古細菌的研究

1、古菌是最古老的生命體，古菌一些奇特的生活習(xí)性和與此相關(guān)的潛在生物技術(shù)開發(fā)前景，長期以來一直吸引著許多人的注意。古菌常被發(fā)現(xiàn)生活于各種極端自然環(huán)境下，如大洋底部的高壓熱溢口、熱泉、鹽堿湖等。 目錄古菌的特點 1.形態(tài)2.細胞結(jié)構(gòu) 3.代謝 4.呼吸類型 5.繁殖方式 6.生活習(xí)性古菌的分類 1. 產(chǎn)甲烷古細菌2. 嗜熱嗜酸古細菌3. 極端嗜鹽古細菌具體展開a.基礎(chǔ)研究b.理化性質(zhì)c.研究發(fā)展的歷史d.培養(yǎng)方式e.前沿科技研究.古菌的特點形態(tài)古菌的細胞形態(tài)有球形、桿狀、螺旋形、耳垂形、盤狀、不 規(guī)則形狀、多形態(tài)，有的很薄、扁平，有的有精確的方角和垂直的邊構(gòu)成直角幾何形態(tài)，   

2、古菌(p1)有的以單個細胞存在，有的呈絲狀體或團聚體。其直徑大小一般在0.115m，絲狀體長度有200m。 細胞結(jié)構(gòu)古菌的細胞結(jié)構(gòu)與細菌不同，如古菌的細胞外膜就與細菌不同。 大多數(shù)古菌的細胞壁不含二氨基庚二酸（D氨基酸）和胞壁酸，不受溶菌酶和內(nèi)酰胺抗生素如青霉素的作用。革蘭氏陽性古菌的細胞壁含有各種復(fù)雜的多聚體，如產(chǎn)甲烷菌的細胞壁含假肽聚糖，甲烷八疊球菌和鹽球菌不含假肽聚糖，而含復(fù)雜聚多糖。革蘭氏陰性古菌沒有外膜，含蛋白質(zhì)或糖蛋白亞基的表層，其厚度在2040nm。甲烷葉菌屬、鹽桿菌屬和極端嗜熱的硫化葉菌屬、熱變形菌屬和熱網(wǎng)菌屬的細胞壁有糖蛋白；甲烷球菌屬、甲烷微菌屬、產(chǎn)甲烷菌屬和極端嗜熱的脫硫

3、球菌屬有蛋白質(zhì)壁，蛋白質(zhì)呈酸性。 古菌的細胞膜所含脂質(zhì)與細菌的很不同，細菌的脂類是甘油脂肪酸酯，而古菌的脂質(zhì)是非皂化性甘油二醚的磷脂和糖脂的衍生物。古菌的細胞膜有兩種：雙層膜和單層膜。 代謝古菌在代謝過程中，有許多特殊的輔酶。古菌因有5個類群，所以，它們的代謝呈多樣性。古菌中有異養(yǎng)型、自養(yǎng)型和不完全光合作用3種類型。 呼吸類型古菌多數(shù)為嚴(yán)格厭氧、兼性厭氧，還有專性好氧。   古菌(p2)繁殖方式古菌的繁殖方式有二分裂、芽殖。其繁殖速度較慢，進化速度也比細菌慢。 生活習(xí)性大多數(shù)古菌生活在極端環(huán)境，如鹽分高的湖泊水中，極熱、極酸和絕對厭氧的環(huán)境，有的在極冷的環(huán)境生存。 總述：

4、古細菌是最古老的生命體，他們一些奇特的生活習(xí)性和與此相關(guān)的潛在生物技術(shù)開發(fā)前景，長期以來一直吸引著許多人的注意。“古細菌”這個概念是1977年由卡爾·沃斯和George Fox提出的，原因是它們在16SrRNA的系統(tǒng)發(fā)生樹上和其它原核生物的區(qū)別。這兩組原核生物起初被定為古細菌（Archaebacteria）和真細菌（Eubacteria）兩個界或亞界。Woese認(rèn)為它們是兩支根本不同的生物，于是重新命名其為古菌（Archaea）和細菌（Bacteria），這兩支和真核生物（Eukarya）一起構(gòu)成了生物的三域系統(tǒng)。 如果將地球約46億年的年齡比作一年，那么古菌早在3月20日就出現(xiàn)了，

5、而人類誕生不過是12月31日的事。它們多生長于極端環(huán)境，如熱泉、高壓的海底火山口、鹽湖等。 按照古菌的生活習(xí)性和生理特性，古菌可分為三大類型：產(chǎn)甲烷菌、嗜熱嗜酸菌、極端嗜鹽菌。本文將著重探討產(chǎn)甲烷菌，極端嗜鹽菌兩種古細菌，探討其基礎(chǔ)研究，理化性質(zhì)，研究發(fā)展的歷史，培養(yǎng)方式以及前沿科技研究。具體展開：產(chǎn)甲烷古細菌一 基礎(chǔ)研究產(chǎn)甲烷菌（Methanogenus），是專性厭氧菌，屬于古菌域，廣域古菌界，寬廣古生菌門。1974年伯杰氏細菌鑒定手冊（第八版）中將其歸屬于1科、3屬、9種。截至1992年已發(fā)展為3目、7科、19屬、70種。截至2009年已發(fā)展為4目、12科、31屬。 產(chǎn)甲烷菌的細胞結(jié)構(gòu)：細

6、胞封套（包括細胞壁、表面層、鞘和莢膜）、細胞質(zhì)膜、原生質(zhì)和核質(zhì)。 產(chǎn)甲烷菌有革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，它們的細胞壁結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分有所不同。也是與真細菌的區(qū)別點。其中細胞封套分為以下四種：（p3）產(chǎn)甲烷古細菌的形態(tài) (p4) 產(chǎn)甲烷古細菌的形態(tài) （表1）古細菌，真細菌與真核生物的比較 A. 大多數(shù)G+產(chǎn)甲烷菌的細胞壁在結(jié)構(gòu)上與G+真細菌相似，細胞壁有一層和三層的，單層的厚度為1020nm，如甲烷桿菌屬與甲烷短桿菌屬。巴氏甲烷八疊球菌的細胞壁只有一層，厚約200nm。它們化學(xué)成分與G+真細菌的不同，不含細胞壁（即不含二胺基庚二酸或細胞酸）而是假細胞壁質(zhì)或是未硫酸化的異多糖。三層的細胞壁壁厚為20

7、30nm，有內(nèi)層、中層和外層。外層在細胞分裂橫隔形成時消失，如瘤胃甲烷短桿菌。 B. G+的熾熱高溫甲烷菌的細胞壁外有一層六角形的蛋白質(zhì)亞基即S層覆蓋。 C. G-產(chǎn)甲烷菌不具有球囊多聚物或外膜。只有一層六角形或四角形的，由蛋白質(zhì)亞基或糖蛋白亞基組成的S層。 D. 甲烷螺菌的細胞質(zhì)膜外只有一層由蛋白纖維組成的鞘包裹幾個細胞。其厚度為10nm。 二.理化性質(zhì) (p5)產(chǎn)甲烷古細菌A.營養(yǎng)特性：甲烷細菌的能源和碳源物質(zhì)主要有5種，即H2/CO2、甲酸、甲醇、甲胺和乙酸。 B.特殊輔酶：F420：是黃素單核甘酸的類似物，分子量為630的低分子量熒光化合物。它是甲烷細菌持有的輔酶，在形成甲烷過程中起著

8、重要作用。 其特點：(1)當(dāng)用420nm波長的紫外光照射時，能產(chǎn)生自發(fā)藍綠熒光，這一現(xiàn)象可借以鑒定甲烷細菌的存在。（2）中性或堿性條件下易被好氧光解，并使酶失活。 （p6） 發(fā)酵型古細菌C.2-硫基乙烷磺酸. 其特點：（1）它是甲烷細菌獨有的輔酶，可借以鑒定甲烷細菌的存在。（2）它在甲烷形成過程中，起著轉(zhuǎn)移甲基的重要功能。（3）其具有RPG效應(yīng).。即促進CO2還原為CH4的效應(yīng)。 D.氧化還原電位：參與中溫消化的甲烷細菌要求環(huán)境中應(yīng)維持的氧化還原電位應(yīng)低于一350mV；對參與高溫消化的甲烷細菌則應(yīng)低于-500-600mV。 E.溫度：低溫菌的適應(yīng)范圍為2025°C，中溫菌為3045&

9、#176;C，高溫菌為4575°C。 F.PH：大多數(shù)中溫甲烷細菌的最適pH值范圍約在6.87.2之間。 三.研究發(fā)展的歷史1979年，Balch和Wolfe通過16S rRNA測序 將產(chǎn)甲烷菌發(fā)展為3目（甲烷桿菌目、甲烷球菌目、甲烷微菌目）4科7屬14種。 1993年，Boone將甲烷八疊球菌科上升為一個目，建立了火熱產(chǎn)甲烷菌目，至此產(chǎn)甲烷菌發(fā)展為5目10科25屬59種。 2001年，Bergey's Manual of Systematic Bacteriology將產(chǎn)甲烷菌放在寬廣古生菌門（Euryarchaeota）中，至此產(chǎn)甲烷菌發(fā)展為3綱，5目，10科，26屬，7

10、8種。 產(chǎn)甲烷菌屬于古菌域（Archaea），廣域古菌界（Euryarchaeon），寬廣古生菌門（Euryarchaeota）。 人們對產(chǎn)甲烷菌的認(rèn)識約有150年的歷史。人們對產(chǎn)甲烷菌有極大的興趣是在于產(chǎn)甲烷菌對天然氣的形成，在自然界與水解菌和產(chǎn)酸菌等協(xié)同作用，使有機物甲烷化，產(chǎn)生有經(jīng)濟價值的生物能物質(zhì)甲烷。 四.培養(yǎng)方式(p7)產(chǎn)甲烷古細菌群產(chǎn)甲烷菌是專性厭氧菌，它分離和培養(yǎng)等的操作均需要在特殊環(huán)境和用特殊的技術(shù)進行。 A.培養(yǎng)方法分類一般要求不高的可用在液面加石蠟或液體石蠟的液體深層培養(yǎng)法、抽真空的培養(yǎng)法、在封閉培養(yǎng)管中放入焦性沒食子酸和碳酸鉀除去氧的培養(yǎng)方法（Berker）、Hunga

11、te的厭氧滾管法、Hungate的厭氧液體培養(yǎng)法、Balch的厭氧液體培養(yǎng)增壓法等。 B.具體方法介紹目前最好的是厭氧手套箱，它由四部分組成： .附有手套的密閉透明薄膜箱 .附有兩個可開啟的可抽真空的金屬空氣隔離箱 .真空泵 .氫和高純氮的供應(yīng)系統(tǒng) 利用厭氧手套箱可做許多工作，如：分裝厭氧培養(yǎng)基，倒制平板，離心厭氧微生物收集菌體，對氧敏感的酶和輔酶的分離純化，進行電泳、厭氧性生物化學(xué)反應(yīng)和遺傳學(xué)研究等。 五.前沿科技研究摘要產(chǎn)甲烷菌是重要的環(huán)境微生物, 在自然界的破素循環(huán)中起重要作用。迄今已有種產(chǎn)甲烷菌基因組測序完成。基因組信息使人們對產(chǎn)甲烷菌的細胞結(jié)構(gòu)、進化、代謝及環(huán)境適應(yīng)性有了更深的理解。

12、目前已知的甲烷生物合成途徑有種, 它們以乙酸、甲基化合物、氮二氧化破為起始, 通過不同的反應(yīng)途徑都形成了甲基輔酶, 在甲基輔醉還原酶的催化下最終形成甲烷。關(guān)鍵詞 產(chǎn)甲烷菌 分類基因組 甲烷合成機制產(chǎn)甲烷菌是一類能夠?qū)o機或有機化合物厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化成甲烷和二氧化碳的古細菌, 它們生活在各種自然環(huán)境下, 甚至在一些極端環(huán)境中。產(chǎn)甲烷菌是厭氧發(fā)酵過程的最后一個成員, 甲烷的生物合成是自然界碳素循環(huán)的關(guān)鍵鏈條。由于產(chǎn)甲烷菌在有機廢棄物處理、沼氣發(fā)酵、動物瘤胃中有機物分解利用等過程中的重要作用, 同時甲烷是導(dǎo)致全球變暖的第二大溫室氣體, 因此產(chǎn)甲烷菌和甲烷產(chǎn)生機理的研究備受關(guān)注。特別是近幾年對產(chǎn)甲烷菌基因

13、組的研究, 使人們從全因組的角度、進化的角度對甲烷生物合成機理、甲烷菌的生活習(xí)性、形態(tài)結(jié)構(gòu)等獲得更深刻的理解。 產(chǎn)甲烷菌生活在各種厭氧環(huán)境中, 甚至在一些極端環(huán)境中, 這種適應(yīng)性是長期進化的結(jié)果。同時產(chǎn)甲烷菌中存在各種機制以調(diào)節(jié)自身適應(yīng)環(huán)境。比如甲烷八疊球菌, 它們生活淡水、海底沉積物、腐敗的葉子、土壤、油井、下水道污物、動物排泄物等環(huán)境中。甲烷八球菌基因組中含有大量表面蛋白基因, 可以形成具有保護作用的英膜它是古細菌中唯一可多細胞結(jié)構(gòu)的物種,因此提供了一個良好的用于研究多細胞形成機制的模型。在不同的生長段和不同的環(huán)境條件下甲烷八疊球菌處于不同的細胞形態(tài)。在脅迫環(huán)境下, 多細胞結(jié)構(gòu)形成提高適應(yīng)

14、環(huán)境能力起到關(guān)鍵作用。產(chǎn)甲烷菌和其它物種一樣具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的二元調(diào)控系統(tǒng)一, 飛 ,但它及其它古細菌的二元調(diào)控系統(tǒng)與已經(jīng)研究清楚的細菌的二元調(diào)控系統(tǒng)有很大不同。細菌的二元系統(tǒng)由組氨酸激酶和響應(yīng)調(diào)控蛋白印、。按的比例組成, 而且響應(yīng)調(diào)控蛋白一般具有一個效應(yīng)域, 。在產(chǎn)甲烷菌及其它古細菌基因組中的響應(yīng)調(diào)控蛋白一般含有響應(yīng)調(diào)控域, 而不具備和細菌類同的效應(yīng)域。這暗示產(chǎn)甲烷菌可能存在一種新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。盡管還未觀察到任何甲烷八疊球菌的運動性, 但在其基因組中發(fā)現(xiàn)了一個完整的鞭毛基因簇和兩個完整的趨化性基因簇, 這些基因簇的存在也暗示了產(chǎn)甲烷菌可能會通過運動和趨化性適應(yīng)環(huán)境.二極端嗜鹽菌1. 基礎(chǔ)研究

15、（p7）嗜鹽菌嗜鹽古細菌分為一科(嗜鹽菌科)六屬:嗜鹽桿菌屬、嗜鹽小盒菌屬、嗜鹽富饒菌屬、嗜鹽球菌屬、嗜鹽嗜堿桿菌屬、嗜鹽嗜堿球菌屬。一般生活在10%30%的鹽液中。嗜鹽菌中，有人還發(fā)現(xiàn)了一種呈四方形的古細菌。我們?nèi)粘Ｉ钪薪?jīng)常食用鹽腌的食品也是是它理想棲居之地。海魚、海蟄、海蟹、海貝等海產(chǎn)品，以及不太咸的咸菜、咸蛋、腌魚、腌肉之類一旦沾上嗜鹽菌就會大量繁殖，速度十分驚人。實驗表明，該菌最喜歡含鹽量2%4%的環(huán)境，在5%6%的高鹽濃度或營養(yǎng)豐富的低鹽濃度都會孽生。尤其是溫度適宜的夏季，10個嗜鹽菌在34小時后就會育出數(shù)百萬個后代。這是一個可怕的天文數(shù)字，但人的肉眼和其他感覺器官難以察覺。 2.

16、 理化性質(zhì)(p8.9.10) 極端嗜鹽菌a. 酶的鹽適應(yīng)特性嗜鹽酶只有在高鹽濃度下才具有活性，鹽去除后，嗜鹽酶失活，嗜鹽酶在低鹽濃度下(1.0mol/L的NaCl和KCl條件下)大多數(shù)變性失活，將鹽再緩慢加回，發(fā)現(xiàn)可恢復(fù)酶活性。根據(jù)嗜鹽酶與鹽的依存關(guān)系可分為三類:第1類為不加鹽時，酶活性最高，加鹽就受抑制。在這類嗜鹽菌中可能存在某種保護機制，高濃度的K+可作為保護因子對鹽抑制而起著作用。第2類為不加鹽時有一定活性，加鹽時酶活力進一步增強，最適鹽濃度低于細胞內(nèi)離子濃度，過高濃度的鹽會使酶活性受抑制，第3類酶為不加鹽時幾乎不顯示活性，由于鹽的作用使酶強烈的活性化。 b. 質(zhì)膜/色素/質(zhì)子泵作用嗜鹽

17、菌具有異常的膜。嗜鹽菌細胞膜外有一個亞基呈六角形排列的S單層，這個所謂的S單層由磺化的糖蛋白組成，由于磺酸基團的存在使S層呈負電性，因此使組成亞基的糖蛋白得到屏蔽，在高鹽環(huán)境中保持穩(wěn)定。 限制通氣，即低氧壓或厭氧情況下光照培養(yǎng)，極端嗜鹽菌產(chǎn)生紅紫色菌體，這種菌體的細胞膜上，有紫膜膜片組織，約占全膜的50%，由25%的脂類和75%的蛋白質(zhì)組成?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)四種不同功能的特殊的色素蛋白視黃醛蛋白，即細胞視紫紅質(zhì)(bR)、氯視紫紅質(zhì)(hR)、感光視紫紅質(zhì)I(SRI)及感光視紫紅II(SRII)，對鹽生鹽桿菌的bR研究最透徹，由三個bR分子構(gòu)成的三聚體可在細胞膜上形成一個剛性的二維六邊形的穩(wěn)定特征結(jié)構(gòu)，即

18、紫膜。紫膜中含有的菌視紫素或稱視紫紅質(zhì)，是由菌視蛋白與類胡蘿卜素類的色素以11結(jié)合組成的。嗜鹽菌的菌視紫素可強烈吸收570nm處的綠色光譜區(qū)，菌視紫素的視覺色基(發(fā)色團)通常以一種全反式結(jié)構(gòu)存在于膜內(nèi)側(cè)，它可被激發(fā)并隨著光吸收暫時轉(zhuǎn)換成順式狀態(tài)，這種轉(zhuǎn)型作用的結(jié)果使H+質(zhì)子經(jīng)轉(zhuǎn)移到膜的外面，隨著菌視紫素分子的松弛和黑暗時吸收細胞質(zhì)中的質(zhì)子，順式狀態(tài)又轉(zhuǎn)換成更為穩(wěn)定的全反式異構(gòu)體，再次的光吸收又被激發(fā)，轉(zhuǎn)移H+，如此循環(huán)，形成質(zhì)膜上的H+質(zhì)子梯度差，即質(zhì)子泵（H+泵），產(chǎn)生電化勢，菌體利用這種電化勢在ATP酶的催化下，進行ATP的合成，為菌體貯備生命活動所需要的能量。 c. 嗜鹽細胞排鹽作用嗜鹽

19、菌的生長雖然需要高鈉的環(huán)境，細胞內(nèi)的Na+ 濃度并不高，因為它們由光介導(dǎo)的H+質(zhì)子泵具有Na+ /K+反向轉(zhuǎn)運功能，即具有吸收和濃縮K+和向胞外排放Na+ 的能力。嗜鹽菌是采用細胞內(nèi)積累高濃度K+來對抗胞外的高滲環(huán)境。嗜鹽甲烷菌是在胞內(nèi)積累大量的小分子極性物質(zhì)如甘油、單糖、氨基酸及它們的衍生物，這些小分子極性物質(zhì)在嗜鹽、耐鹽菌的胞內(nèi)構(gòu)成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，幫助細胞從高鹽環(huán)境中獲取水分，而且這些物質(zhì)在細胞內(nèi)能夠被迅速地合成和降解，這對環(huán)境的改變有較強的適應(yīng)能力。d. 細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度的調(diào)節(jié)因為水往往是從高溶質(zhì)濃度的地方流向較低溶質(zhì)濃度的地方，所以懸浮在高鹽溶液中的細胞將失去水分，并成為脫水細胞，除非它的

20、細胞質(zhì)內(nèi)含有比其環(huán)境更高的鹽(或一些其它溶質(zhì))。嗜鹽微生物由于產(chǎn)生大量的內(nèi)溶質(zhì)或保留從外部取得的溶質(zhì)而得以在高鹽環(huán)境中生存。氨基酸在嗜鹽細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度調(diào)節(jié)中起著重要作用。隨培養(yǎng)基食鹽的增加，氨基酸濃度有規(guī)律的增加，其中主要是谷氨酸和脯氨酸，及甘氨酸，它們具有滲透保護作用，是溶質(zhì)濃度調(diào)節(jié)的重要因子。研究表明，革蘭氏陰性菌在高鹽條件下，主要積累谷氨酸，以抵抗外界的高滲透壓，同時積累K+以中和谷氨酸所帶的負電荷；革蘭氏陽性菌則主要積累脯氨酸和-氨基丁酸，K+變化不明顯。嗜鹽菌的細胞質(zhì)蛋白特異地含有許多低分子量的親水性氨基，這樣，在高離子濃度的胞內(nèi)環(huán)境中，細胞質(zhì)可呈現(xiàn)溶液狀態(tài)，而疏水性氨基酸過多則會趨

21、向成簇，從而使細胞質(zhì)失去活性。如嗜鹽真核生物、嗜鹽真細菌和嗜鹽甲烷菌在胞內(nèi)積累大量的小分子極性物質(zhì)，如甘油、單糖、氨基酸及它們的衍生物，它們在胞內(nèi)能夠被迅速地合成和降解構(gòu)成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，幫助細胞從高鹽環(huán)境中獲取水分。 e. 特殊產(chǎn)能系統(tǒng)它們可通過兩條途徑獲取能量，一條是有氧存在下的氧化磷酸化途徑，另一條是有光存在下的某種光合磷酸化途徑。實驗發(fā)現(xiàn)，在波長為550600nm:的光照下.其ATP合成速率最高，而這一波長范圍恰與細菌視紫紅質(zhì)的吸收光譜相一致。（p11.12.13）嗜鹽菌3. 培養(yǎng)方法嗜鹽菌要在高鹽環(huán)境下生存， Na+ 對維持細胞膜、細胞壁構(gòu)造和功能有特別重要的作用。Na+ 與細胞膜成分

22、發(fā)生特異作用而增強了膜的機械強度，有利于維持細胞膜的構(gòu)造，對阻止嗜鹽菌的溶菌起著重要作用。在細胞膜的功能方面，嗜鹽菌中氨基酸和糖的能動運輸系統(tǒng)內(nèi)必需有Na+ 存在，而且Na+ 作為產(chǎn)能的呼吸反應(yīng)中一個必需因子起著作用。實驗證明，對于氨基酸的吸收是間接地通過光來驅(qū)動，一種氨基酸- Na+ 泵運輸系統(tǒng)用于運載氨基酸。Na+ 被束縛在嗜鹽菌細胞壁的外表面，起著維持細胞完整性的重要作用。嗜鹽桿菌的細胞壁以糖蛋白替代傳統(tǒng)的肽聚糖，這種糖蛋白含有高量酸性的氨基酸(如天門冬氨酸和谷氨酸)，形成負電荷區(qū)域，吸引帶正電荷的Na+ ，維持細胞壁穩(wěn)定性，防止細胞被裂解?！斑^量”的酸性氨基酸殘基在蛋白表面形成負電屏蔽

23、，促進蛋白在高鹽環(huán)境中的穩(wěn)定。 4. 前沿科技研究 7 嗜鹽菌素的發(fā)現(xiàn)最早的嗜鹽菌素是由M&NA;+*FO3%>FA> 及其同事于56$" 年發(fā)現(xiàn)的。他們篩選了!# 株極端嗜鹽古菌（包括46 株桿菌和5 株球菌）并研究了它們相互之間的抑制作用，發(fā)現(xiàn)有7 株可以產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，其中8株可以抑制大多數(shù)（56 P 48）菌株，而其它" 株則只抑制少數(shù)（5 P 4 個）菌株4。&AAFQ>=D> 等于566! 年篩查了C$ 株極端嗜鹽桿菌之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)有C7 株極端嗜鹽桿菌可以產(chǎn)生嗜鹽菌素，而且它們的抑菌譜互不相同，不同的抑菌譜可能代表不

24、同的嗜鹽菌素。由此，他們得出結(jié)論：“產(chǎn)生嗜鹽菌素是極端嗜鹽古菌桿菌的一個普遍特征”!。我們也于最近篩查了"" 株不同來源的極端嗜鹽古菌相互之間的抑制作用，發(fā)現(xiàn)有"5 株極端嗜鹽古菌可以產(chǎn)生嗜鹽菌素，其中C 株（分屬于四個屬：:4.(-4+$,%&6，:4.(+(+&#，;4$,%"64 和;4$,("(,&-,&6）抑菌譜較廣，可以抑制大多數(shù)菌株（5# P 57 株）。而且，在這"" 株古菌中，有! 株極端嗜鹽嗜堿古菌均可產(chǎn)生嗜鹽菌素，有兩株（分別是;4$,("(-4+$,%&

25、;6 /,/(,0% 和;4$,("(,&-,&6 $%-$"# R)44）抑菌譜較廣。另外，發(fā)現(xiàn)了嗜鹽菌素對非嗜鹽菌的抑制作用，由:4.(-4+$,%&6 ST8 產(chǎn)生的嗜鹽菌素對蠟狀芽孢桿菌（ 84<+%.&# +,&#）也有一定的抑制作用（厲云、向華等未發(fā)表資料）。目前，已發(fā)現(xiàn)有上百株極端嗜鹽古菌可以產(chǎn)生嗜鹽菌素。其中，研究比較深入的嗜鹽菌素有四個：由!"#$%"&( )"*+,"&&-"+ !" 產(chǎn)生的嗜鹽菌素#"，由!#$%&

26、quot;&( .+/$-0+ $%& () 產(chǎn)生的嗜鹽菌素#*，由!#$/1,"&+2) +,-./0/ 產(chǎn)生的嗜鹽菌素#%1 !/，以及最近報道的一個小分子量的嗜鹽菌素23，它的產(chǎn)生菌是一個尚未精確分類的極端嗜鹽桿菌4。其中，#"、#*、#%1 !/ 和23 的蛋白已被純化4 5 3，#" 的基因3#!" 和23 的基因3#43 已被克隆和測序，并在6!.7 轉(zhuǎn)錄水平上進行了研究8，)。! 嗜鹽菌素的產(chǎn)生及其分離純化!"# 嗜鹽菌素的產(chǎn)生嗜鹽菌素#"、#*、#%1 !/ 和23 的活性都是在培養(yǎng)物從對數(shù)末期

27、向穩(wěn)定期過渡的時候檢測到的，并很快上升到最大值。不同的是，#"、#* 和23 的活性隨即下降，并維持在一個比較低的水平上，而#%1 !/的活性一旦達到最大值，便可一直保持在這個水平4，8，)。由于嗜鹽菌素產(chǎn)生的時期比較特殊，因此可用于作為穩(wěn)定期基因表達調(diào)控的模型進行研究。!"! 嗜鹽菌素的分離純化及分子量測定嗜鹽菌素為胞外蛋白，它直接分泌到胞外環(huán)境中，因此它的純化相對較為容易。$9+9:;9< 和!=>?<:;9A>B%19<% 早在/)34 年就純化了#" 的蛋白，2C2>D7-E 顯示其分子量大約是&3FC*；#*

28、的分子量相對較大，#DGH 顯示其分子量約為(&FC，而2C2>D7-E 的結(jié)果表明其分子量可能小于(/FC4，3。#%1 !/ 的情況稍微復(fù)雜一些，!?9+I 和2I;<6（/)38）的純化結(jié)果表明，#%1 !/ 的分子量大約為*J&FC，但它通常與較大的“攜帶蛋白”（K%<<9< ,<=I9L+）一起出現(xiàn)。2M%L? 等（&000）的純化結(jié)果與此相似，但認(rèn)為#%1 !/ 的分子量應(yīng)更小一些（約&J4FC）。首先，通過一系列的遞減的分子量截留（L=6L%1 6=19K;1%< N9:MIK;I=OO，.$PH）過濾濃縮

29、極端嗜鹽古菌!#$/1,"&+2) +,-./0/ 穩(wěn)定期培養(yǎng)物的上清，發(fā)現(xiàn)經(jīng)/00FC .$PH超濾后剩下的#%1 !/ 活性只占全部活性的8J*Q，這一點與!?9+I 和2I;<6（/)38）的結(jié)果是一致的。而大部分的活性成分（約3)J"Q）不能通過(0FC .$PH 濾膜。將(0FC 截留下來的活性部分通過一個R=!%?D*0$ 凝膠過濾柱，發(fā)現(xiàn)兩個活性峰：一個活性峰在(0FC 左右，另一個較小的活性峰則小于&J4FC。(0FC左右的活性峰包含了上樣液中約84Q的活性，將其收集并用切向流過濾（I%L:9LI%1 O1=N O1I<%I=L）

30、去鹽后通過一反相#DGH 柱，用含0J/Q三氟乙酸的乙腈洗脫，發(fā)現(xiàn)只在&30S&/"L6 處有一活性峰。收集此活性峰處的樣品并進行銀染2C2>D7-E，發(fā)現(xiàn)一條小于&J4FC 的電泳帶有活性，而較大的/"FC 的電泳帶則沒有活性。因此，2M%L? 等認(rèn)為#%1 !/ 分子量小于&J4FC，但它在培養(yǎng)液中由于與一個或多個“攜帶蛋白”相結(jié)合，因而表觀分子量達到約(0FC4。嗜鹽菌素23 的純化過程與#%1 !/ 類似，切向流過濾中，23 被(0FC 和/0FC .$PH 超濾膜截留效果相同。將(0FC 截留液通過一個R=!%? D(0$ 凝

31、膠層析柱，發(fā)現(xiàn)僅有&J4FC 附近的一個峰有活性，將活性峰通過反相#DGH 柱，發(fā)現(xiàn)其全部活性位于&30S&/"L6 的峰上。銀染2C2>D7-E 表明，其分子量大約為(J43FC4，8。$ 嗜鹽菌素的理化性質(zhì)和可能的抑菌機制$"# 嗜鹽菌素的理化性質(zhì)嗜鹽菌素大都比較穩(wěn)定。除#" 外，#*，#%1 !/ 和23 都對熱穩(wěn)定，而且對去鹽作用不敏感。如#* 可以在)0T處理/06L 而不失活，#%1 !/ 煮沸/M 仍保留40Q活性，而23 沸水浴/M 仍保持全部活性4。蛋白酶對嗜鹽菌素的影響則不盡相同，如#* 對鏈霉蛋白酶敏感，對胰蛋白

32、酶不敏感；#%1 !/ 對非特異性蛋白酶如蛋白酶U、鏈霉蛋白酶D 和彈性蛋白酶敏感，對特異性蛋白酶如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶不敏感；23 對蛋白酶U 敏感，對胰蛋白酶不敏感。另外，#%1 !/ 對某些有機溶劑如L>丙醇、乙腈S三氟乙酸和甲醇不敏感，23 對乙腈等有機溶劑也不敏感4 5 3。嗜鹽菌素相對穩(wěn)定，是與它的生態(tài)學(xué)意義相一致的，由于嗜鹽菌素可以減少有相同營養(yǎng)及環(huán)境要求的種群間的競爭，因此，它的性質(zhì)越穩(wěn)定，對產(chǎn)生菌就越有利。另外，嗜鹽菌素在去鹽作用下而不失去活" 期勵云等：極端嗜鹽古菌蛋白類抗生素嗜鹽菌素40(性，說明嗜鹽菌素可能具有比較廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。!&quo

33、t;# 嗜鹽菌素可能的抑菌機制盡管嗜鹽菌素在極端嗜鹽古菌中廣泛存在，但嗜鹽菌素的抑菌機理至今仍不十分清楚。目前比較清楚的只有!" 和!# 兩種。將敏感菌株的細胞暴露于!" 中，發(fā)現(xiàn)$% 后菌體腫脹，成球形，&"% 后裂解或接近裂解，它的作用機制被認(rèn)為是破壞靶細胞上的跨膜離子梯度(。!# 對細胞的形態(tài)影響與!" 相似，只是作用更快，所需活性單位更少。!# 的作用機制被證明是直接抑制)*+ ,!+ 的反向轉(zhuǎn)運，這也是目前唯一一個被闡明作用機制的嗜鹽菌素。由于嗜鹽菌素廣泛存在，而不同的嗜鹽菌素通常其抑菌譜也不一樣，說明可能存在大量不同的抑菌機制。因此研

34、究不同嗜鹽菌素的抑菌機理，將是研究蛋白質(zhì)與靶分子互作的重要領(lǐng)域。$ 嗜鹽菌素基因!"#$" 和!"#%- 的基因結(jié)構(gòu)及其克隆表達$"% 嗜鹽菌素&$ 編碼基因!"#$同某些細菌素基因一樣，已克隆的嗜鹽菌素基因如!"#$" 和!"#%- 均為質(zhì)粒編碼。$. &()*+",)/" 有三個大的質(zhì)粒，其大小分別為"0(12、3&(12 和3(12，用鉗壓均勻電場電泳（4!56）分離三個質(zhì)粒，對已純化的!" 蛋白進行末端測序，以此設(shè)計簡并引物，進行74/ 擴增，

35、將擴增出的較長的片段作為探針做89:;%<=> 雜交，克隆了!"#$" 的基因，并發(fā)現(xiàn)!"#$" 基因位于3&(12 的質(zhì)粒上0。!"#$" 的開放閱讀框為(-(2?，編碼3$0 個氨基酸的肽鏈，具有典型的嗜鹽古菌啟動子。其轉(zhuǎn)錄的起始位點離$起始密碼子（ABC）只有" 個堿基，因此!"#$" 基因同許多古菌基因一樣，其轉(zhuǎn)錄子沒有前導(dǎo)序列。轉(zhuǎn)錄的終止子是一對 個堿基的回文重復(fù)序列，中間間隔著# 個堿基。!" 蛋白有一個"# 氨基酸的信號肽，它在分泌的時候從前蛋白上切下

36、。這一特征不同于常見的細菌素，大部分大腸菌素和其它絕大多數(shù)的細菌素都是利用裂解蛋白進行分泌，某些大腸菌素也存在前導(dǎo)肽，但它們的分泌方式十分獨特，因此通常不把他們看作典型的信號肽序列。!" 的另一個特征是在肽鏈的中部有一段3& 個氨基酸的疏水區(qū)域，它可能與!" 的作用方式有關(guān)$，0。4%<:>D 等還研究了!"#$" 基因表達與嗜鹽菌素活性之間的關(guān)系。首先是在從對數(shù)期向穩(wěn)定期過渡的時候檢測到了!" 的活性，接著，!" 活性快速上升并檢測到!"#$" 基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高。但!"活性與!"#$" 轉(zhuǎn)錄水平有兩點不一致：一是在對數(shù)生長中期，!"#$" 的轉(zhuǎn)錄已清晰可見，卻檢