藥物分離純化技術(shù)---制備色譜分離技術(shù)

1、1制備色譜技術(shù)制備色譜的特點(diǎn)：n 最有效的制備性分離技術(shù)；n 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模、小批量生產(chǎn)、產(chǎn)業(yè)化制備；n 不同領(lǐng)域產(chǎn)品量不一樣，闡明化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，3050mg足夠，分析用標(biāo)準(zhǔn)品100mg以上，有機(jī)合成通常需要g級(jí)以上；薄層色譜柱色譜2制備色譜技術(shù)制備薄層色譜法a. 設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便、分離快速、靈敏度及分辨率高；b. 切割譜帶更加方便；c. 自動(dòng)化：自動(dòng)點(diǎn)樣儀、自動(dòng)程序展開(kāi)儀、薄層掃描儀、多種強(qiáng)制流動(dòng)技術(shù)、多種聯(lián)用技術(shù)如傅立葉變換紅外、拉曼、質(zhì)譜等。3制備色譜技術(shù)常規(guī)制備薄層色譜PTLC薄層板制備 為了增大上樣量，增加了吸附劑用量。固定相：硅膠、氧化鋁、纖維素、C2、C18等反相健合硅膠支撐

2、：玻璃板或鋁箔平均25m, 540 m硅膠H、硅膠G、硅膠F254、硅膠F365、硅膠P4制備色譜技術(shù)硅膠粒徑范圍影響：1. 越細(xì)越均勻，分離度越高，但？2. 粒徑范圍寬，分離效率低，怎么辦？-薄層厚度的漸變 薄層厚度從底部到前沿逐漸增加，這樣展開(kāi)劑的速度逐漸變慢，樣品譜帶在展開(kāi)過(guò)程中逐步富集，可保持較窄的譜帶。5制備色譜技術(shù)薄層板的制作方法： 常采用濕法：平鋪法和涂鋪法?；旌掀戒佂夸伷髯匀桓稍镆灰?05-120活化黏合劑硅膠煅石膏或羧甲基纖維素鈉水溶液6制備色譜技術(shù)薄層色譜條件選擇操作參數(shù)流速展開(kāi)模式分離距離樣品量流動(dòng)相選擇性溶劑強(qiáng)度黏度展開(kāi)缸類型薄層板和展開(kāi)缸空腔體積比值溫度蒸氣相固定相薄

3、層厚度顆粒大小質(zhì)量開(kāi)放型操作不連續(xù)7常用溶劑(1)電子接受體溶劑：苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮等；(2)質(zhì)子給體溶劑：異丙醇、正丁醇、甲醇、無(wú)水乙醇等；(3)強(qiáng)質(zhì)子給體溶劑：氯仿、冰醋酸、甲酸、水等；(4)質(zhì)子受體溶劑：三乙胺、乙醚等；(5)偶極作用溶劑：二氯甲烷(6)惰性溶劑：環(huán)己烷、正己烷等。制備色譜技術(shù)8制備色譜技術(shù)上樣和展開(kāi)1. 先用甲醇展開(kāi)一次，除去可能存在的雜質(zhì)；2. 低揮發(fā)性溶劑溶解樣品會(huì)引起樣品帶變寬，因此選用揮發(fā)性溶劑（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等），且溶劑極性盡可能小。3. 樣品濃度以能均勻分布于吸附劑表面不析出為宜，5-10%；4. 帶狀點(diǎn)樣，盡可能窄；如點(diǎn)樣帶太寬，可用高極性

4、溶劑展開(kāi)至點(diǎn)樣帶上方2cm處進(jìn)行濃縮，然后將鋪板干燥后再用展開(kāi)劑展開(kāi)。？9制備色譜技術(shù)樣品檢測(cè)a. 有色物質(zhì)直接觀察斑點(diǎn)；b. 熒光物質(zhì)在紫外燈下觀察；c. 無(wú)色無(wú)熒光可在熒光板分離，紫外光下顯示暗斑；d. 噴顯色劑，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且不易氧化物質(zhì)可以用碘蒸氣顯色，可逆；10制備色譜技術(shù)常用顯色劑：a. 硫酸：硫酸:乙醇(1:1)溶液，噴后110烤5分鐘，不同有機(jī)物顯不同的顏色；b. 0.05%高錳酸鉀溶液，還原性物質(zhì)顯黃色，背景淡紅色；c. 酸性重鉻酸鉀：5%重鉻酸鉀濃硫酸溶液，必要時(shí)150烤薄層；d. 5%磷鉬酸乙醇溶液：噴后120烤，還原性物質(zhì)顯藍(lán)色，再用氨氣熏，背景無(wú)色。11制備色譜技術(shù)樣品收

5、集：a. 切割：刮刀或與真空相連的管型刮離器；b. 回收：極性盡可能低的溶劑洗脫，通常1g吸附劑用5mL溶劑，丙酮和氯仿常用，甲醇因溶解硅膠及其中含有的雜質(zhì)不常用。c. 4型玻璃沙芯漏斗過(guò)濾洗脫液，再用0.2-0.45m濾膜過(guò)濾。d. 硅膠的黏合劑以及熒光指示劑等雜質(zhì)，可用Sephadex LH-20過(guò)濾純化。12制備色譜技術(shù)常規(guī)制備TLC速度慢，效率低，如何提高？加壓離心13加壓制備OPLC 彈性氣墊，外壓使沒(méi)有氣相存在，展開(kāi)劑強(qiáng)制流動(dòng)，展開(kāi)速度加快制備色譜技術(shù)更細(xì)的固定相顆粒、更長(zhǎng)的薄層板14離心制備CTLC 離心力加速流動(dòng)相，分離速度快，操作簡(jiǎn)單，占用空間小，使用溶劑少，可反復(fù)使用，可進(jìn)

6、行梯度洗脫，進(jìn)樣量大，一次分離量0.1-0.2g.制備色譜技術(shù)15不同制備TLC方法的比較 制備色譜技術(shù)參數(shù)PTLCOPLCCTLC流動(dòng)相遷移方法毛細(xì)作用加壓離心薄層厚度/mm0.5-20.5-21-4分離長(zhǎng)度/cm181812分離模式線形線形環(huán)形組分分開(kāi)方法離線在線在線典型上樣量/mg50-15050-30050-500分離譜帶數(shù)2-52-72-1216常規(guī)柱色譜技術(shù)：n可使用較大直徑的色譜柱，更多的固定相，因此樣品量可以更大；n分離速度較慢，樣品可能被不可逆吸附；n不適合小顆粒的吸附劑？n改進(jìn)方法：減壓、加壓等制備色譜技術(shù)17柱色譜常用固定相(1)硅膠：官能團(tuán)和分子的幾何形狀，對(duì)異構(gòu)體的分

7、離選擇性遠(yuǎn)大于其他色譜方法。烷基鹵素（FClBrI）醚硝基混合物腈叔胺酯酮醛醇酚伯胺酰胺羧酸磺酸摻雜硅膠：如硝酸銀處理，對(duì)不飽和烴有好的分離效果。1%-10%的添加劑的水或丙酮溶液與硅膠混合，稍干后110干燥即可。制備色譜技術(shù)18(2) 健合硅膠SiOH+ROHSiORSiOH+SOCl2SiClSiCl+RNH2SiNHRSiCl+RXMgSiRSiOH+R3SiXSiOSiRRR制備色譜技術(shù)19(3) 氧化鋁堿性氧化鋁：其水提取液為pH9-10，常用于碳?xì)浠衔锏姆蛛x，從碳?xì)浠衔镏谐ズ趸衔铩Ｖ行匝趸X：5%乙酸處理，水提取液為pH7.5，適用于醛、酮、醌、某些苷以及酸堿溶液中不穩(wěn)定

8、成分如酯、內(nèi)酯等化合物的分離。酸性氧化鋁：2MHCl溶液處理，水提取液pH為4-4.5，適合于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分離。制備色譜技術(shù)20(4) 活性炭：分離水溶性物質(zhì)n吸附作用在水溶液中最強(qiáng)，用有機(jī)溶劑洗脫。n對(duì)芳香族的吸附力大于脂肪族；n對(duì)大分子吸附力大于小分子；n對(duì)極性基團(tuán)多的分子吸附力大于少的；n易吸附氣體“中毒”，用前需活化，120加熱4-5小時(shí)；制備色譜技術(shù)21(5) 聚酰胺：又稱為錦綸或尼龍n同時(shí)具有良好的親水性和親脂性；n可溶于濃鹽酸、甲酸，不溶于常見(jiàn)溶劑；n含有豐富的酰胺基，與酚類、黃酮類、醌類、脂肪酸類物質(zhì)形成氫鍵；n還含有非極性脂肪鏈，雙重保留機(jī)理；制備色譜技

9、術(shù)22(6) 大孔吸附樹(shù)脂：苯乙烯和丙烯酸酯n骨架結(jié)構(gòu)決定樹(shù)脂的極性： 非極性、弱極性-苯乙烯或二乙烯基苯聚合而成； 中等極性-甲基丙烯酸酯； 極性、強(qiáng)極性-含氧硫基、酰胺基、氮氧等基團(tuán)；n吸附和分子篩分離相結(jié)合：網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大比表面積制備色譜技術(shù)23大孔吸附樹(shù)脂使用：n用前需預(yù)處理除去雜質(zhì)： 回流法、水蒸氣蒸餾法； 滲漉法-乙醇丙酮等有機(jī)溶劑濕法裝柱，浸泡12h后洗脫2-3倍柱體積，再浸泡3-5h后洗脫2-3倍柱體積，重復(fù)直到流出的有機(jī)溶劑與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象為止，用大量蒸餾水洗去乙醇即可。如單獨(dú)采用有機(jī)溶劑洗不盡雜質(zhì)，則可用酸堿處理，2-5%鹽酸、2-5%NaOH溶液浸泡，洗脫，水洗。

10、制備色譜技術(shù)24(7) 凝膠：n交聯(lián)葡聚糖Sephadex-葡聚糖和3氯-1，2環(huán)氧丙烷以醚健交聯(lián)形成的三維空間多孔凝膠 交聯(lián)度大，孔小，吸水膨脹小 型號(hào)以其吸水量的10倍命名，如Sephadex G-25表示每克干膠吸水2.5g； 引入羥丙基，為L(zhǎng)H型烷基化葡聚糖凝膠，不僅可分離水溶性成分，還可分離親脂性成分，常用于最后的純化，除去微量固體、鹽類和其他外來(lái)雜質(zhì)，純化過(guò)程中樣品損失極小。制備色譜技術(shù)25n甲基丙烯酸酯共聚物ToyopearlHW系列-乙二醇、甲基丙烯酸縮水甘油酯和二甲基丙烯酸季戊四醇酯共聚而成 穩(wěn)定性好，pH2-12； 機(jī)械強(qiáng)度高，常用于加壓柱色譜； 在蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖的

11、純化處理中應(yīng)用較多； ToyopearlHW40可用于小分子物質(zhì)的分離純化，與SephadexLH20有相似的效果。制備色譜技術(shù)26n瓊脂糖凝膠-D-半乳糖和3,6位脫水的L-半乳糖連接構(gòu)成的多糖鏈，100時(shí)呈液態(tài)，45 下互相連接成線性雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，再凝聚成瓊脂糖凝膠。 與1,3-二溴異丙醇在強(qiáng)堿條件下反應(yīng)，生成CL型交聯(lián)瓊脂糖，穩(wěn)定性更好，pH3-14（一般的瓊脂糖pH4.5-9.0 ）； 機(jī)械強(qiáng)度和篩孔的穩(wěn)定性由于葡聚糖，流速較快。制備色譜技術(shù)27凝膠柱使用一般注意事項(xiàng)：(1)交聯(lián)度決定凝膠孔徑大小，孔徑?jīng)Q定排除下限；(2)顆粒粗細(xì)很重要，細(xì)顆粒分離效果好，但流速慢，宜采用大直徑柱，

12、粗顆粒流速快，但分離效果差，宜采用小直徑柱；(3)干膠用量需考慮溶漲度制備色譜技術(shù)溶漲度干膠用量hr228(4)干膠使用前需在5-10倍的去離子水中充分溶漲，傾倒掉小顆粒，減壓排氣。也可用煮沸的方法溶漲，速度快，可滅菌排氣。(5)填充均勻，無(wú)空隙和氣泡；(6)多次使用后，床體積減小或污染，可再生處理，即用水逆向反復(fù)沖洗，再用緩沖溶液平衡。制備色譜技術(shù)29(8) 離子交換樹(shù)脂-陽(yáng)離子交換和陰離子交換 價(jià)態(tài)高，交換能力強(qiáng)； 價(jià)態(tài)相同，原子序數(shù)大能力強(qiáng)； 兩性物質(zhì)的交換取決于物化性質(zhì)和特定條件下的離子狀態(tài)；制備色譜技術(shù)30離子交換樹(shù)脂的一般原則- 選擇取決于被分離物質(zhì)的電荷性質(zhì)； 強(qiáng)的使用范圍寬，弱

13、的分離生物大分子時(shí)，活性不容易失去； 反離子，為了提高交換容量，選擇結(jié)合力小的反離子； 親疏水性選擇，一般分離大分子時(shí)，選擇疏水性的基質(zhì)，活性易保持；制備色譜技術(shù)31常規(guī)柱色譜的操作(1)裝柱：干法和濕法；(2)上樣：液體上樣和拌樣上樣，樣品帶盡可能窄；(3)洗脫：始終保持洗脫劑液面高于柱床表面，可梯度洗脫；(4)流分收集：常采用固定體積收集法，結(jié)合TLC檢驗(yàn)；(5)樣品回收：減壓蒸餾或重結(jié)晶制備色譜技術(shù)32干柱柱色譜 干吸附劑，待分離樣品配成濃溶液或吸附于少量填料上上樣，洗脫液接近色譜柱底部時(shí)停止洗脫，挖出或切開(kāi)色帶。制備色譜技術(shù)時(shí)間短節(jié)省試劑玻璃柱尼龍柱33減壓柱色譜 減壓促進(jìn)溶劑流動(dòng)。制

14、備色譜技術(shù)34n與加壓相比，變換溶劑更加方便；n吸附劑高度一般不超過(guò)5cm；n分離過(guò)程中，逐漸增加洗脫劑中高極性溶劑 的 比 例 ， 開(kāi) 始 階 段 增 加 幅 度 較 小( 1 % , 2 % , 3 % ) ， 隨 后 幅 度 逐 步 增 大(5%,10%,20%等)，通常收集20-25個(gè)流分即可將所有成分洗脫。制備色譜技術(shù)35加壓液相柱色譜技術(shù)(1)快速色譜法：約0.2MPa；(2)低壓液相色譜法：2MPa；制備色譜技術(shù)36加壓液相色譜制備分離方法的建立：(1)采用薄層色譜確定分離條件。 對(duì)于快速和低壓色譜，常用薄層色譜選擇分離條件。 硅膠薄層色譜確定正相色譜條件，反相硅膠薄層色譜確定反

15、相色譜條件，一般選擇Rf不大于0.3且具有較好分離效果的展開(kāi)劑。制備色譜技術(shù)37(2)采用分析HPLC來(lái)確定分離條件。 對(duì)于中壓和高壓色譜則需要用分析HPLC條件進(jìn)行選擇。 優(yōu)化條件時(shí)，尋求較小的容量因子(k99%；(2)純品幾乎完全回收，回收率95%；(3)分離程序簡(jiǎn)單，不需要為了得到純品進(jìn)一步分析所得到的組分。制備色譜技術(shù)過(guò)載：低濃度時(shí)，進(jìn)樣量增加使得容量因子改變超過(guò)1039濃度過(guò)載和體積過(guò)載 制備色譜技術(shù)K不變，線性結(jié)果可預(yù)測(cè)K變化，非線性結(jié)果難預(yù)測(cè)40邊緣切割與循環(huán)色譜分離 分離不佳時(shí) 制備色譜技術(shù)密閉進(jìn)樣器是將流經(jīng)檢測(cè)器的柱流出液通過(guò)多通閥連至泵的入口；交替柱循環(huán)裝置是連接兩根色譜柱

16、，通過(guò)閥門將第二根色譜柱切割得到的樣品再加到第一根色譜柱上循環(huán)分離。41中心切割制備色譜技術(shù) 適當(dāng)損失組分，但避免色譜峰兩端微量組分的污染。42制備加壓色譜設(shè)備要求(1)泵：流量大，壓力不需要太大；(2)進(jìn)樣器：大樣品環(huán)六通閥，環(huán)管細(xì)而長(zhǎng)而不是短而粗，樣品溶液低濃度，大體積；(3)色譜柱：裝填均勻常采用柱床壓縮技術(shù)即徑向壓縮和軸向壓縮；(4)檢測(cè)器：不需要高靈敏；制備色譜技術(shù)43快速色譜法 簡(jiǎn)單易行制備色譜技術(shù)44低壓和中壓色譜法 第七章 制備色譜技術(shù)45制備HPLC 制備色譜技術(shù)參數(shù)內(nèi)徑/mm長(zhǎng)度/cm填料粒徑/m柱效進(jìn)樣量/mg分析型柱4-5253.5, 5500002525-5010更低更大46生產(chǎn)級(jí)的HPLC (1)溶劑花費(fèi)是最大成本，昂貴、毒性、難處理溶劑不使用；(2)填料易得，性能好，重現(xiàn)性好；(3)溶劑回收再用；(4)直徑大于5cm的色譜柱需專門設(shè)計(jì)，保證床層穩(wěn)定，避免高壓破壞。制備色譜技術(shù)47模擬移動(dòng)床色譜(SMB) 通常的色譜存在下列問(wèn)題：(1)不能連續(xù)操作；(2)溶劑和分離材料利用率低；(3)流出組分被高度稀釋； SMB同樣的分離材料，