺失作圖原理凡是能完成野生型功能的（互補(bǔ)的、產(chǎn)凡是能完成野生型功能的（互補(bǔ)的、產(chǎn)生噬菌體的），突變一定不在缺失區(qū)內(nèi)；生噬菌體的），突變一定不在缺失區(qū)內(nèi)；反之，突變一定在缺失區(qū)內(nèi)。反之，突變一定在缺失區(qū)內(nèi)。缺失作圖的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、精確缺失作圖的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、精確缺失作圖的條件：系列缺失突變體，限缺失作圖的條件：系列缺失突變體，限制條件制條件38三、三、 缺失作圖方法缺失作圖方法 0.5ml 0.5ml e.colie.coli b b菌株培養(yǎng)物加菌株培養(yǎng)物加1 1滴缺失型噬菌滴缺失型噬菌體和體和1 1滴待測(cè)滴待測(cè)r iir ii突變噬菌體

25、，幾分鐘后取一突變噬菌體，幾分鐘后取一滴菌液加在滅菌紙條上，鋪在長(zhǎng)有滴菌液加在滅菌紙條上，鋪在長(zhǎng)有e.colie.colik(a)k(a)菌株平板上，經(jīng)培養(yǎng)如菌株平板上，經(jīng)培養(yǎng)如39第六節(jié) -噬菌體4041 噬菌體是感染大腸桿菌的溶源性噬菌體，在噬菌體是感染大腸桿菌的溶源性噬菌體，在感染宿主后可進(jìn)入溶源狀態(tài)，也可進(jìn)入裂解感染宿主后可進(jìn)入溶源狀態(tài)，也可進(jìn)入裂解循環(huán)。循環(huán)。 噬菌體基因組為長(zhǎng)度約為噬菌體基因組為長(zhǎng)度約為 50kb 的的雙鏈雙鏈 dna 分子，實(shí)際大小為分子，實(shí)際大小為 48502bp。42 噬菌體由頭和尾構(gòu)成，其基因組組裝在頭部蛋白質(zhì)外殼內(nèi)部，其序列已被全部測(cè)出。用感染大腸桿菌的噬

26、菌體改造成的載體應(yīng)用最為廣泛。43噬菌體感染時(shí)，通過尾管將基因組dna注入大腸桿菌，而將其蛋白質(zhì)外殼留在菌外。4445 在噬菌體顆粒內(nèi)，基因組 dna 呈線性，其兩端的 5 末端帶有 12 個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈（粘性末端），稱為 cos 位點(diǎn)；柯斯質(zhì)粒 (cosmid ， cos) ，由質(zhì)粒和 dna 的 cos 序列組成?？滤官|(zhì)粒比噬菌體 具有更大的克隆能力，在真核基因的克隆中起到巨大的作用。 它的序列為 5-gggcggcgacct-3。當(dāng) 噬菌體 dna 進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其兩端互補(bǔ)單鏈通過堿基配對(duì)形成環(huán)狀 dna 分子，而后在宿主細(xì)胞的 dna 連接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封閉

27、的環(huán)狀 dna 分子，充當(dāng)轉(zhuǎn)錄的模板。46 可選擇進(jìn)入裂解生長(zhǎng)狀態(tài)（lytic growth），大量復(fù)制并組裝成子代 噬菌體顆粒，導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解。經(jīng)過 4045min 的生長(zhǎng)循環(huán)，釋放出約 100 個(gè)感染性噬菌體顆粒（每個(gè)細(xì)胞）； 或者進(jìn)入溶源狀態(tài)（lysogenic state），將噬菌體基因組 dna 通過位點(diǎn)專一性重組整合到宿主的染色體 dna 中，并隨宿主的繁殖傳給子代細(xì)胞。 47噬菌體基因組的結(jié)構(gòu)噬菌體基因組的結(jié)構(gòu) 由于噬菌體既可以進(jìn)行裂解生長(zhǎng)，又可以進(jìn)入溶源化狀態(tài)，因此噬菌體基因組的結(jié)構(gòu)是與它的這些特性相適應(yīng)的，其中一些基因決定裂解生長(zhǎng)，另一些基因決定噬菌體的溶源化，甚至還有一些

28、基因可對(duì)這兩種狀態(tài)的轉(zhuǎn)變行使調(diào)解作用。這是怎么發(fā)生的呢？噬菌體基因結(jié)構(gòu)噬菌體基因結(jié)構(gòu)48 根據(jù)根據(jù)dna的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可將的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可將66個(gè)可編碼的基因個(gè)可編碼的基因分成分成3個(gè)功能區(qū)（個(gè)功能區(qū)（function block）：）： 右邊的功能區(qū)參與衣殼形成和右邊的功能區(qū)參與衣殼形成和dna的復(fù)制，稱為的復(fù)制，稱為右操縱子區(qū)右操縱子區(qū)； 左邊的功能區(qū)與裂解生長(zhǎng)和溶源化功能有關(guān)，稱左邊的功能區(qū)與裂解生長(zhǎng)和溶源化功能有關(guān)，稱為為左操縱子區(qū)左操縱子區(qū)；中央功能區(qū)是中央功能區(qū)是基因組調(diào)控基因組調(diào)控操縱子區(qū)操縱子區(qū)，也稱為也稱為免疫操免疫操縱子區(qū)縱子區(qū)。(見下圖見下圖)噬菌體基因組的結(jié)構(gòu)噬菌體基因組的

29、結(jié)構(gòu)4950 a至至為構(gòu)成衣殼蛋白的基因，為構(gòu)成衣殼蛋白的基因，其中其中s，基因與裂解作用有關(guān)。基因與裂解作用有關(guān)。右操右操縱縱子子區(qū)區(qū)51右操縱子52 ci 為為阻遏物基因，其基因產(chǎn)物是阻遏物基因，其基因產(chǎn)物是噬噬菌體基因組早期轉(zhuǎn)錄的阻遏物；菌體基因組早期轉(zhuǎn)錄的阻遏物；cro為操縱為操縱基因基因ol和和or的抑制物基因，其蛋白產(chǎn)物通的抑制物基因，其蛋白產(chǎn)物通過過or可抑制左向可抑制左向ci基因的轉(zhuǎn)錄。基因的轉(zhuǎn)錄。cii基因產(chǎn)基因產(chǎn)物能激活和物能激活和int轉(zhuǎn)錄，與轉(zhuǎn)錄，與噬菌體進(jìn)入或維持噬菌體進(jìn)入或維持溶源化狀態(tài)有關(guān)。溶源化狀態(tài)有關(guān)。中央操縱子區(qū)5354 n是抗轉(zhuǎn)錄終止基因，是抗轉(zhuǎn)錄終止基因

30、，n基因產(chǎn)物能拮基因產(chǎn)物能拮抗早期轉(zhuǎn)錄終止子抗早期轉(zhuǎn)錄終止子tr1，tr2和和tl1，tl2，使，使pl和和pr的轉(zhuǎn)錄作用各自越過終止子區(qū)而繼的轉(zhuǎn)錄作用各自越過終止子區(qū)而繼續(xù)向左和向右進(jìn)行延伸轉(zhuǎn)錄。續(xù)向左和向右進(jìn)行延伸轉(zhuǎn)錄。左操縱子區(qū)55左操縱子56 int是整合酶基因，是整合酶基因， int 基因產(chǎn)物能識(shí)別宿主細(xì)基因產(chǎn)物能識(shí)別宿主細(xì)胞染色體胞染色體dna和噬菌體基因組上相應(yīng)的和噬菌體基因組上相應(yīng)的att位點(diǎn)，位點(diǎn)，并能催化二者的斷裂和再連接。并能催化二者的斷裂和再連接。 att位點(diǎn)稱為附著位點(diǎn)，在宿主細(xì)胞位點(diǎn)稱為附著位點(diǎn)，在宿主細(xì)胞dna上稱為上稱為attb，在噬菌體，在噬菌體dna上稱為上

31、稱為attp， attb和和attp位點(diǎn)位點(diǎn)分別有一段由分別有一段由15bp組成的同源核苷酸序列，借助同組成的同源核苷酸序列，借助同源性重組作用可使噬菌體基因組插入到宿主的染色源性重組作用可使噬菌體基因組插入到宿主的染色體體dna上。上。xis為切除酶基因。為切除酶基因。 int和和xis基因產(chǎn)物共同作用，能使基因產(chǎn)物共同作用，能使att位點(diǎn)發(fā)生重組，位點(diǎn)發(fā)生重組，并將原噬菌體基因組并將原噬菌體基因組dna從宿主染色體中切割下來，從宿主染色體中切割下來，使使噬菌體進(jìn)入裂解過程。在左區(qū)還有噬菌體進(jìn)入裂解過程。在左區(qū)還有c 基因，基因，它的基因產(chǎn)物可行使它的基因產(chǎn)物可行使c的功能，即激活的功能，即

32、激活c和int的轉(zhuǎn)錄。5758三.噬菌體溶源化狀態(tài)的建立59 pl 、 pr ：左右向轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子：左右向轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子prm : c蛋白基因維持啟動(dòng)子，受蛋白基因維持啟動(dòng)子，受c濃度調(diào)控濃度調(diào)控c蛋白：是蛋白：是pl、pr的主要阻遏物，并可自主調(diào)的主要阻遏物，并可自主調(diào)控控prmcro蛋白：蛋白： pl 、 pr的阻遏蛋白，并可抑制的阻遏蛋白，并可抑制prm，抑制抑制c表達(dá)表達(dá) 60 噬菌體裂解生長(zhǎng)與溶源化的建立取決于兩種阻遏蛋白噬菌體裂解生長(zhǎng)與溶源化的建立取決于兩種阻遏蛋白c和和cro的合成。當(dāng)?shù)暮铣?。?dāng)c蛋白的合成占優(yōu)勢(shì)時(shí)，蛋白的合成占優(yōu)勢(shì)時(shí)， prm被激活，被激活，c蛋白繼續(xù)起始合成，因

33、而溶源化狀態(tài)建立；相反蛋白繼續(xù)起始合成，因而溶源化狀態(tài)建立；相反cro蛋白合蛋白合成占優(yōu)勢(shì)，則成占優(yōu)勢(shì)，則prm被抑制，沒有被抑制，沒有c蛋白的合成，于是蛋白的合成，于是噬菌體噬菌體在在 cro蛋白的控制下進(jìn)入裂解生長(zhǎng)。蛋白的控制下進(jìn)入裂解生長(zhǎng)。c cro 溶源；溶源； c cro 溶菌溶菌自課本p58961 噬菌體進(jìn)入細(xì)菌后成環(huán)狀。由于噬菌體進(jìn)入細(xì)菌后成環(huán)狀。由于dna上無調(diào)上無調(diào)節(jié)蛋白。寄主節(jié)蛋白。寄主rna 聚合酶分別結(jié)合于聚合酶分別結(jié)合于pl和和pr。 pr轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄cro蛋白。蛋白。pl轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生抗終止蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生抗終止蛋白n。62 在抗終止蛋白在抗終止蛋白n的幫助下，轉(zhuǎn)錄翻譯出的幫助下，轉(zhuǎn)錄翻譯出c、c蛋蛋白。白。 在在c、c蛋白作用下，蛋白作用下，pre（ pre主管建主管建立溶源，立溶源，repressor for establishment of lysogeny，位于，位于cro和和c之間）的操縱子向左之間）的操縱子向左轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄c基因，產(chǎn)生基因，產(chǎn)生c蛋白。蛋白。 c、c蛋白活化pre63 1c 2cro3 orprprmprec+cpl(n)pl+pr64五、裂解周期的建立五、裂