實(shí)驗(yàn)二血清γ球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚課件

1、實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 血清血清球蛋白的分球蛋白的分離純化與鑒定離純化與鑒定實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚層析技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)思路實(shí)驗(yàn)流程及操作注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚層層 析析 技技 術(shù)術(shù)1 1層析法層析法：又稱色譜法：又稱色譜法，是一種廣泛運(yùn)用的物質(zhì)，是一種廣泛運(yùn)用的物質(zhì)分離純化、分析鑒定技術(shù)分離純化、分析鑒定技術(shù). .實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚2.2. 依據(jù)依據(jù)：混合物中各組：混合物中各組分的理化性質(zhì)差異分的理化性質(zhì)差異吸附吸附力、分子形狀、大小、酸力、分子形狀、大小、酸堿性或分子極性、分子親堿性或分子極性、分

2、子親和力以及分配系數(shù)。和力以及分配系數(shù)。實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚固定相固定相固定不動固定不動流動相流動相對固定相作單向相對運(yùn)動，對固定相作單向相對運(yùn)動，推動樣品中各組分通過固定相向前移推動樣品中各組分通過固定相向前移動。各組分理化性質(zhì)不同，對流動相動。各組分理化性質(zhì)不同，對流動相和固定相具有不同的作用力，因此在和固定相具有不同的作用力，因此在流動相推動樣品通過固定相的過程中流動相推動樣品通過固定相的過程中，通過不斷地吸附、解吸、吸附、解，通過不斷地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各組分在固定吸作用，造成混合物中各組分在固定相中的遷移距離不等，達(dá)到分離。相中的遷移距離不等

3、，達(dá)到分離。3 3基本原理基本原理：固定相和流動相：固定相和流動相實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚4 4分類分類：流動相的物理狀態(tài)：氣相和液相流動相的物理狀態(tài)：氣相和液相 氣液氣液/ /固，固，液固液固/ /液液方式：紙、薄層、方式：紙、薄層、柱柱原理：吸附、分配、原理：吸附、分配、凝膠凝膠、離子交、離子交換、親和、金屬螯合、疏水、反相換、親和、金屬螯合、疏水、反相實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚5 5凝膠層析凝膠層析( (凝膠過濾、凝膠色譜、分凝膠過濾、凝膠色譜、分子篩層析、分子排阻層析子篩層析、分子排阻層析) )定義定義：指混合物隨流動相：指混合物隨流動相流經(jīng)固定相的層析柱

4、時(shí)，混流經(jīng)固定相的層析柱時(shí)，混合物中各組分按其合物中各組分按其分子大小分子大小不同不同而被分離的技術(shù)。而被分離的技術(shù)。實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚基本原理：基本原理：固定相固定相：凝膠，惰性三維空間多孔：凝膠，惰性三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故稱分子篩，包括瓊脂網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故稱分子篩，包括瓊脂糖、糖、交聯(lián)葡聚糖交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺、瓊、聚丙烯酰胺、瓊脂糖脂糖- -葡聚糖復(fù)合凝膠。葡聚糖復(fù)合凝膠。流動相流動相：洗脫液：洗脫液實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚交聯(lián)葡聚糖凝膠交聯(lián)葡聚糖凝膠多聚葡萄糖與環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)多聚葡萄糖與環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)珠狀顆粒，商品名為珠狀顆

5、粒，商品名為Sephadex GSephadex G系列系列G G交聯(lián)度：交聯(lián)度：G G后面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示不同的后面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示不同的規(guī)格型號，有規(guī)格型號，有G-10G-10，G-15G-15，G-25G-25，G-50G-50，G-G-7575，G-100G-100，G-150G-150，和，和G-200G-200八種，具體含義八種，具體含義為凝膠得水值的為凝膠得水值的1010倍或吸水量（倍或吸水量（g g）/10g/10g干膠干膠交聯(lián)度與孔徑大小成反比：交聯(lián)度越大，孔交聯(lián)度與孔徑大小成反比：交聯(lián)度越大，孔徑越小，吸水性??；交聯(lián)度越小，孔徑越大徑越小，吸水性小；交聯(lián)度越小，孔徑越大，吸

6、水性大。因此，吸水性大。因此，“G G”反映凝膠的交聯(lián)程反映凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。度，膨脹程度及分部范圍。實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚長鏈狀葡聚糖分子間以環(huán)氧丙烷連接長鏈狀葡聚糖分子間以環(huán)氧丙烷連接實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚凝膠層析的基本原理凝膠層析的基本原理樣品加于柱上，樣品隨洗脫液的流動而向下移動，同時(shí)作垂直向下運(yùn)動和不定向擴(kuò)散運(yùn)動小分子可進(jìn)入凝膠空內(nèi)部，流程長，速度慢，后流出；大分子不能進(jìn)入凝膠空內(nèi)部，顆粒間移動，流程短，先流出大小分子彼此分開 實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脫開始，小分子擴(kuò)散進(jìn)人凝膠顆

7、粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3 大小分子分開： 4大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進(jìn)行中實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚數(shù)學(xué)模型 Vo Vi VtViVi凝膠孔內(nèi)水（內(nèi)水）凝膠孔內(nèi)水（內(nèi)水）VoVo顆粒間水（外水）顆粒間水（外水）VgVg凝膠體積凝膠體積總體積總體積VtVt= = Vi Vi + +VoVo+ +VgVg實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚KdKd分配系數(shù)：精確衡量混合物分配系數(shù)：精確衡量混合物中某一待分離成分在凝膠柱內(nèi)的洗中某一待分離成分在凝膠柱內(nèi)的洗脫行為，反映物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆脫行為，反映物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒的程度，是溶質(zhì)分子大小的一個(gè)粒的程度，是

8、溶質(zhì)分子大小的一個(gè)函數(shù)函數(shù)VeVe洗脫體積：分離物被洗脫時(shí)洗脫體積：分離物被洗脫時(shí)所用的洗脫液體積所用的洗脫液體積 VeVe= =VoVo+ +KdKdViVi 洗脫曲線：以洗脫體積為橫坐標(biāo)洗脫曲線：以洗脫體積為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)濃度，各物質(zhì)濃度/ /吸光度為縱坐標(biāo)作吸光度為縱坐標(biāo)作圖圖實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚（1 1）完全被排阻的極端大分子，）完全被排阻的極端大分子，VeVe= =VoVo，KdKd=0=0（2 2）中等分子，）中等分子，VeVe= =VoVo+ +KdKdViVi，00KdKd111實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚

9、影響因素影響因素* *層析柱的選擇及裝填：層析柱的選擇及裝填：柱大小柱大小分離樣品量分離樣品量凝膠型號凝膠型號分辨率：各種分子篩的分辨率：各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。凝膠分離范圍之極限和最小極限。凝膠分離范圍之外的分子，難以分離。如大小不同外的分子，難以分離。如大小不同的兩種全排阻分子的兩種全排阻分子/ /完全滲透分子。完全滲透分子。* *洗脫液：溶解待分離物質(zhì)，不變性洗脫液：溶解待分離物質(zhì)，不變性* *加樣量：加樣量：1%1%5%5%* *凝膠的再生凝膠的再生實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚凝膠型號凝膠型號顆粒大?。w粒大小

10、（m)m)溶脹體積溶脹體積(ml/g)(ml/g)分離范圍（分離范圍（MrMr）G-10G-1040401201202 23 37 710102 2G-15G-1550501501502.52.53.5 3.5 1.51.510103 3G-25G-2550501501504 46 61 110103 3 5 510103 3G-50G-5040401201209 911111.51.510103 3 3 310104 4G-75G-754040120120121215153 310103 3 8 810104 4G-100G-1004040120120151520204 410103 3 1

11、 110105 5交聯(lián)葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)技術(shù)參數(shù)交聯(lián)葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)技術(shù)參數(shù)實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理透析及超濾法鹽析、有機(jī)溶劑/免疫沉淀電泳凝膠層析離子交換層析超離心實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚共性共性：* *生命高分子：透析、超濾、超離心、生命高分子：透析、超濾、超離心、凝膠凝膠層析層析* *蛋白質(zhì)溶液是親水膠體：穩(wěn)定因素為水化蛋白質(zhì)溶液是親水膠體：穩(wěn)定因素為水化膜和電荷膜和電荷鹽析鹽析/ /有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀* *兩性電解質(zhì)和等電點(diǎn)：兩性電解質(zhì)和等電點(diǎn)：pH pIpH pI，蛋白質(zhì)帶，蛋白質(zhì)帶負(fù)電；反之帶正電負(fù)電；反之帶正電電

12、泳、離子交換層析電泳、離子交換層析 * *有一定的功能：抗原性有一定的功能：抗原性 免疫沉淀免疫沉淀 個(gè)性個(gè)性：蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、親水程度：蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、親水程度、形狀不同、形狀不同分離依據(jù)：蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的共性和個(gè)性分離依據(jù)：蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的共性和個(gè)性實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚 清蛋白清蛋白 pI=4.9 57%pI=4.9 57%72%72% 1 2% 1 2%5%5% 2 pI6 4% 2 pI6 4%9%9% 6.5% 6.5%12%12% pI=7.3 2% pI=7.3 2%20%20%球蛋白球蛋白實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚實(shí)驗(yàn)思路實(shí)驗(yàn)思

13、路兩步鹽析去除雜蛋白兩步鹽析去除雜蛋白凝膠層析脫鹽凝膠層析脫鹽交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮醋酸纖維素薄膜電泳鑒定醋酸纖維素薄膜電泳鑒定上午完成下午完成先先粗粗后后細(xì)細(xì)實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚分段鹽析：分段鹽析：常用中性鹽：常用中性鹽：硫酸銨硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。、磷酸鈉等。 硫酸銨硫酸銨：溫度系數(shù)小，溶解度大，蛋白譜廣，分：溫度系數(shù)小，溶解度大，蛋白譜廣，分段鹽析效果好，不易引起變性。溶液段鹽析效果好，不易引起變性。溶液pHpH約約4.54.55.55.5，可用硫酸，可用硫酸/ /氨水按需要調(diào)節(jié)氨水按需要調(diào)節(jié)pHpH值。值。分

14、段鹽析：各種蛋白大小、親水程度、分段鹽析：各種蛋白大小、親水程度、pIpI不同，不同，所需的鹽濃度、所需的鹽濃度、pHpH也不一樣。如清蛋白分子小，也不一樣。如清蛋白分子小，親水性強(qiáng)，需高鹽濃度才沉淀，球蛋白分子大，親水性強(qiáng)，需高鹽濃度才沉淀，球蛋白分子大，親水性弱，較低鹽濃度即可沉淀。因此調(diào)節(jié)鹽濃親水性弱，較低鹽濃度即可沉淀。因此調(diào)節(jié)鹽濃度及度及pHpH可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。實(shí)驗(yàn)流程及操作注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)流程及操作注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚影響因素：影響因素：溫度：溫度與溶解度成正比。一般室溫度：溫度與溶解度成正比。一般室溫即可溫即可, ,少數(shù)溫度

15、敏感型蛋白質(zhì)需少數(shù)溫度敏感型蛋白質(zhì)需4 4度操度操作，而血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白在作，而血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白在2525度比度比0 0度時(shí)溶解度低，更易鹽析。度時(shí)溶解度低，更易鹽析。pHpH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在pIpI時(shí)溶解度最時(shí)溶解度最低。低。pH=pIpH=pI效果更好。效果更好。蛋白質(zhì)濃度：濃度高時(shí)產(chǎn)生共沉。鹽蛋白質(zhì)濃度：濃度高時(shí)產(chǎn)生共沉。鹽析前血清加等量生理鹽水稀釋，控制蛋析前血清加等量生理鹽水稀釋，控制蛋白質(zhì)含量在白質(zhì)含量在2.5-3.0%2.5-3.0%。實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚凝膠層析脫鹽：常用透析，需時(shí)較長凝膠層析脫鹽：常用透析，需時(shí)較長，

16、最好低溫。也可用葡萄糖凝膠，最好低溫。也可用葡萄糖凝膠G-G-25/5025/50過柱，用時(shí)較短。過柱，用時(shí)較短。固定相：固定相：sephadex G-25sephadex G-25流動相：流動相：pH7.4pH7.4的的0.01M0.01M磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽緩沖液（0.9%NaCl0.9%NaCl）原理同前，蛋白質(zhì)大分子，硫酸銨小分原理同前，蛋白質(zhì)大分子，硫酸銨小分子。子。 實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚濃縮：濃縮：sephadex G-25sephadex G-25吸水，利吸水，利用高分子性質(zhì)。用高分子性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1 1硫酸

17、銨的滴加，邊搖邊逐滴加入硫酸銨的滴加，邊搖邊逐滴加入2 2流洗柱子：流洗柱子：3 34 4個(gè)柱長個(gè)柱長3 3上樣：轉(zhuǎn)圈滴加，起跑線一致上樣：轉(zhuǎn)圈滴加，起跑線一致4 4防止柱上液層干涸防止柱上液層干涸5 5洗脫液收集無需分部，用載玻片檢洗脫液收集無需分部，用載玻片檢測蛋白，無納氏試劑測蛋白，無納氏試劑6 6G-25G-25干膠用紙條少量多次加入，液干膠用紙條少量多次加入，液層高層高0.5mlPI PH=PI PHPI電泳用于分離物質(zhì)的原理：電泳用于分離物質(zhì)的原理：實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，有一定的等電點(diǎn)，在大于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場中向陽極移動，由于各種

18、蛋白質(zhì)的分子大小與結(jié)構(gòu)不同，所帶表面電荷的多少不同，因而在電場中向陽極移動的速度不同。經(jīng)過一定的電泳時(shí)間后可形成許多蛋白質(zhì)區(qū)帶，每一個(gè)區(qū)帶代表一組遷移率相近似的蛋白質(zhì)。 實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳介質(zhì)：醋酸纖維素薄膜，纖維素的介質(zhì)：醋酸纖維素薄膜，纖維素的羥基經(jīng)乙?；纬傻睦w維素醋酸羥基經(jīng)乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。溶于有機(jī)溶劑后涂成薄膜，具酯。溶于有機(jī)溶劑后涂成薄膜，具均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，有強(qiáng)滲透性。均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，有強(qiáng)滲透性。 電泳緩沖液：電泳緩沖液：pH8.6pH8.6的巴比妥緩沖的巴比妥緩沖液液實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚

19、 清蛋白清蛋白 pI=4.9 57%pI=4.9 57%72%72% 1 2% 1 2%5%5% 2 pI6 4% 2 pI6 4%9%9% 6.5% 6.5%12%12% pI=7.3 2% pI=7.3 2%20%20%球蛋白球蛋白實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚 清蛋白清蛋白 1 1 2 2 清蛋白（清蛋白（albuminalbumin，A A）：）：383848g/L48g/L球蛋白（球蛋白（globulinglobulin，G G）：）：151530g/L30g/LA/GA/G：正常值：正常值1.51.52.52.5實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚 清蛋白清蛋白 1 2 加樣線加樣線加樣線加樣線純化蛋白純化蛋白對照對照樣品樣品實(shí)驗(yàn)二血清球蛋白的分離純化與鑒定by陳蔚【操作步驟操作步驟】1