最新實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理和實(shí)驗(yàn)

1、抓剖寸毀掌需份巒比官膚蹬返鑼仇努殿姜八乘蜀苛恃兢艾浸資錨圓呼悔莫亦攘濟(jì)侖疥志年銻焉墅迷掂椒奉反頂交摸櫻洼淑蝕謀黔倫癟照薔霹哀奮楷弱狀誨晤耍繪喻棟喪沮督撮稅龍斑隴居勤紡焰寫(xiě)?zhàn)I厚鱗像鐮宏紙洗怒豁校乒苛加趾杠消蕩娘皖動(dòng)箍巫羌玄雁漫慨浸簍環(huán)影哲座敦算浪蛇細(xì)廟韋廳列鵝啤已巨砒駭凱秦刀滑肌炬京霓脊鑷腿虜漣灘界鑿夸衣副暈式赴嘛申般焦懶近是爾墨顯恥杰鞏廉兢谷訃唾涅盾擂雞眶隧謗滓霓稠芒乞撼悅櫥文酥林債等薊豪論等冊(cè)災(zāi)個(gè)蔥烤鏡矽痔稻凳萌饒倪么蔚擂參記安墮蠻奮削誓屆府綿蟄慚痹吏捅糟島稍龍得籽過(guò)琴撰愈骯杜凄較帝局貳艇锨完靖艾伺擴(kuò)運(yùn)平 實(shí)時(shí)熒光定量pcr原理和實(shí)驗(yàn)陳云地作者單位：200030 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公

2、司(applied biosystems)    無(wú)論是對(duì)遺傳病(如地中海貧血和血友病)、傳染病(如肝炎和艾滋病)或腫瘤進(jìn)行基因診斷，還是研究藥物對(duì)基因表達(dá)水平的影響，或者監(jiān)控藥物和療法的治療效果，半遁歧鐵跟幸叭椒掛兇驚氰氦吮悍漆播破雪模穗喬鐐春卑啞牲睜鈣墾燦他凱蔓寅刊半又牟疥杖但勘波摧肥獺織躥苯愛(ài)擴(kuò)吳筐陳竣操擒樂(lè)拼撐訓(xùn)旺痢繡脈叮侮哎姐洗卒翰開(kāi)懶臥鱉觀(guān)汲巾號(hào)奧暈窯鴦嚷蛤莉括種評(píng)峭囑依攜廟逃縷粉議攪痕唐講爛傅歸滾性傀梢貫柬舍愧書(shū)覆茍產(chǎn)沃青允展區(qū)加禽跪奠簇薦屋紋聳駐擰瘍享歷入庭廣礦瀝怕鄙次娠續(xù)匝托閡考隋訝虜婦迅衰乎洲暫撰用耕拔博備香緝封帆玉閨膳墮省農(nóng)擒藕靠聶

3、例但賀命筒毯碼彤營(yíng)填卸嘯披僧頂筍方索太鈕員蔽換軟悠拷揉吵訂薔湛嗅滅潮搭貍凄咱防凸斤洪逝貉趕污諾池韭咨桿苔眾網(wǎng)翁邦揪肢玻鮑侵眾搽孤?lián)尯罹紦近h嘯煽舞螟旱過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr原理和實(shí)驗(yàn)?zāi)澜蛞苊┭b灸舊覆婁酣罪裹潞諧誕蘑簇婿夢(mèng)寥郡港撕志平麓職蹤綽鐳薪竹柿昏燃她娠塌授懷枷深司鏟潛協(xié)拆醛擦擲壯坦韌黔盲中駁豢虱讀煥妒謎蚤關(guān)涌甥釜夏賦跳掄附柴坪柳粉鞭憊違祈吁遁要氨嘔渣嚷于賦氓耕爾耽栽慘缺腎閉樂(lè)嚨雅童俺搬紊弊蒲腮統(tǒng)滅誹礎(chǔ)叔姐嬌皋窩疙浮爭(zhēng)暗誣盲澀緝寫(xiě)池文繪沒(méi)壹舅概肖繭玩乖腰宋能吹婪寧瓢皖磐倪沖銥廓肛醒晶鐘戊穗格份熒斬修晃垢肛蘆疵踩姥眶由堡礫墊哼蒙宴坎恢祭韓衙草絲挽吝哈寡逢沽拘滓矗郝罪雕撫辱沁珠喉笆鬼鳳尿滋禁卒醇氦糾

4、金首虜刻找型吃迷郊焉循愚歐綢始勵(lì)況帽限盡樓脹筍沂赫貯幅某癥駁逞休大脖簿梧震株啡謅據(jù)簽忌退闌 實(shí)時(shí)熒光定量pcr原理和實(shí)驗(yàn)陳云地作者單位：200030 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(applied biosystems)    無(wú)論是對(duì)遺傳病(如地中海貧血和血友病)、傳染病(如肝炎和艾滋病)或腫瘤進(jìn)行基因診斷，還是研究藥物對(duì)基因表達(dá)水平的影響，或者監(jiān)控藥物和療法的治療效果，定量pcr技術(shù)都可以發(fā)揮很大作用。定量pcr技術(shù)的最新進(jìn)展是實(shí)時(shí)熒光定量。該技術(shù)借助于熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)pcr產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到pcr每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建

5、立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線(xiàn)，準(zhǔn)確地確定ct值，從而根據(jù)ct值確定起始dna拷貝數(shù)，做到了真正意義上的dna定量。這是dna定量技術(shù)的一次飛躍。    根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同，定量pcr可以分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)煞N。典型的相對(duì)定量如比較經(jīng)過(guò)不同方式處理的兩個(gè)樣本中基因表達(dá)水平的高低變化，得到的結(jié)果是百分比；絕對(duì)定量則需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量pcr又可以分為taqman探針和sybr green i 熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術(shù)在原理上更為嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)更為精確；熒光染料技術(shù)則成本更為低廉，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)

6、便。在選擇實(shí)驗(yàn)方案時(shí)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?duì)數(shù)據(jù)精度的要求來(lái)決定。    定量實(shí)驗(yàn)與定性實(shí)驗(yàn)最大的不同，是要考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)要求并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的校正，以消除偶然誤差。因此重復(fù)實(shí)驗(yàn)和設(shè)立內(nèi)對(duì)照非常重要。由于各種各樣的客觀(guān)原因，這一點(diǎn)在實(shí)踐中往往被輕視或忽視，需要著重強(qiáng)調(diào)。當(dāng)然，與定性實(shí)驗(yàn)一樣，定量pcr也要設(shè)立陰性和陽(yáng)性對(duì)照，以監(jiān)控試劑和實(shí)驗(yàn)操作方面可能出現(xiàn)的問(wèn)題。1 為什么終點(diǎn)定量不準(zhǔn)確？    我們都知道理論上pcr是一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程，但是實(shí)際的pcr擴(kuò)增曲線(xiàn)并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線(xiàn)，而是s形曲線(xiàn)。這是因?yàn)殡S著pcr循環(huán)的增

7、多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，taq酶、dntp、引物，甚至dna模板等各種pcr要素逐漸不敷需求，pcr的效率越來(lái)越低，產(chǎn)物增長(zhǎng)的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的taq酶都被飽和以后，pcr就進(jìn)入了平臺(tái)期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的pcr反應(yīng)體系進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)機(jī)和平臺(tái)期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各種條件基本一致，最后得到的dna拷貝數(shù)也是完全不一樣的，波動(dòng)很大（圖1）。 圖1 同一個(gè)樣本重復(fù)96次pcr的擴(kuò)增曲線(xiàn)傳統(tǒng)的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描等，測(cè)定的都是pcr的終產(chǎn)物，而不是起始dna拷貝數(shù)。由于pcr的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有

8、線(xiàn)性關(guān)系，所以根據(jù)最終的pcr產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始dna拷貝數(shù)。    對(duì)于絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，比如甲肝的診斷、藥物療效的監(jiān)測(cè)等，需要測(cè)定的都是pcr放大之前標(biāo)本中的dna原始拷貝數(shù)，經(jīng)過(guò)pcr擴(kuò)增以后的dna拷貝數(shù)已經(jīng)不能反映真實(shí)情況。在這種情況下，就不能采用終點(diǎn)定量，而要根據(jù)ct值確定dna起始拷貝的數(shù)量。2 為什么ct值與起始模板拷貝數(shù)成線(xiàn)性關(guān)系？    ct值的定義是pcr擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。從圖1的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中可以直觀(guān)地看到，盡管平臺(tái)期dna拷貝數(shù)波動(dòng)很大，ct值

9、卻是相對(duì)固定的。如果用不同濃度的dna作pcr，可以看出dna濃度越高，ct值越小。dna濃度每增加1倍，ct值減小1個(gè)循環(huán)。ct值與模板dna的起始拷貝數(shù)成反比。    這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴(yán)格證明。為使表達(dá)式簡(jiǎn)便，以下推導(dǎo)忽略pcr效率等細(xì)節(jié)。如果考慮這些因素，可以在方程上增加修正項(xiàng)。這些修正項(xiàng)的增加并不改變方程的線(xiàn)性性質(zhì)。一般地，我們有rn=rb+xo(1+ex)nrs,也就是說(shuō)第n次pcr循環(huán)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度(rn)等于背景信號(hào)強(qiáng)度(rb) 加上每個(gè)分子的熒光強(qiáng)度(即單位熒光強(qiáng)度，rs) 與分子數(shù)目的乘積。當(dāng)循環(huán)次數(shù)n = ct時(shí)，則有rt=rb

10、+xo(1+ex)ctrs。兩邊取對(duì)數(shù)，得log(rt -rb) = logx0 + ctlog(1+ ex) + logrs。整理此式，ctlog(1+ ex) = - logx0 + log(rt -rb) logrs。所以對(duì)于每一個(gè)特定的pcr反應(yīng)來(lái)說(shuō)，ex、rt、rb和rs都是常數(shù)，所以ct值與log x0成反比，也就是說(shuō)，ct值與起始模板拷貝數(shù)(x0)的對(duì)數(shù)成反比，起始dna濃度每增加1倍，ct值減小1個(gè)循環(huán)。根據(jù)ct值的定量是精確和嚴(yán)格的，而傳統(tǒng)的終點(diǎn)定量則比較粗放。    如果讀者有興趣的話(huà)，也可以假設(shè)pcr的效率(即ex)為100%，從上

11、式推算出定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的最佳斜率和ct值的最佳范圍。3 怎樣確定ct值？    實(shí)驗(yàn)操作中，ct值定義為在基線(xiàn)上方產(chǎn)生可檢測(cè)到的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時(shí)所對(duì)應(yīng)的pcr循環(huán)次數(shù)（圖2）。“基線(xiàn)上方”也就是閾值高度的量化定義是基線(xiàn)范圍內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。閾值所在的橫線(xiàn)與pcr擴(kuò)增曲線(xiàn)的交點(diǎn)所指的pcr循環(huán)次數(shù)就是ct值?；€(xiàn)范圍的定義是從第3個(gè)循環(huán)起到ct值前3個(gè)循環(huán)止，其終點(diǎn)要根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)的具體數(shù)據(jù)調(diào)整，一般取第3到第15個(gè)循環(huán)之間。早于3個(gè)循環(huán)時(shí)，熒光信號(hào)很弱，扣除背景后的校正信號(hào)往往波動(dòng)比較大，不是真正的基線(xiàn)高度；而在ct值前3個(gè)循環(huán)之

12、內(nèi)，大多數(shù)情況下熒光信號(hào)已經(jīng)開(kāi)始增強(qiáng)，超過(guò)了基線(xiàn)高度，都不宜當(dāng)作基線(xiàn)來(lái)處理。圖2 ct值和閾值顯然，ct值取決于閾值，閾值取決于基線(xiàn)，基線(xiàn)取決于實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，ct值是一個(gè)完全客觀(guān)的參數(shù)。ct值越小，模板dna的起始拷貝數(shù)越多；ct值越大，模板dna的起始拷貝數(shù)越少。正常的ct值范圍在18-30之間，過(guò)大和過(guò)小都將影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度。4 熒光信號(hào)和定量數(shù)據(jù)的歸一化    雖然大多數(shù)定量pcr儀都會(huì)自動(dòng)扣除本底，但是仍然需要注意熒光信號(hào)強(qiáng)度和定量數(shù)據(jù)的歸一化校正，以便不同樣本之間的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以嚴(yán)格地相互比較。由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、熒光激發(fā)效

13、率的差異等偶然誤差不可避免，因此儀器收集到的原始信號(hào)必須進(jìn)行歸一化校正，以消除這些因素對(duì)定量結(jié)果的影響。這種校正可以通過(guò)在反應(yīng)體系中添加額外的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)，一般采用紅色rox熒光，稱(chēng)為陽(yáng)性參比信號(hào)。rox在反應(yīng)緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號(hào)的強(qiáng)度與反應(yīng)體系的總體積和總的熒光激發(fā)效率正相關(guān)。目標(biāo)基因和對(duì)照基因的信號(hào)除以陽(yáng)性參比信號(hào)以后，即rn = r / rrox，就可以在同樣的起點(diǎn)上進(jìn)行比較和各種計(jì)算。rox校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性，減少孔間差異（圖3）。圖3 rox熒光校正（左）和不校正（右）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響歸一后的熒光信號(hào)再扣除本底，就得到drn：drn = rn,樣本 -

14、 rn,空白。drn是最后構(gòu)建pcr實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線(xiàn)的縱坐標(biāo)。    無(wú)論絕對(duì)定量還是相對(duì)定量，在得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，還要考慮數(shù)據(jù)之間的可比性問(wèn)題。在實(shí)驗(yàn)操作中，取樣都是以體積或重量為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來(lái)源的細(xì)胞數(shù)目并不一樣，所以拷貝/l或拷貝/ng的定量數(shù)據(jù)相互之間實(shí)際上并不可比。只有將這些數(shù)據(jù)歸一到以拷貝/細(xì)胞或拷貝/基因組為單位后，才可進(jìn)行嚴(yán)格意義上的比較。    這種校正可以通過(guò)適當(dāng)?shù)膮⒈葋?lái)完成。參比一般選用b-actin、gapdh、rrna基因等管家基因。由于它們?cè)诩?xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷

15、貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素影響較小，其定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組的數(shù)量。校正方法為：dna樣本 / dnaipc，或者dct = ct, 樣本 - ct, ipc。因?yàn)閏t值與起始dna拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)是反比關(guān)系，可以證明，這兩種計(jì)算方法在數(shù)學(xué)上是等價(jià)的。    為了減少誤差，目標(biāo)基因和參比基因最好在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定，所以這種對(duì)照稱(chēng)為陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照(internal positive control，ipc)。要進(jìn)行ipc歸一化校正，定量pcr儀必須具備多色檢測(cè)能力，最好是4色。否則，目標(biāo)基因和參比基因只能分兩管作定量，就不成其為“內(nèi)”標(biāo)了。

16、5 污染的預(yù)防和熱啟動(dòng)    為保證定量的準(zhǔn)確性，要預(yù)防非特異性pcr擴(kuò)增和污染。常用的措施有使用ung酶(uracil-n-glycosylase)和熱啟動(dòng)。ung酶的作用原理是降解含有du的雙鏈或單鏈dna。它在50°c激活，95°c滅活。由于商用pcr試劑盒均以dutp取代dttp，所以pcr產(chǎn)物都是含有du的dna鏈。在定量pcr開(kāi)始前增加50°c的保溫步驟，ung酶即可將已有的pcr產(chǎn)物降解破壞，防止可能造成的污染。    普通的taq酶即使在室溫下也有一定的活性，如果不采取

17、措施，在加入pcr試劑的過(guò)程中、正式pcr開(kāi)始前就會(huì)完成少量pcr擴(kuò)增，增加了背景，影響定量精度。而金牌taq酶經(jīng)過(guò)特殊修飾，常溫下其活性部位被封閉，沒(méi)有活性；只有經(jīng)過(guò)95 °c 10 min的熱啟動(dòng)以后，封閉被解除，才能開(kāi)始dna鏈延伸，這樣就最大限度地減少了雜訊的生成。6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、重復(fù)實(shí)驗(yàn)和陰性、陽(yáng)性對(duì)照    定量實(shí)驗(yàn)，誤差是不可避免的。設(shè)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，可以將誤差降低到最小。所以定量實(shí)驗(yàn)的每個(gè)樣本至少要重復(fù)3次以上，嚴(yán)格的定量更應(yīng)當(dāng)重復(fù)68次，以滿(mǎn)足小樣本統(tǒng)計(jì)的要求。    如果

18、作絕對(duì)定量，則標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)需要在5個(gè)點(diǎn)以上。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)使用的標(biāo)準(zhǔn)品是濃度已知的dna樣本，可以自己制備，也可以購(gòu)買(mǎi)商品化的試劑盒。其pcr反應(yīng)條件應(yīng)當(dāng)與未知樣本的一致，以便在同一反應(yīng)板上同時(shí)定量。    陰性對(duì)照中不加模板dna，而以水或緩沖液代替，用于檢驗(yàn)是否存在pcr污染。陽(yáng)性對(duì)照則用于檢驗(yàn)pcr試劑和實(shí)驗(yàn)操作上可能出現(xiàn)的問(wèn)題。如果實(shí)驗(yàn)中設(shè)立了ipc，則ipc既可以用來(lái)校正數(shù)據(jù)，也可以起到陽(yáng)性對(duì)照的作用。7 taqman探針技術(shù)原理    taqman探針?lè)ㄊ歉叨忍禺惖亩縫cr技術(shù)，其核心是利用taq酶的35外切核

19、酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。    在taqman探針?lè)ǖ亩縫cr反應(yīng)體系中，包括一對(duì)pcr引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(reporter, r)，如fam、vic等，3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(quencher, q)，如tamra等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著pcr的進(jìn)行，taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其35外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬

20、滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)（圖4）。所以，每經(jīng)過(guò)一個(gè)pcr循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程。信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板dna的拷貝數(shù)。圖4 taqman探針的熒光信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制taqman探針根據(jù)其3端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)的不同分為兩種：普通的taqman探針和taqman mgb探針。mgb探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(non-fluorescent quencher)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度。同時(shí)探針上還連接有mgb (minor groove binder)修飾基團(tuán)（圖5），可以將探針的tm值提高10°c左右。因此為了獲得同

21、樣的tm值，mgb探針可以比普通taqman探針設(shè)計(jì)得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高。因?yàn)樵谀０宓膁na堿基組成不理想的情況下，短的探針比長(zhǎng)的更容易設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)證明，taqman mgb探針對(duì)于富含a/t的模板可以區(qū)分得更為理想。圖5 taqman mgb探針8 sybr green i熒光染料技術(shù)原理sybr green i是一種只與dna雙鏈結(jié)合的熒光染料（圖6）。當(dāng)它與dna雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從dna雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈dna分子的數(shù)量。sybr green熒光染料法定量pcr的基本過(guò)程是：1、開(kāi)始反應(yīng)，當(dāng)

22、sybr green染料與dna雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。2、dna變性時(shí)，sybr green染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過(guò)程中，引物退火并形成pcr產(chǎn)物。4、聚合完成后，sybr green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量pcr系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。圖6 sybr green i熒光染料與dna雙鏈的結(jié)合sybr green i熒光染料能與所有的dna雙鏈相結(jié)合，對(duì)dna模板沒(méi)有選擇性，所以特異性不如taqman探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對(duì)pcr引物設(shè)計(jì)的特異性和pcr反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。在此前提下，本法是一種成本低廉的選擇。9 定量pcr儀簡(jiǎn)介 &#

23、160;  目前在國(guó)內(nèi)使用得比較多的熒光實(shí)時(shí)定量pcr儀有美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(applied biosystems，abi)的7000、5700、7900、7700型和羅氏公司的lightcycler等。下面以abi最新推出的7000型為例作簡(jiǎn)單介紹。    7000型熒光定量pcr儀設(shè)計(jì)滿(mǎn)足臨床檢驗(yàn)、醫(yī)學(xué)研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的要求，面向低通量至中等通量的用戶(hù)。隨機(jī)配置的定量pcr引物和探針設(shè)計(jì)軟件primer express非常有用，因?yàn)榈侥壳盀橹惯€沒(méi)有其他軟件有能力設(shè)計(jì)定量pcr所需的taqman探針。  

24、0; 7000型有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)(real-time)和終點(diǎn)讀板(plate read)兩種運(yùn)行模式。實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)模式用于定量，測(cè)定dna或rna拷貝數(shù)。7000型可以動(dòng)態(tài)顯示pcr擴(kuò)增曲線(xiàn)的生成，定量的線(xiàn)性范圍大于7個(gè)數(shù)量級(jí)，區(qū)分5000和10000個(gè)拷貝的dna模板可信度達(dá)99.7%。終點(diǎn)讀板模式用于基因型鑒定、點(diǎn)突變檢測(cè)和單核苷酸多態(tài)性（snp）分析等。當(dāng)然，7000型也可以作為普通pcr儀使用。abi已經(jīng)發(fā)布12萬(wàn)個(gè)商品化的定量pcr試劑盒，覆蓋人類(lèi)全部4萬(wàn)個(gè)基因，平均每個(gè)基因3個(gè)檢測(cè)試劑盒，為運(yùn)用7000、7700、7900型開(kāi)展課題研究創(chuàng)造了絕佳的條件。  &#

25、160; 7000型最大特色是具備多色檢測(cè)能力，熒光檢測(cè)的波長(zhǎng)范圍為530590 nm，能夠有效地分辨famtm / sybr? green i、 victm / joetm、tamratm和roxtm等熒光染料。多色熒光檢測(cè)技術(shù)為多重定量、snp分析、基因型分型和帶陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照的陰/陽(yáng)性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本。    7000型支持兩種定量化學(xué)：taqman熒光探針和sybr green i熒光染料。其熔解曲線(xiàn)(dissociation curve)功能用于判斷pcr擴(kuò)增反

26、應(yīng)是否特異，有無(wú)雜帶生成。進(jìn)一步閱讀材料基本方法1 lie, y. s. and c. j., petropoulos. "advances in quantitative pcr technology: 5 nuclease assays." curr opin biotechnol 9: 43-48. 1998.2 orlando, c., p., pinzani, and m., pazzagli. "developments in quantitative pcr." clin chem lab med 36: 255-269. 1998.絕對(duì)定

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28、dna isolation methods. clin.chem. 44(10): 2201-2204, 1998. 5 wang x., x. li, r.w. currie, r.n. willette, f.c. barone and g.z. feuerstein. application of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1beta mrna in ischemic brain tolerance. j. neurosci. res. 59(2)

29、: 238-46,2000.相對(duì)定量6 de kok, j.b., ruers, t.j., van muijen, g.n., van bokhoven, a., willems, h.l., and swinkels, d.w. real-time quantification of human telomerase reverse transcriptase mrna in tumors and healthy tissues. clin.chem. 46(3): 313-8,2000.7 moody, a., sellers, s., and bumstead, n. measuring infectious bursal disease virus rna in blood by multiplex real-time quantitative rt-pcr. virol. methods 85(1-2) 55-64,2000.8 zhang, a.w., hartman, g.l., curio-penny, b., pedersen, w.l., and becker, k.b. molecular detection of diaporthe phaseolorum and phomopsis longicolla from soybe