醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)例子

1、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)期別:xxx 班級(jí) :xx 學(xué)號(hào):xxxxxxxx 姓名:OOOIL-35 對(duì)小鼠型糖尿病的治療效果及免疫機(jī)制【立題依據(jù)】自身免疫性疾病 (Autoimmune diseases) 是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而 導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。如今越來越多的自身免疫性疾病被不斷發(fā)現(xiàn)和認(rèn) 識(shí), 也越來越引起人們的關(guān)注。型糖尿病 (T1DM 自身免疫性胰腺炎 ) 就是其中的一 員,在全球大約有 2000萬患者, 中國(guó)至少有 100萬的患者 , 但是型糖尿病常常在幼 兒和青少年時(shí)期發(fā)生且為一種多基因遺傳病有較高的遺傳度 (75%), 表現(xiàn)為明顯的家 族遺傳性。同時(shí) , 型糖尿病患

2、者如治療不善將引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥 ,如失明、腎衰 竭、心臟病、截肢等。因此如果能正確了解型糖尿病的免疫學(xué)機(jī)制 , 并探索更加 有效治療及預(yù)防方案 , 對(duì)于患者本身乃至整個(gè)家族的身體和生活質(zhì)量的提高意義重 大。型糖尿病的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制是體內(nèi)除了抗原提呈細(xì)胞 (APC)和活化的 T 淋巴 細(xì)胞外正常細(xì)胞幾乎不表達(dá) MHC- 類分子,研究表明 IFN- 轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島 細(xì)胞分泌 IFN- ,由于 IFN- 刺激MHC- 分子的表達(dá)這種小鼠的胰島 細(xì)胞高表 達(dá) MHC- 類分子 , 這樣以來免疫細(xì)胞就會(huì)結(jié)合并識(shí)別胰島 細(xì)胞然后對(duì)其進(jìn)行攻 擊, 使其喪失胰島素分泌活性 , 最終導(dǎo)致體內(nèi)胰島素缺乏。調(diào)節(jié)性

3、 T細(xì)胞(Treg) 是一 些 CD4+T cell 還可高表達(dá) IL-2 受體的 鏈(CD25)分子, 胞質(zhì)中表達(dá) Foxp3轉(zhuǎn)錄因 子的 T細(xì)胞分化亞群。它的主要功能是通過抑制 CD4+ Tcell 和 CD8+ Tcell 的活 化與增殖從而達(dá)到免疫的負(fù)調(diào)節(jié)作用。通過協(xié)調(diào) Treg 水平來調(diào)節(jié)型糖尿病患者 的免疫功能可能成為新的治療手段。白細(xì)胞介素 -35(IL-35) 是 2007 年新發(fā)現(xiàn)的一種獨(dú)特的具有免疫抑制功能的調(diào) 節(jié)因子,屬于IL 12細(xì)胞因子家族 ,IL-35 為異源二聚,主要由活化的 Treg分泌,對(duì) 多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子均有明顯的抑制作用 , 參與介導(dǎo)機(jī)體免疫耐受的形

4、成。 IL- 35是否對(duì)型糖尿病患者具有治療作用及其相關(guān)的免疫機(jī)制 ,還不十分清楚 , 仍有 待繼續(xù)研究和解決。【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹勘緦?shí)驗(yàn)就是通過提高 NOD系小鼠（ 型糖尿病患鼠 ）體內(nèi)的 IL-35 水平, 觀測(cè)小 鼠各期的血糖尿糖等水平及后期的型糖尿病發(fā)病率、胰島炎評(píng)分等 ,評(píng)定 IL-35 對(duì)型糖尿病的預(yù)防及治療效果 , 并與其它一些免疫抑制性的藥物 （環(huán)孢菌素 A）等, 進(jìn)行藥敏對(duì)比 ; 同時(shí), 體外測(cè)定小鼠體內(nèi) IL-4 及干擾素 - （IFN - ）的等含量及調(diào)節(jié) 性 T 淋巴細(xì)胞的含量等 , 對(duì)小鼠的免疫體質(zhì)及 IL-35 對(duì)型糖尿病作用的免疫學(xué)機(jī) 制有大體認(rèn)識(shí)及方向把握 , 為以后的

5、研究打下基礎(chǔ)。從而為新藥 （ 聯(lián)合藥 ） 的開發(fā), 免 疫抑制領(lǐng)域的深入研究有一定意義?！緦?shí)驗(yàn)對(duì)象】NOD系型糖尿病鼠和 NON系正常不患病鼠 （雌性 4周齡）起源在對(duì) ICR/Jcl 小鼠進(jìn)行近郊培育的第 6 代, 從白內(nèi)障易感亞系分離出非肥 胖糖尿病品系 （NOD）和非肥胖正常品系 （NON）。在近交 20代時(shí), 首先發(fā)現(xiàn) NOD雌鼠有 胰島素依賴性糖尿病。特征自發(fā)型糖尿病以及多種自身免疫疾病小鼠。通過病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn) ,NOD 小鼠自身免疫性胰島炎發(fā)生于 4周齡。 NOD小鼠發(fā)病后 ,充分呈現(xiàn)該品系小鼠糖尿 病的生理生化特征即 :尿頻·多飲·高血糖癥狀。在幾周的時(shí)間內(nèi)

6、,血糖迅速升高 , 飲水量劇增,大量的排尿,體重迅速下降,在這個(gè)過程中 ,患鼠血糖呈現(xiàn)迅速上升 ,后 逐步下降,但仍維持高于正常值的狀態(tài) ,體重直線下降 ,最后昏迷而死亡。于 12周齡 時(shí)出現(xiàn)明顯糖尿病癥狀 , 至 30周齡時(shí)雌性小鼠累計(jì)發(fā)病率可達(dá)到 80%。實(shí)驗(yàn)材料】試劑及儀器 IL-35 試劑,磷酸鹽緩沖液(PBS), 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ElISA) 試 劑盒,流式細(xì)胞儀,CD8及 CD4單克隆抗體,注射器等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)器械。【實(shí)驗(yàn)方法及步驟】1. 小鼠的分組與處理選取 NOD系型糖尿病鼠 20只和 NON系正常不患病鼠 10只,分為三組。 10 只 NOD系小鼠作為實(shí)驗(yàn)組 ,10 只 NO

7、D系小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 ,10 只 NON系正常不患 病鼠作為正常對(duì)照組。對(duì)各組四周齡小鼠采取 : 實(shí)驗(yàn)組注射 IL-35 注射液 , 每三天注 射一次,注射量根據(jù)生物試劑公司提供的 IL-35 試劑說明書為準(zhǔn) , 連續(xù)注射 7周; 實(shí) 驗(yàn)對(duì)照組和正常對(duì)照組注射等量的磷酸鹽緩沖液 (PBS), 注射方式同實(shí)驗(yàn)組。各組小 鼠自由飲食 , 飲水不限。2. 糖尿病及體重檢測(cè)從各組小鼠 10周齡開始每周記錄體重 , 每天采取斷尾方式測(cè)血糖含量和尿糖 含量,血糖連續(xù) 2天超過 16.00mmol/L 即診斷為糖尿病 ,30 周后觀察期滿終止觀察 , 計(jì)算各組小鼠發(fā)病率 ;3. 胰腺炎嚴(yán)重程度評(píng)分30 周

8、后,頸椎脫臼法處死各組小鼠 ,取各組小鼠胰島做 HE染色切片進(jìn)行病理 性胰島炎評(píng)分 :0 級(jí): 胰島完整無淋巴細(xì)胞浸潤(rùn) , 計(jì) 0分;1 級(jí): 有胰島周圍淋巴細(xì)胞浸 潤(rùn)(即胰島周圍炎 )或<25%的胰島面積受累 ,計(jì)1分;2 級(jí):浸潤(rùn)至胰島內(nèi),25%50%的 面積受累,計(jì)2分;3 級(jí):>50%的面積受累,計(jì)3分。記錄各組小鼠評(píng)分值。4. 細(xì)胞因子水平測(cè)定取足等量的各組小鼠外周血用 ELISA法檢測(cè) IL-4 及干擾素 - (IFN - )的含 量;5. CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T(Treg) 細(xì)胞亞群測(cè)定取各組小鼠脾臟制成單核細(xì)胞懸液 , 應(yīng)用流式細(xì)胞法檢測(cè)大鼠脾臟 CD4+CD

9、25+ 調(diào)節(jié)性 T (Treg) 細(xì)胞水平。7. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用 SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析?！绢A(yù)期結(jié)果及結(jié)論】預(yù)期結(jié)果實(shí)驗(yàn)組小鼠的發(fā)病率遠(yuǎn)低于對(duì)照組小鼠發(fā)病率 ;體重較對(duì)照組重 ; 且對(duì)照組飲 食飲水量遠(yuǎn)多于實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組 ; 血糖和尿糖含量比對(duì)照組低 ,并接近于正常對(duì) 照組( 可偏高 ); 干擾素 - (IFN - )的含量實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)遠(yuǎn)低于對(duì)照組和正常對(duì)照組 鼠,IL-4 則恰恰相反 ;調(diào)節(jié)性 T(Treg) 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組計(jì)數(shù)和活性較對(duì)照組和正常對(duì)照組 高。結(jié)果分析IL-35 具有明顯減少型糖尿病發(fā)生及減輕病情的作用 ;由于 IL-35 使 Th0細(xì) 胞向 Th2細(xì)胞分化 ,抑制

10、 Th1細(xì)胞分化 , 并升高調(diào)節(jié)性 T(Treg) 細(xì)胞水平。所以 IL- 35可能通過上調(diào)機(jī)體 Treg, 誘導(dǎo) Th1與 Th2的平衡向 Th2轉(zhuǎn)化,從而不會(huì)減少免疫 細(xì)胞對(duì)自體胰島 細(xì)胞識(shí)別與破壞 ,保證了胰島 細(xì)胞的正常胰島素分泌功能 ,維 持血糖的正常。為探索治療型糖尿病的新方法提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)可行性分析】雖然沒有用直接注射免疫抑制細(xì)胞因子來治療自身免疫病的相關(guān)報(bào)道 , 但本實(shí) 驗(yàn)設(shè)計(jì)方案合理 ;分組、對(duì)照完備 ; 體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)兼有 ;技術(shù)方法和路線可行。通 過免疫學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和理論的學(xué)習(xí) , 已掌握免疫細(xì)胞、免疫分子的檢測(cè)技術(shù) (ELISA 法), 具有可操作性 ;實(shí)驗(yàn)所需藥品、

11、試劑及動(dòng)物均較易獲得 , 具備開展實(shí)驗(yàn)的條件?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】【1】金伯泉·醫(yī)學(xué)免疫學(xué)·第五版·北京 : 人民衛(wèi)生出版社 ,2008 【2】宋文 剛·免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教材·北京 : 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社 ,2010 【3】孫黎飛·細(xì)胞免疫學(xué) 實(shí)驗(yàn)研究方法·北京 : 人民軍醫(yī)出版社 ,2009 【4】王培林 , 傅松濱·醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)· 第三版·北京科學(xué)技術(shù)出版社 2011【 5】哈佛醫(yī)學(xué)院 Brigham and Women's醫(yī)院 ,eBioscience 公司的科學(xué) 家·Nature &#

12、183;罕見的抑制性因子·美國(guó)· 2007【6】王嘉軍·微生物學(xué)免疫學(xué)新進(jìn)展·第 37卷, 第 4期· 2011【7】周國(guó)慶 ,唐琴, 黃麗, 孫保亮·泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) ,Treg 的免疫磁珠提取純 化方法【 8】姜小麗, 楊婷等·中國(guó)免疫學(xué)雜志· 2013年第四期·哮喘小鼠中 Foxp3+Treg/Th17 的失衡及意義【9】王建華·糖尿病自我管理全書·北京 : 北京科學(xué)出版社· 2010【關(guān)鍵詞】紅細(xì)胞【摘要】目的應(yīng)用紅細(xì)胞免疫方法檢測(cè)腫瘤患者紅細(xì)胞免疫功能。方法應(yīng)用 紅細(xì)

13、胞 C3b受體花環(huán)試驗(yàn)和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物 (Ic) 花環(huán)試驗(yàn) ,檢測(cè) 114例腫瘤患者 的紅細(xì)胞免疫功能。結(jié)果腫瘤患者紅細(xì)胞 C3b 花環(huán)率顯著降低 (P<0.01), 紅細(xì)胞免 疫復(fù)合物花環(huán)率升高 (P<0.05) 。乳腺癌術(shù)后紅細(xì)胞 C3b受體花環(huán)率升高 , 紅細(xì)胞免 疫復(fù)合物花環(huán)率降低。結(jié)論腫瘤患者紅細(xì)胞免疫粘附功能降低。關(guān)鍵詞】紅細(xì)胞 ; 免疫 ;C3b 受體傳統(tǒng)觀念認(rèn)為消滅體內(nèi)突變細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞是白細(xì)胞的功能 , 而對(duì)于紅細(xì)胞在 腫瘤發(fā)生發(fā)展中起何作用知之甚少。近年來隨著對(duì)紅細(xì)胞免疫功能的研究的逐步深 入, 有人發(fā)現(xiàn)癌癥患者紅細(xì)胞免疫粘附受體活性下降。為探討惡性腫瘤與紅細(xì)

14、胞免 疫粘附的關(guān)系 , 該研究對(duì) 114例腫瘤患者進(jìn)行了當(dāng)前常采用的紅細(xì)胞免疫功能二項(xiàng) 指標(biāo)檢測(cè),并與 50例正常人進(jìn)行對(duì)照。1 資料與方法1.1 一般資料試驗(yàn)組 :114 例均為臨床病理確診的腫瘤患者 , 其中肺癌 22例, 食管癌 30例,腦腫瘤 10例,鼻咽癌 8例,肝癌 12例,乳腺癌術(shù)后 12例,其他腫瘤 20 例。對(duì)照組 :正常人 50例均為志愿獻(xiàn)血者 ,男40例,女10例;年齡 2045歲。1.2 方法紅細(xì)胞 C3b受體花環(huán)(C3b 花環(huán))試驗(yàn), 參照郭峰法。所用試劑均由上 海長(zhǎng)海醫(yī)院提供。2 結(jié)果測(cè)定結(jié)果見表 1。乳腺癌術(shù)后患者紅細(xì)胞 C3b受體花環(huán)率低于對(duì)照組 (P<0

15、.01), 其他各組紅細(xì)胞 C3b受體花環(huán)率明顯低于正常對(duì)照組 (P<0.01), 而紅細(xì)胞 免疫復(fù)合物花環(huán)率除乳腺癌術(shù)后低于對(duì)照 , 其他各組均高于對(duì)照組 ,但差異無顯著性 (P>0.05) 。表 1 兩組二項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較 (略)3 討論正常人體血液循環(huán)中免疫復(fù)合物少 , 因此紅細(xì)胞 C3b受體花環(huán)率高于紅細(xì)胞 Ic 花環(huán)率,約為 25倍。文獻(xiàn)報(bào)道 ,腫瘤患者紅細(xì)胞 C3b花環(huán)率顯著低于正常人 , 而 紅細(xì)胞 Ic 花環(huán)率高于正常人 , 提示腫瘤患者紅細(xì)胞免疫粘附活性降低。本文測(cè)定114例腫瘤患者的紅細(xì)胞 C3b花環(huán)率顯著低于正常人 , 與其他同仁的報(bào)道一致。引 起腫瘤患者紅細(xì)胞免疫失調(diào)的原因是 :(1) 腫瘤患者血清中存在一種免疫抑制因子 , 對(duì)其免