酶工程第五章酶改性的基本理論——酶的結(jié)構(gòu)及其與催化特性的關(guān)系ppt課件

1、林范學(xué)fanxuelingmail第二篇 酶的改性u(píng)酶的改性enzyme improving ：u 經(jīng)過(guò)各種方法使酶的催化特性得以改良的技術(shù)過(guò)程u 酶的改性的目的u提高酶的催化效率u添加酶的穩(wěn)定性u(píng)降低或消除酶的抗原性u(píng)提高酶的運(yùn)用效率反復(fù)或延續(xù)運(yùn)用酶u擴(kuò)展酶的運(yùn)用范圍研討酶在水溶液以外的條件下進(jìn)展催化反響的特性和條件u酶的構(gòu)造與功能的關(guān)系研討u常用的方法:u酶分子修飾enzyme molecule modification u酶分子定向進(jìn)化enzyme molecule directed evolutionu酶固定化enzyme immobilizationu酶非水相催化enzyme cat

2、alysis in non-aqueous phase第五章 酶改性的根本實(shí)際酶的構(gòu)造及其與催化特性的關(guān)系 u第一節(jié) 酶的化學(xué)組成u第二節(jié) 酶的化學(xué)構(gòu)造u第三節(jié) 酶的空間構(gòu)造u第四節(jié) 酶的活性中心u第五節(jié) 酶的構(gòu)造與催化特性的關(guān)系第一節(jié) 酶的化學(xué)組成酶酶蛋白類(lèi)酶蛋白類(lèi)酶蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)酶蛋白酶蛋白核酸類(lèi)酶核酸類(lèi)酶RNA酶酶RAN氨基酸氨基酸20種種核苷酸核苷酸4種種一、蛋白類(lèi)酶的根本組成單位氨基酸u氨基酸構(gòu)造u肽鍵二、核酸類(lèi)酶的根本組成單位核苷酸u堿基+核糖+磷酸=核苷酸u3,5-磷酸二酯鍵5AMP5GMP5UMP5CMP三、酶的輔因子u單成分酶：僅有蛋白質(zhì)或核糖核酸組成的酶u雙成分酶：除了蛋白質(zhì)

3、或核糖核酸外，還有其他非生物大分子成分的酶。全酶全酶holoenzyme無(wú)催化活性無(wú)催化活性有催化活性有催化活性酶蛋白酶蛋白輔因子輔因子cofactor酶酶RNA輔因子輔因子cofactor+決議專(zhuān)注性決議專(zhuān)注性傳送電子、原子傳送電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)或某些化學(xué)基團(tuán)1. 無(wú)機(jī)輔因子u金屬離子的作用： 參與催化反響 、穩(wěn)定酶的構(gòu)象。元素主要生物化學(xué)功能硒 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和其他酶類(lèi)的輔因子鐵 血紅素酶過(guò)氧化氫酶，細(xì)胞色素氧化酶的輔基銅 細(xì)胞色素氧化酶的輔酶鋅 脫氫酶類(lèi)，DNA聚合酶，碳酸酐酶的輔因子錳 精氨酸酶和其他酶的輔因子鉬 黃嘌呤氧化酶的輔因子鎳 脲酶的輔因子釩 硝酸復(fù)原酶的輔因子u無(wú)

4、機(jī)輔助因子主要是指各種金屬離子，尤其是各種二價(jià)金屬離子。1鎂離子 鎂離子是多種酶的輔助因子，在酶的催化中起重要作用。例如，各種激酶、檸檬酸裂合酶、異檸檬酸脫氫酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、各種自我剪接的核酸類(lèi)酶等都需求鎂離子作為輔助因子。1. 無(wú)機(jī)輔因子2鋅離子 鋅離子是各種金屬蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶等的輔助因子，也是銅鋅-超氧化物歧化酶Cu，Zn-SOD、碳酸酐酶、羧肽酶、醇脫氫酶、膠原酶等的輔助因子。3鐵離子 鐵離子與卟啉環(huán)結(jié)合成鐵卟啉，是過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、色氨酸雙加氧酶、細(xì)胞色素B等的輔助因子。鐵離子也是鐵-超氧化物歧化酶Fe-SOD、固氮酶、黃嘌呤氧化酶、琥珀

5、酸脫氫酶、脯氨酸羧化酶的輔助因子。4銅離子 銅離子是銅鋅-超氧化物歧化酶、抗壞血酸氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、賴(lài)氨酸氧化酶、酪氨酸酶等的輔助因子。5錳離子 錳離子是錳-超氧化物歧化酶MnSOD、丙酮酸羧化酶、精氨酸酶等的輔助因子。6 鈣離子鈣離子 鈣離子是鈣離子是-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的輔助因子。胰凝乳蛋白酶等的輔助因子。2. 有機(jī)輔因子u是指雙成分酶中相對(duì)分子量較小的有機(jī)化合物。它們?cè)诿复呋^(guò)程中起著傳送電子、原子或基團(tuán)的作用。u (1)傳送電子體：如 卟啉鐵、鐵硫簇；u (2)傳送氫遞氫體：如FMN/FAD、NAD+/NADP+、CoQ、硫辛酸；u

6、 (3)傳送酰基體：如 CoA、TPP、硫辛酸；u (4)傳送一碳基團(tuán)：如 四氫葉酸；u (5)傳送磷酸基：如 ATP，GTP；u (6)其它作用： 轉(zhuǎn)氨基，如 磷酸吡哆醛VB6 ；傳送CO2，如 生物素。(1) 煙酰胺核苷酸(NAD+， NADP+)B族維生素許多脫氫酶的輔因子：乳酸脫氫酶、醇脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶NAD+：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，輔酶I普通與呼吸鏈相連，與分解反響偶聯(lián)：醇脫氫酶催化伯醇脫氫生成醛RCH2CH2OH+NAD+=RCH2CHO+NADH+H+NADP+：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，輔酶 。普通與合成反響相偶聯(lián)。(2) 黃素核苷酸(FMN和FAD)維生素

7、B2(核黃素)的衍生物各種黃素酶(氨基酸氧化酶、琥珀酸脫氫酶等)的輔助因子FMN：黃素單核苷酸FAD：黃素腺嘌呤二核苷酸FMN和FAD的主要作用是傳送氫。(3)鐵卟啉鐵卟啉是一些氧化酶如過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶等的輔助因子。它經(jīng)過(guò)共價(jià)鍵與酶蛋白結(jié)實(shí)結(jié)合 。(4)硫辛酸 硫辛酸全稱(chēng)為6,8-二硫辛酸。它在氧化復(fù)原酶的催化作用中，經(jīng)過(guò)氧化型和復(fù)原型的相互轉(zhuǎn)變而起傳送氫的作用 。(5)核苷三磷酸(NTP)腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、鳥(niǎo)苷三磷酸(CTP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)等。它們是磷酸轉(zhuǎn)移酶的輔助因子。 (6)鳥(niǎo)苷鳥(niǎo)苷是含型IVS的自我剪接酶(R-酶)的輔助因子。(7) 輔酶Q

8、輔酶Q是一系列苯醌衍生物一些氧化復(fù)原酶的輔助因子。(8) 谷胱甘肽(GSH)L-GluL-IleL-Gly三肽(9) 輔酶A CoA輔酶A是各種?；傅妮o酶，由一分子腺苷二磷酸、一分子泛酸和一分子巰基乙胺組成。(10)生物素生物素是維生素B的一種，又稱(chēng)維生素H生物素是羧化酶的輔助因子，在酶催化反響中，起CO2的滲入作用。(11) 硫胺素焦磷酸(TPP)即維生素B1，是酮酸脫羧酶的輔助因子。 (12)磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺即維生素B6，是各種轉(zhuǎn)氨酶的輔助因子。在酶催化氨基酸和酮酸的轉(zhuǎn)氨過(guò)程中，維生素B6經(jīng)過(guò)磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺的相互轉(zhuǎn)變，起到氨基轉(zhuǎn)移作用第二節(jié) 酶的化學(xué)構(gòu)造一、酶蛋白的化學(xué)構(gòu)

9、造即一級(jí)構(gòu)造，是指蛋白質(zhì)中的氨基酸按照特定的陳列順序經(jīng)過(guò)肽鍵銜接起來(lái)的多肽鏈構(gòu)造。 氨基酸的種類(lèi)和數(shù)目氨基酸的陳列次序二硫鍵的數(shù)目和位置肽鏈的數(shù)目等。每種蛋白質(zhì)都由獨(dú)一而確定的遺傳信息決議氨基酸序列一級(jí)構(gòu)造決議蛋白質(zhì)的高級(jí)構(gòu)造u氨基酸：20種AA的構(gòu)造特點(diǎn)的構(gòu)造特點(diǎn) -AA； 除除Gly外都具有光學(xué)性外都具有光學(xué)性(有有D-和和L-型兩種光學(xué)異構(gòu)體型兩種光學(xué)異構(gòu)體)。構(gòu)造通式構(gòu)造通式:不帶電方式 H2NCHCOOHR +H3NCHCOO-R兩性離子方式l-氨基酸賴(lài)氨酸賴(lài)氨酸lL-型和D-型丙氨酸丙氨酸 levorotatory dextrotatoryu肽：一個(gè)氨基酸的-羧基和另一個(gè)氨基酸的-

10、氨基脫水縮合而成的化合物。u肽鍵peptide bond：一個(gè)氨基酸的-COOH 和相鄰的另一個(gè)氨基酸-NH2脫水所構(gòu)成的共價(jià)鍵。CCNOCR1R2HHHl肽單位：CN，半雙鍵性，半雙鍵性partial double-bond character，不能旋轉(zhuǎn)，不能旋轉(zhuǎn)CC、 N C，真正單鍵，真正單鍵pure single bond，可以旋轉(zhuǎn)，可以旋轉(zhuǎn)l二硫鍵：2個(gè)Cys的巰基脫氫結(jié)合而成SSSSSS肽鏈內(nèi)二硫鍵肽鏈內(nèi)二硫鍵肽鏈間二硫鍵肽鏈間二硫鍵牛胰核糖核酸牛胰核糖核酸酶一級(jí)構(gòu)造酶一級(jí)構(gòu)造胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶chymotrypsinu酶蛋白化學(xué)構(gòu)造的測(cè)定1酶蛋白的分別純化純度97沉淀、離心

11、、電泳、層析等等2氨基酸種類(lèi)和數(shù)目確實(shí)定蛋白質(zhì)水解后用層析技術(shù)等分別鑒定。氨基酸自動(dòng)分析儀3肽鏈數(shù)目確實(shí)定經(jīng)過(guò)末端分析等方法測(cè)定肽鏈的數(shù)目經(jīng)過(guò)復(fù)原法翻開(kāi)二硫鍵在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的-巰基乙醇處置，使二硫鍵復(fù)原為巰基，然后用烷基化試劑維護(hù)生成的巰基，防止重新被氧化。4氨基酸順序測(cè)定酶蛋白不完全水解各種小肽末端分析綜合分析u末端分析u二硝基氟苯FDNB法N-末端分析FDNB + 肽肽pH8.5-HFDNP肽肽HCl水解水解DNPAA + 其他其他AANO2FNO2FDNBNO2NHNO2NO2NHNO2PolypeptideDNB derivative of Pol

12、ypeptideDNB derivative of N-termimal residueFree AA6 M HCl+HFu肼解法C-末端分析氨基酸酰肼氨基酸酰肼二亞芐衍生物不溶于水二亞芐衍生物不溶于水二、酶RNA的化學(xué)構(gòu)造u酶RNA的化學(xué)構(gòu)造主要包括組成RNA的核苷酸種類(lèi)、數(shù)目和陳列順序。u4種核苷酸：AMP，GMP，CMP，UMPu3-5磷酸二酯鍵銜接u酶RNA化學(xué)構(gòu)造的測(cè)定u核酸自動(dòng)測(cè)序儀u高通量測(cè)序High-throughput sequencing又稱(chēng)“下一代測(cè)序技術(shù)“Next-generation sequencing technology，以能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子

13、進(jìn)展序列測(cè)定和普通讀長(zhǎng)較短等為標(biāo)志。u大規(guī)模平行簽名測(cè)序Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)u聚合酶克隆Polony Sequencingu454焦磷酸測(cè)序454 pyrosequencinguIllumina (Solexa) sequencinguABI SOLiD sequencingu離子半導(dǎo)體測(cè)序Ion semiconductor sequencinguDNA 納米球測(cè)序 DNA nanoball sequencing等。l傳統(tǒng)方法:l(1)酶RNA的分別純化，得到較純的RNA樣品l(2)將RNA水解成各種核苷酸，確定核苷酸的種

14、類(lèi)和數(shù)量l(3)用特異性酶切法或雙脫氧終止法進(jìn)展RNA序列測(cè)定第三節(jié) 酶的空間構(gòu)造u酶蛋白的空間構(gòu)造：二、三、四級(jí)構(gòu)造u酶RNA的空間構(gòu)造：二、三級(jí)構(gòu)造一、酶蛋白的空間構(gòu)造u包括二級(jí)構(gòu)造、三級(jí)構(gòu)造、四級(jí)構(gòu)造u根本構(gòu)造單位：螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角、卷曲等構(gòu)造1、酶蛋白的副鍵1氫鍵: 肽鍵中羰基的氧原子等與亞氨基、羥基、氨基等基團(tuán)中氫原子結(jié)合成的副價(jià)鍵2鹽鍵：蛋白質(zhì)分子中氨基與羧基構(gòu)成，結(jié)合力較強(qiáng)COHNCOHNHHCOHONHHOCO3酯鍵：蛋白質(zhì)分子中羧基與氨基酸上的羥基脫水而縮合而成4二硫鍵：由蛋白質(zhì)分子上兩個(gè)半胱氨酸殘基上巰基經(jīng)過(guò)氧化脫氫而成，對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性起重要作用OHR2R1COO+R1CO

15、OR2HH2OR1SSR25疏水鍵：蛋白質(zhì)分子中疏水性較強(qiáng)的側(cè)鏈基聚會(huì)集而成，對(duì)穩(wěn)定蛋白有一定作用；6范德華力：借助靜電引力而構(gòu)成，鍵能較小7金屬鍵：經(jīng)過(guò)金屬離子與蛋白質(zhì)中基團(tuán)結(jié)合而成，維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)型有一定作用，在四級(jí)構(gòu)造中結(jié)合亞基。Copper chaperone protein PcoC 銅伴侶蛋白銅伴侶蛋白 2、酶蛋白的二級(jí)構(gòu)造 u主要指多肽鍵主鏈原子的部分空間陳列，普通不思索側(cè)鏈的構(gòu)象。u包括：u-螺旋構(gòu)造u-片層構(gòu)造u-轉(zhuǎn)角構(gòu)造u無(wú)規(guī)卷曲1-螺旋構(gòu)造u-螺旋構(gòu)造是由蛋白質(zhì)的肽鏈環(huán)繞中心軸有規(guī)那么一圈一圈盤(pán)旋而成。u右手螺旋-helix螺距為螺距為0.54nm,含含3.6個(gè)個(gè)AA殘

16、基殘基兩個(gè)兩個(gè)AA之間的間隔為之間的間隔為0.15nm；AA殘基側(cè)鏈伸向外側(cè)，相鄰的殘基側(cè)鏈伸向外側(cè)，相鄰的螺圈之間構(gòu)成鏈內(nèi)氫鍵；螺圈之間構(gòu)成鏈內(nèi)氫鍵；主要靠氫鍵維持主要靠氫鍵維持 - -螺旋有左旋和右旋兩種，螺旋有左旋和右旋兩種，右旋比左旋更加穩(wěn)定，因此右旋比左旋更加穩(wěn)定，因此也更常見(jiàn)。也更常見(jiàn)。2-片層構(gòu)造(pleated sheet)u又稱(chēng)-折疊，是兩條或多條肽鏈充分伸展成鋸齒狀的折疊構(gòu)造，經(jīng)過(guò)側(cè)向聚集，構(gòu)成與肽鏈長(zhǎng)軸方向平行的折扇狀構(gòu)象。u肽鏈幾乎完全伸展，經(jīng)過(guò)鏈間的氫鍵交聯(lián)維持構(gòu)造；肽鏈幾乎完全伸展，經(jīng)過(guò)鏈間的氫鍵交聯(lián)維持構(gòu)造；u肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象，肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象

17、，R R基團(tuán)處于折疊平面的兩側(cè)?；鶊F(tuán)處于折疊平面的兩側(cè)。平行式反平行式3-轉(zhuǎn)角構(gòu)造turnu又稱(chēng)轉(zhuǎn)彎或發(fā)卡構(gòu)造，是在球蛋白中發(fā)現(xiàn)。u球狀蛋白的多肽鏈經(jīng)常出現(xiàn)球狀蛋白的多肽鏈經(jīng)常出現(xiàn)180180的回折，這個(gè)回折角就是的回折，這個(gè)回折角就是 轉(zhuǎn)角構(gòu)造；轉(zhuǎn)角構(gòu)造；u它由四個(gè)它由四個(gè)AAAA殘基組成殘基組成; ;u回折處的第一個(gè)回折處的第一個(gè)AAAA殘基的殘基的 -C=O -C=O 和第四個(gè)和第四個(gè)AAAA殘基的殘基的 N-H N-H 之間構(gòu)成氫鍵，構(gòu)成一個(gè)不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)。之間構(gòu)成氫鍵，構(gòu)成一個(gè)不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)。u-轉(zhuǎn)角構(gòu)造中常出現(xiàn)的轉(zhuǎn)角構(gòu)造中常出現(xiàn)的AAAA有有GlyGly、ProPro、AspA

18、sp、AsnAsn、TrpTrp等等4無(wú)規(guī)卷曲nonregular coilu又稱(chēng)自在回轉(zhuǎn)random coil)，是肽鏈的主鏈不規(guī)那么、多向性地隨機(jī)盤(pán)曲所構(gòu)成構(gòu)象。在同一種蛋白質(zhì)中，無(wú)規(guī)卷曲出現(xiàn)的部位和構(gòu)造完全一樣有規(guī)律在同一種蛋白質(zhì)中，無(wú)規(guī)卷曲出現(xiàn)的部位和構(gòu)造完全一樣有規(guī)律不同蛋白質(zhì)中或同一蛋白中不同肽段中，無(wú)規(guī)卷曲方式多樣無(wú)規(guī)律不同蛋白質(zhì)中或同一蛋白中不同肽段中，無(wú)規(guī)卷曲方式多樣無(wú)規(guī)律通常酶的活性中心常處在這一構(gòu)象區(qū)域里。通常酶的活性中心常處在這一構(gòu)象區(qū)域里。轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角折疊折疊 螺旋螺旋無(wú)規(guī)卷曲無(wú)規(guī)卷曲3、超二級(jí)構(gòu)造和構(gòu)造域u超二級(jí)構(gòu)造(supersecondary structure，M

19、otif)：是指假設(shè)干相鄰的二級(jí)構(gòu)造中的構(gòu)象單元彼此相互作用，構(gòu)成有規(guī)那么的，在空間上能識(shí)別的二級(jí)構(gòu)造組合體。u， 。u超二級(jí)構(gòu)造- 花式-loop- 花式-loop- 花式u構(gòu)造域domain ：是在超二級(jí)構(gòu)造根底上進(jìn)一步卷曲折疊成嚴(yán)密的近似球狀的構(gòu)造，在空間上彼此分隔，各自具有部分生物功能的構(gòu)造。 由由4 4個(gè)個(gè)組成的組成的/桶構(gòu)造域桶構(gòu)造域/桶構(gòu)造域：丙酮酸激酶桶構(gòu)造域：丙酮酸激酶 小的蛋白質(zhì)分子只需一個(gè)小的蛋白質(zhì)分子只需一個(gè) 構(gòu)造域構(gòu)造域 構(gòu)造域三級(jí)構(gòu)造構(gòu)造域三級(jí)構(gòu)造 大的蛋白質(zhì)分子有數(shù)個(gè)結(jié)大的蛋白質(zhì)分子有數(shù)個(gè)結(jié) 構(gòu)域構(gòu)域丙酮酸激酶丙酮酸激酶己糖激酶己糖激酶前清蛋白前清蛋白肌紅蛋白肌紅

20、蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白4、三級(jí)構(gòu)造Tertiary Structureu在二級(jí)構(gòu)造根底上，肽鏈不同區(qū)段的側(cè)鏈基團(tuán)相互作用，進(jìn)一步環(huán)繞、折疊構(gòu)成的的空間構(gòu)造。u不思索亞基和分子間的相互關(guān)系u作用力主要有：u氫鍵、疏水鍵、離子鍵、范德華力和二硫鍵等。多肽鏈多肽鏈?zhǔn)杷I疏水鍵氫鍵氫鍵二硫鍵二硫鍵離子鍵離子鍵CH2OH CH2OH CH2OHCH2OH范德華力范德華力維持三級(jí)構(gòu)造的作用力維持三級(jí)構(gòu)造的作用力u蛋白質(zhì)三級(jí)構(gòu)造的特征1三級(jí)構(gòu)造是具有二級(jí)構(gòu)造的肽鏈環(huán)繞折疊構(gòu)成的三維球狀構(gòu)造。2分子中的非極性基團(tuán)集中在分子內(nèi)部，構(gòu)成酶分子的骨架，稱(chēng)為疏水核；而極性基團(tuán)相對(duì)集中于酶分子外表，構(gòu)成親水區(qū)。3酶分

21、子外表往往有一個(gè)內(nèi)陷的凹槽，又稱(chēng)為裂隙，酶分子的活性中心就在其中。由一個(gè)具有三級(jí)構(gòu)造的酶蛋白組成的酶分子稱(chēng)為單體酶monomeric enzyme。普通由一條肽鏈組成，也可由多條肽鏈組成。u人類(lèi)他克莫司結(jié)合蛋白三級(jí)構(gòu)造Crystal structure of Homo. sapiens FKBP12 tertiary structure 人類(lèi)他克莫司結(jié)合蛋白三級(jí)構(gòu)造人類(lèi)他克莫司結(jié)合蛋白三級(jí)構(gòu)造 u胰凝乳蛋白酶241個(gè)個(gè)AA3條肽鏈條肽鏈5、四級(jí)構(gòu)造Quaternary Structureu由兩條或兩條以上具有三級(jí)構(gòu)造的肽鏈聚合而成的特定構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子叫蛋白質(zhì)的四級(jí)構(gòu)造；u其中具有獨(dú)立三級(jí)構(gòu)造

22、的一條肽鏈叫亞基subunit)，無(wú)生物功能；u由幾個(gè)亞基聚集而成的蛋白質(zhì)經(jīng)常稱(chēng)為寡聚蛋白。u四級(jí)構(gòu)造指寡聚蛋白中亞基的種類(lèi)、數(shù)目、各亞基的空間排布及其相互作用等。u寡聚蛋白中亞基數(shù)目相差很大u過(guò)氧化氫酶4個(gè)亞基u大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶12個(gè)亞基u四級(jí)構(gòu)造的穩(wěn)定性主要靠亞基之間的疏水鍵維持 由由2 2種亞基種亞基 、 各各2 2個(gè)個(gè)締合而成，締合而成， 亞基呈球形亞基呈球形 亞基兩兩一樣，分別為亞基兩兩一樣，分別為1 1 、22、11、22 每個(gè)亞基都含有一個(gè)血紅每個(gè)亞基都含有一個(gè)血紅素輔基素輔基血紅蛋白血紅蛋白hemoglobin hemoglobin 氨基酸序列大不一氨基酸序列大不一樣

23、，但構(gòu)造三級(jí)樣，但構(gòu)造三級(jí)類(lèi)似，功能也類(lèi)似類(lèi)似，功能也類(lèi)似載氧載氧構(gòu)造決議功能。構(gòu)造決議功能。二、酶RNA的空間構(gòu)造1、酶RNA的二級(jí)構(gòu)造指單鏈酶RNA分子的本身回折、鏈內(nèi)互補(bǔ)堿基配對(duì)構(gòu)成的部分雙螺旋區(qū)及非配對(duì)順序構(gòu)成的突環(huán)之間的空間排布。雙螺旋由RNA中互補(bǔ)堿基配對(duì)而成，至少含46個(gè)對(duì)堿基，占?jí)A基數(shù)量的40%-70%。互補(bǔ)堿基對(duì)通常是G-C，A-U，G-Uu突環(huán)：由不互補(bǔ)配對(duì)的堿基組成u發(fā)夾環(huán)hairpin loopu膨脹環(huán)expansion loopu內(nèi)環(huán)internal loopu多分枝環(huán)multi branching loophairpin loop expansion loopint

24、ernal loopmulti branching loopH：hairpin loopI： internal loopB：bulge loop (expansion loop)M: multi branching loop(1)錘頭構(gòu)造hammer head structureu11個(gè)保守堿基u3個(gè)雙螺旋區(qū)Cleavage site(2)發(fā)卡構(gòu)造 hairpin structureu50個(gè)左右核苷酸u4個(gè)雙螺旋u5個(gè)突環(huán)u兩個(gè)構(gòu)造域螺旋-突環(huán)-螺旋(3)多分枝環(huán)構(gòu)造(multi branching loop)The sequence and secondary structure of th

25、e VS (Varkud satellite) ribozyme. 底物底物剪切位點(diǎn)剪切位點(diǎn)A730 loop, an important component of the active site of the ribozyme. 活性中心活性中心2、酶RNA的三級(jí)構(gòu)造u酶RNA的三級(jí)構(gòu)造是在二級(jí)構(gòu)造的根底上，進(jìn)一步環(huán)繞折疊而成的三維構(gòu)造。u分成多個(gè)構(gòu)造域，每個(gè)構(gòu)造域又由多個(gè)螺旋和突環(huán)環(huán)繞折疊而成。Structure of the Tetrahymena Ribozyme.(A) The secondary structure of the crystallized ribozyme. (B)

26、 RIBBONS diagram of the crystal structure of the ribozyme B moleculeTetrahymena Group I intron secondary and tertiary structures 第四節(jié) 酶的活性中心u酶分子具有催化活性的特殊部位稱(chēng)為酶的活性部位active site)或活性中心active center。一、酶活性中心上的氨基酸殘基u酶的分子中存在著許多功能基團(tuán)，例如，-NH2、-COOH、-SH、-OH等，但并不是這些基團(tuán)都與酶活性有關(guān)。u構(gòu)成酶活性中心的只需少數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基?；钚灾行牡闹匾?dú)埢蚧鶊F(tuán)出現(xiàn)頻率最

27、高的氨基酸Ser, His, Cys, Tyr, Asp, Glu, Lys經(jīng)常出現(xiàn)的氨基酸Arg, Asn, Gln偶爾出現(xiàn)的氨基酸Trpu胰凝乳蛋白酶 chymotrypsinAsp 102His 57Ser 195Asp 194Gly 193Ile 16+NH3Catalytic Triadu2酶分子中的氨基酸殘基u(1)接觸殘基(contact residues) :這類(lèi)殘基直接與底物接觸，參與底物的化學(xué)轉(zhuǎn)變 。這類(lèi)殘基的側(cè)鏈中起與底物結(jié)協(xié)作用的基團(tuán)稱(chēng)為結(jié)合基團(tuán)；起催化作用的基團(tuán)稱(chēng)為催化基團(tuán)。有時(shí)結(jié)合基團(tuán)也參與催化作用，很難絕對(duì)區(qū)分。 u(2)輔助殘基(auxiliary residu

28、es) ：這類(lèi)殘基不與底物直接接觸，而是在使酶與底物結(jié)合及協(xié)助接觸殘基發(fā)揚(yáng)作用方面起一定作用 。 接觸殘基和輔助殘基構(gòu)成酶的活性中心。 u(3)構(gòu)造殘基(structure residues) ：這類(lèi)殘基在維持酶分子的完好空間構(gòu)造并使之構(gòu)成特定的空間構(gòu)象方面起重要作用。與酶活性親密相關(guān)，但不在酶活性中心范圍之內(nèi)，屬于酶活性中心外的必需范圍。接觸殘基、輔助殘基和構(gòu)造殘基三類(lèi)殘基統(tǒng)稱(chēng)為酶的必需基團(tuán)，假設(shè)被其它氨基酸殘基取代，那么往往呵斥酶失活。u(4)非奉獻(xiàn)殘基(non-contributing residues) :除了上述三類(lèi)酶的必需基團(tuán)外，酶分子上其他的氨基酸殘基都可稱(chēng)為非奉獻(xiàn)殘基或非必需基

29、團(tuán)。 u酶分子中的氨基酸殘基1960年，Koshland1接觸殘基接觸殘基contacting residues直接與底物相接觸，直接與底物相接觸，并參與底物的化學(xué)轉(zhuǎn)變。與底物并參與底物的化學(xué)轉(zhuǎn)變。與底物結(jié)合的基團(tuán)稱(chēng)為結(jié)合基團(tuán)；起催結(jié)合的基團(tuán)稱(chēng)為結(jié)合基團(tuán)；起催化作用的基團(tuán)稱(chēng)為催化基團(tuán)?；饔玫幕鶊F(tuán)稱(chēng)為催化基團(tuán)。 2輔助殘基輔助殘基auxiliary residues不直接參與催化作用，不直接參與催化作用，在酶與底物結(jié)合的過(guò)程中起作用。在酶與底物結(jié)合的過(guò)程中起作用。接觸殘基和輔助殘基構(gòu)成酶的活接觸殘基和輔助殘基構(gòu)成酶的活性中心。性中心。 3構(gòu)造殘基構(gòu)造殘基structure residues又稱(chēng)

30、為奉獻(xiàn)殘基又稱(chēng)為奉獻(xiàn)殘基contributing residues，維，維持酶蛋白分子的完好極其規(guī)那么持酶蛋白分子的完好極其規(guī)那么的空間構(gòu)象的空間構(gòu)象4非奉獻(xiàn)殘基非奉獻(xiàn)殘基non-contributing residues，對(duì)酶，對(duì)酶的構(gòu)造和功能無(wú)明顯作用的構(gòu)造和功能無(wú)明顯作用底底 物物 活性中心以外活性中心以外的必需基團(tuán)的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)催化基團(tuán) 活性中心活性中心 酶分子酶分子活性中心活性中心活性中心外維持空間構(gòu)象作活性中心外維持空間構(gòu)象作用用接觸殘基接觸殘基協(xié)助催化作用協(xié)助催化作用構(gòu)造殘基構(gòu)造殘基催化活性催化活性顯示作用顯示作用其他方面的作用活性調(diào)理、防止降解、運(yùn)輸轉(zhuǎn)移其他

31、方面的作用活性調(diào)理、防止降解、運(yùn)輸轉(zhuǎn)移非奉獻(xiàn)殘基非奉獻(xiàn)殘基與底物結(jié)合、與底物結(jié)合、催化作用催化作用輔助殘基輔助殘基uR酶活性中心u酶RNA的某一段核苷酸序列。uL-19 IVS活性中心由第 2227位的六個(gè)核苷酸序列：5GGAGGG3u只需將其中的堿基置換一個(gè)，就可以使其底物專(zhuān)注性發(fā)生改動(dòng)uI類(lèi)內(nèi)含子的酶學(xué)特性四膜蟲(chóng)L-19IVS的體外催化活性Intervening sequence lacking 19 nucleotide 短少短少19個(gè)核苷酸的居間序列個(gè)核苷酸的居間序列1986年女科學(xué)家年女科學(xué)家Grabowski,P.J.發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)L-19可以催化可以催化5聚胞苷聚胞苷5XpC聚合為聚合

32、為多聚胞苷。多聚胞苷。 uL-19IVS催化RNA寡核苷酸鏈延伸二、接觸殘基附近肽鏈的一級(jí)構(gòu)造u有些酶的催化機(jī)制非常類(lèi)似，在分類(lèi)中列為一小類(lèi)。u一樣的接觸殘基催化基團(tuán)u在接觸殘基附近的肽鏈一級(jí)構(gòu)造也幾乎完全一樣u酶活性中心在種系進(jìn)化上存在嚴(yán)厲的保守性u(píng)一些絲氨酸蛋白酶活性中心絲氨酸附近的肽鏈組成酶酶活性中心附近的氨基酸順序活性中心附近的氨基酸順序胰蛋白酶牛胰蛋白酶牛Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶牛牛Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-P

33、ro-Leu-Val-Cys-Lys-Lys-Asn彈性蛋白酶彈性蛋白酶豬豬Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn凝血酶牛凝血酶牛Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro蛋白酶蛋白酶S. griseusThr-Cys-Glu-Gly-Asp-*Ser-Gly-Gly-Pro-Met-Pheu一些半胱氨酸蛋白酶活性中心的半胱氨酸殘基附近的氨基酸順序酶酶活性中心附近的氨基酸順序活性中心附近的氨基酸順序木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶P

34、ro-Val-Lys-Asn-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-*Cys-Trp無(wú)花果蛋白無(wú)花果蛋白酶酶Pro-Ile-Arg-Gln-Glu-Gly-Gln-Cys-Gly-Ser-*Cys-Trp菠蘿蛋白酶菠蘿蛋白酶Asn-Gln-Asp-Pro-Cys-Gly-Ala-*Cys-Trp第五節(jié) 酶的構(gòu)造與催化特性的關(guān)系一、酶的一級(jí)構(gòu)造與催化特性的關(guān)系酶的一級(jí)構(gòu)造是酶的根本化學(xué)構(gòu)造，決議了酶的空間構(gòu)造、生物學(xué)活性酶的一級(jí)構(gòu)造的改動(dòng)包括酶分子主鏈的斷裂和銜接，酶分子組成氨基酸的改動(dòng)，都能夠?qū)γ傅拇呋匦援a(chǎn)生影響1、主鏈斷裂的位置遠(yuǎn)離活性中心，切去部分非奉獻(xiàn)殘基，一級(jí)構(gòu)造的變化對(duì)酶

35、活性幾乎沒(méi)有影響牛核糖核酸酶RNase 124aa C末端3 aaM1 RNA 377nt 3end 122 nt2、主鏈斷裂的位置接近活性中心，切去部分接觸殘基、輔助殘基，引起酶活性喪失牛核糖核酸酶RNase 124aa C末端4 aaM1 RNA 377nt 5end 70 nt3、對(duì)酶的前體或酶原，酶主鏈特定位置斷裂，顯示出酶的催化活性(1)胰蛋白酶原無(wú)活性胰蛋白酶有活性(2)胰凝乳蛋白酶原u u2. 胰凝乳蛋白酶 原 的 激 活p.50 245aa 5245aa 5對(duì)二硫鍵對(duì)二硫鍵斷裂：斷裂：Arg15 Arg15 與與Ile16Ile16、Leu13Leu13與與Ser14Ser14

36、、 Tyr146 Tyr146與與Thr147Thr147、 Asn148 Asn148與與Ala149Ala149切除切除2 2個(gè)二肽：個(gè)二肽：Ser14-Arg15Ser14-Arg15、 Thr147-Asp148 Thr147-Asp148(2)胰凝乳蛋白酶原活化245aa 5對(duì)二硫鍵對(duì)二硫鍵斷裂：斷裂：Arg15 與與Ile16、Leu13與與Ser14、 Tyr146與與Thr147、 Asn148與與Ala149切除切除2個(gè)二肽：個(gè)二肽：Ser14-Arg15、 Thr147-Asp148113164258122 146149 168 182 191 201 221 245113

37146149 168 182 191 201 221 245113164258122 146149 168 182 191 201 221 245Trypsin-Chymotrypsin (active)-ChymotrypsinrypsinTwo dipeptidesA chainB chainC chain-ChymotrypsinrypsinChymotrypsinogen (inactive)His57Asp102Ser195555333G |OHUpstreamexonDownstreamexonIntronGOHGOH+G4143993945353L19RN

38、ASplicedexons四膜蟲(chóng)RNA的自我剪接(3) L-19 IVS構(gòu)成四膜蟲(chóng)四膜蟲(chóng)26S rRNA前體前體線(xiàn)狀間隔序列線(xiàn)狀間隔序列LIVSL-19 IVS自我剪接自我剪接自我剪切自我剪切多功能酶：水解多功能酶：水解RNA、轉(zhuǎn)核苷酸作、轉(zhuǎn)核苷酸作用、轉(zhuǎn)磷酸基作用用、轉(zhuǎn)磷酸基作用二、酶的二、三級(jí)構(gòu)造與催化功能的關(guān)系u完好的二、三級(jí)構(gòu)造對(duì)維持酶的活性中心的空間構(gòu)象至關(guān)重要。u酶的二、三級(jí)構(gòu)造破壞將使酶的催化活性喪失。例如例如: 牛胰核糖核酸酶牛胰核糖核酸酶RNase A 124aa,活性中心：活性中心：His12 和和His119 切開(kāi)切開(kāi) N端端 120aa (S)肽肽 C端端 104aa (S)蛋白蛋白 無(wú)活性無(wú)活性 混合混合1：1，恢復(fù)活性，恢復(fù)活性RNase A 20aa，S-peptid 104aa ，S-peptid， inactive Subtilisin枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶 u核糖核酸酶變性與復(fù)性作用Native ribonucleaseDenative reduced ribonucleaseNative ribonuclease8 M urea and -mercapotoethanolDialysis變性變性復(fù)性復(fù)性三、酶的四級(jí)構(gòu)造