循環(huán)腫瘤細胞的生物和分子特征是精準醫(yī)療的創(chuàng)新策略

1、循環(huán)腫瘤細胞的生物和分子特征是精準醫(yī)療的創(chuàng)新策略摘要循環(huán)腫瘤細胞（ctc）是一種從原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤散播到血流屮的罕見細胞群體。ctc被 認為是癌癥轉(zhuǎn)移的前兆。作為液體活檢的關鍵組成部分，ctc是理解轉(zhuǎn)移形成的唯一工具和 研究瘤內(nèi)異質(zhì)性的有價值的信息來源。由于ctc在大量的血細胞中非常罕見，所以為了檢測 ctc投入的力量也較大。多種癌癥的研究已經(jīng)多次證明治療前和治療中ctc計數(shù)的增加顯著 與不良結(jié)局有關。在精準醫(yī)療的時代，對ctc的研究早已逾越了檢測和計數(shù)階段。罕見細胞 分析平臺的快速發(fā)展可以在批暈和單一細胞正面描述ctc的特征。ctc的遺傳鑒別也有可能 加深對實時腫瘤狀態(tài)的了解，從而在臨床壞

2、境中支持對治療反應進行監(jiān)測和評估，并能促進 新型治療目標的發(fā)展。1. 前言多年來，癌癥一直是發(fā)達國家人口死亡的最常見的原因。盡管在過去的一些年中男性和女性 的癌癥總死亡率穩(wěn)步下降，但是據(jù)美國癌癥協(xié)會對美國人群的統(tǒng)計，估計在最近5年中新發(fā) 病例和常見癌癥的死亡人數(shù)還會呈上升趨熱一一這些常見癌癥包括白血病、胰腺癌、腎癌和 甲狀腺癌。癌癥發(fā)展到晚期，轉(zhuǎn)移意味著癌癥的致死性結(jié)局，是90%的癌癥相關死亡事件的 主要原因。因此，為了更加有效地對抗癌癥，理解轉(zhuǎn)移形成的機制非常關鍵。眾所周知，癌 癥是遺傳和/或后生變化累枳的結(jié)果。因此，基于患者的遺傳特征，很有可能需要對患者實 施精準醫(yī)療。在多年的努力之后，人

3、們逐漸認識到檢測多種基因變化，対癌癥患者進行精準 再分層并選擇相應的有效治療方案能夠?qū)崿F(xiàn)潛在的臨床受益。循環(huán)腫瘤細胞（ctc）是一種從原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤散播到血流屮的罕見細胞群體。ctc被 認為是原發(fā)腫瘤位點和轉(zhuǎn)移位點的紐帶，因此理解轉(zhuǎn)移的機制是研究的理想模式。治療前的 ctc基準計數(shù)已經(jīng)被證明是多種實體瘤如乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌的獨立預后標志物。作為 一種預后標志物，ctc在臨床決策的制定和疾病進展的監(jiān)測方面體現(xiàn)其應有的價值。不僅如 此，基因組學可以讓我們了解關于癌癥的更多且更攵雜的信息。越來越多的證據(jù)表明ctc 能夠引導臨床干預，改善治療結(jié)局?；加邢嗤膊〉幕颊呖赡軙嬖谙嗨频陌Y狀，甚至體

4、液 屮癌癥相關生物標志物的水平變化也相同。但是，我們目前了解到這些相同點不能表示就應 該采用相同的療法或預測相同的治療反應：理解遺傳病因能更加準確地引導有效的療法。理 解個體的遺傳變異特征是進行最佳護理的關鍵。一些最近發(fā)表的研究表明化療耐藥性出現(xiàn)的 驅(qū)動力是選擇了最終導致疾病進展的耐藥性亞克隆。因此，準確的腫瘤基因組分析逐步成為 臨床實踐的常規(guī)項目，通過分子診斷，它對癌癥治療決策的制定變得越來越有價值。診斷不 僅依靠數(shù)據(jù)采集，還要依靠系統(tǒng)地進行多元數(shù)據(jù)解析。同時，腫瘤的異質(zhì)性越來越引起人們 的注意。人們普遍接受的一個觀點是癌癥的發(fā)展存在一個潛在的腫瘤演進過程，在這個過程 中，導致治療耐藥性的治

5、療方法帯來選擇性壓力。多種驅(qū)動性突變和癌癥演進是腫瘤界質(zhì)性 的鮮明特征。盡管現(xiàn)代醫(yī)學己經(jīng)獲得了長足的進步，但冃前大部分患者所采用的仍是基于總體疾病狀態(tài)評 估的不精準的治療。但是現(xiàn)在循證醫(yī)學和轉(zhuǎn)化醫(yī)學的概念已經(jīng)聯(lián)合，形成了精準醫(yī)療的概念。 許多國家的政府已經(jīng)開始斥巨資開展精準庚療項目并將其作為戰(zhàn)略目標。精準醫(yī)療是采用具 有信息系統(tǒng)性的生物標志物，基于患者的生活環(huán)境、生活方式和遺傳因素選擇對患者最有效 的治療方法。精準醫(yī)療能夠潛在地對醫(yī)學實踐造成深刻的變革。在癌癥研究屮，能夠依靠準 確地采集腫瘤原發(fā)位點的信息。尋找可靠的和可再現(xiàn)的生物標志物仍是精準醫(yī)療的最大挑戰(zhàn), 目前大部分的候選生物標志物需要進

6、一步確認。盡管實現(xiàn)全球無偏倚癌癥基因組特征描述之 前還有很長的路要走，但是測序分析已經(jīng)廣泛用于揭示腫瘤的異質(zhì)性。腫瘤異質(zhì)性的含義是 相同腫瘤的腫瘤內(nèi)部和腫瘤之間存在多樣性，這是實施精準醫(yī)療的障礙。但是，在臨床實踐 屮，在許多領域都可以實現(xiàn)一定水平的精準醫(yī)療一一采用穩(wěn)定的分子方法將患者分入更具靶 向性的治療方法的亞組。本文中我們將討論精準醫(yī)療與腫瘤學之間的關系。多年以來，侵入性手術(shù)如組織活檢已經(jīng)作為癌癥診斷的金標準方法。但是，由于腫瘤部位的 不可訪問性，尤其是轉(zhuǎn)移性病變位點（例如前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移），活檢通常難以執(zhí)行。此外， 作為一種侵入性的技術(shù)，組織活檢為重復采樣提供的空間非常小，因此難以評估腫

7、瘤的負擔。 與傳統(tǒng)組織活檢相比，ctc作為一種液體活檢，能提供適合癌癥監(jiān)測的無創(chuàng)采樣方法。ctc 可以用于監(jiān)測癌癥的遺傳變異，尤其適用于終末期活檢過于陳舊，不可進行或新活檢不能執(zhí) 行的情況。對ctc的研究主要被2個因素阻礙，即（2）在大量的血細胞屮極其罕見的細胞；（2） ctc 表型異質(zhì)性，使得難以發(fā)現(xiàn)獨特的標志物或ctc檢測的特點。本文屮我們強調(diào)了 ctc在癌 癥轉(zhuǎn)移和腫瘤異質(zhì)性研究中的作用以及ctc特征的臨床潛力。2. crc：癌癥生物學的窗口2.1 ctc：癌癥轉(zhuǎn)移的前兆？最近幾年，對ctc的研究已經(jīng)加深了人們對轉(zhuǎn)移階梯反應（圖1）的理解；多種類型的癌癥 研究已經(jīng)對轉(zhuǎn)移階梯反應進行了大量

8、描述。惡性腫瘤的發(fā)展時間可能為數(shù)年或數(shù)十年。源于 胰腺癌的數(shù)據(jù)表明非轉(zhuǎn)移性創(chuàng)始細胞的形成可能需要十年。癌癥細胞發(fā)展出轉(zhuǎn)移能力可能述 會再需耍5年。有意思的是，據(jù)估計增長優(yōu)勢僅為0.4%的一個單一的腫瘤細胞足以使其在5 至25年的時間跨度內(nèi)發(fā)展成為一個完整成熟的腫瘤。局部惡性腫瘤的一般標準療法仍然是 手術(shù)切除。大部分案例中，癌癥患者進行早期診斷和病變切除可以獲得較高的治愈率。與之 相反，疾病發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者的結(jié)局較差。轉(zhuǎn)移病變的形成是原發(fā)腫瘤位點的腫瘤細胞發(fā)生散 播的結(jié)果。如圖1所示，腫瘤細胞可以通過單個ctc或細胞簇遷徙，細胞簇通常被稱為循環(huán) 微栓子或ctc簇。源于原發(fā)瘤體的ctc的散播對以在疾

9、病的早期階段發(fā)生，甚至在原發(fā)腫 瘤或癌癥變得具有臨床顯著性之前。在笫一步中，腫瘤細胞侵入血管系統(tǒng)并在血管中循環(huán)（圖 1）, 一些腫瘤細胞在遠端位點的毛細血管中定植。腫瘤細胞簇由于太大而不能通過纖細的血 管，最終會變形并重新組織。腫瘤細胞在新位點會滲出到目標器官的實體上（圖1）。體外 小鼠模型的數(shù)據(jù)提供了滲出細胞存活的證據(jù)，如果細胞停留在血管屮氧氣和營養(yǎng)供應最佳的 位置，則腫瘤細胞就可能存活?？傊?，轉(zhuǎn)移病變形成的每個單一步驟的效率都很低：血液中 的ctc數(shù)量大大多于成功形成轉(zhuǎn)移病變的ctc數(shù)量。定植效率低的一個原因是ctc在血液 循環(huán)中的存在條件非常嚴苛。小鼠實驗的數(shù)據(jù)顯示以簇的形式遷徙的ctc

10、自身防護性更好， 在遠端目標位點增殖的可能性也大于以單一細胞形式遷徙的ctc。和腫瘤細胞一同遷徙的基 質(zhì)細胞可能是造成這種情況的原因，散播的癌細胞能將其自身的微環(huán)境攜帶到目標遠端位點。 另一個促進ctc存活的因素是與ctc細胞表面結(jié)合的血小板。除了這些因素以外，還有許 多其他轉(zhuǎn)移病變形成的必要因素發(fā)揮作用。這些作用包括免疫防御的避讓和抑制。促進腫瘤 存活和增殖的支持性腫瘤微環(huán)境，以及ctc的羽干樣特點。后者通常與“上皮i'可質(zhì)轉(zhuǎn)化（emt）” 有關，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一種能讓腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學過程。emt包括如歸因于間充質(zhì)細胞 vimentin、twist和snail基因的上調(diào)和像細胞角蛋白

11、這樣的上皮標志物的下調(diào)。發(fā)生emt 的細胞先輸出羽干樣特征，包括運動性增加和更容易形成轉(zhuǎn)移克隆。rh于轉(zhuǎn)移階梯反應期間 多種變化的復雜性，因此需耍多種富集和檢測技術(shù)應對不同的ctc亞型來表明ctc的異質(zhì) 性。1511941246233049262.jpg圖1：瘤內(nèi)異質(zhì)性、ctc/ctm和癌癥轉(zhuǎn)移過程示意圖。大型測序研究鑒別的瘤內(nèi)遺傳異質(zhì)性。在給定的瘤體內(nèi)，具有多種遺傳多樣性的癌細胞（用 不同的顏色表示；胞核和細胞質(zhì)的顏色類型相同）。癌細胞具有侵襲性并侵入循環(huán)系統(tǒng)時， 轉(zhuǎn)移階梯反應就開始了。它們以單一 ctc或ctm的形式向遠端器官遷徙。在遷徙期間，ctc 可能失去上皮標志物并獲得間葉細胞的特征

12、，使其細胞活性更強（細胞的胞核和細胞質(zhì)用不 同顏色類型表示）。在到達特定器官吋，ctc從循環(huán)中滲出，侵入周圍組織，并最終發(fā)展為 轉(zhuǎn)移病變。此外，腫瘤的異質(zhì)性還表現(xiàn)為原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤的不同（在“形成的轉(zhuǎn)移”模型中 細胞的胞核和細胞質(zhì)采用不同顏色表示），并在臨床實踐屮最終導致原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤對 療法的反應不同。取決于不同癌癥的轉(zhuǎn)移定植的器官特異性，一些最容易受到影響的器官包 括肺部、骨骼、肝臟和腦部。2.2 ctc：研究腫瘤異質(zhì)性的方法長期以來人們認識到癌癥組織并不都是實體。癌癥是一種對治療具有不同臨床反應的復雜疾 病，即使刈同一種腫瘤采用同一種療法。瘤內(nèi)異質(zhì)性能部分解釋這種現(xiàn)象。一般來說，腫瘤

13、的界質(zhì)性和癌細胞的構(gòu)成有關，癌細胞有可能隱匿遺傳變界，如圖1所示，這些變異可能存 在于瘤內(nèi)不同的區(qū)域。腫瘤基因組異質(zhì)性形成的一個原因是癌細胞基因組的不穩(wěn)定性。一些 不同的機能失常如dna復制下調(diào)、核昔酸修復機制喪失、染色體分離缺陷和染色體端粒侵 蝕就可以導致基因組不穩(wěn)定性ogerlinger等人進行的研究明確表明腎細胞癌的不同區(qū)域顯示 出一些唯一的基因組變異。所有腫瘤區(qū)域共有的體細胞突變僅為31%37%0從臨床的觀點 看，這些獨特的腫瘤區(qū)域可能是療法耐受性的潛在原因。癌癥細胞的耐受性克隆可以隱藏在 瘤塊屮，治療開始前這種耐受性克隆就可能存在。治療期間，這些具有耐受性的細胞將不會 被鎖定，并最終

14、變得強大起來導致持續(xù)的耐藥性。對于任何一種癌癥類型，都已經(jīng)鑒別出一 些臨床相關突變。這些遠端分子變化表明應該根據(jù)個體的分子特征管理癌癥。僅有很少的一 部分遺傳變異己經(jīng)被確認具有預測和預后價值并被作為目標。對于靶向療法而言，鑒別這些 生物標志物是對患者進行分層并執(zhí)行個體化治療的關鍵。在轉(zhuǎn)移的乳腺癌（mbc）屮，顯著 比例的mbc患者中檢測出ctc和相應原發(fā)腫瘤間her2表達的分子不-致性，這需要進一 步的基于her2狀態(tài)的前瞻性研究，為這些組的患者確定適當?shù)寞煼?。盡管ctc 其組織源頭顯示出相似的遺傳特征，為了在循環(huán)中存活，ctc具備了能成為轉(zhuǎn)移 關鍵事件的特定遺傳變化，導致其遺傳特征不同于原發(fā)

15、腫瘤但和轉(zhuǎn)移組織類似（圖1）。ctc 也能反映瘤內(nèi)異質(zhì)性，并生成重要的臨床信息。在結(jié)直腸癌患者中，相同的患者的ctc之間 能檢測出egfr、kras和pik3ca的多元遺傳變化。在另一項關于肺癌的研究屮，患有不同 癌癥亞型的患者的ctc顯示出不同的拷貝數(shù)組變化模式，這對于利用ctc測定患者間的異 質(zhì)性和個體化醫(yī)療的患者分層都具有潛在價值。在后續(xù)章節(jié)中，我們將研究癌癥中ctc的重 要性，觀察癌癥進展和治療期間在不同吋間和地點出現(xiàn)的ctc群體。我們利用最新的單細胞 分析工具，采用不同的分子目標（dna、rna、蛋白質(zhì)和甲基化）和組學平臺進行研究。3. ctc的物理和生物學特征ctc的物理和生物學特

16、征與ctc的分離和鑒別方法緊密相關。因此，在我們引入ctc檢測方 法之前，應該首先強調(diào)ctc的特點。據(jù)估計在iml血液包含的數(shù)以百萬計的wbc、上百億的紅細胞和其他成分中，可能僅僅存 在1個ctc。作為液體活檢的重要組成部分（其他成分包括循環(huán)腫瘤dna、循環(huán)微小rna、 外來體）。它們于1869年被ashworth首先發(fā)現(xiàn)。根據(jù)ashworth的敘述，和局部癌癥細胞相 似的細胞出現(xiàn)在血液中，這能夠解釋癌癥轉(zhuǎn)移病變的形成。由于采血是一種簡單且?guī)缀鯚o創(chuàng)的過程，從血液中獲得的ctc是癌癥研究的理想標志物。近 年來，己經(jīng)成功實現(xiàn)了 ctc的檢測和分離。許多研究將ctc技術(shù)作為表明癌癥進展的潛在 生物標

17、志物。在發(fā)表的研究報告中，每7.5ml外周血25ctc是最常用的癌癥轉(zhuǎn)移閾值，1 個ctc是非轉(zhuǎn)移早期疾病研究的臨界值。除了使用ctc對患者進行分層時的極低臨界值z 外，細胞異質(zhì)性也使ctc鑒別技術(shù)面臨諸多挑戰(zhàn)，因此需要高靈敏度和高特異性試驗。rtl于ctc是以單個細胞或偶爾以簇的形式在血流中循壞，它們的存在不依靠支持性組織。ctc是非常脆弱的細胞，一些研究發(fā)現(xiàn)ctc正在逐漸凋亡。ctc脆弱的本質(zhì)需要溫和的分離 技術(shù)來保存細胞的完整性。這導致cellsearch系統(tǒng)一一ctc選擇和計算金標方法的發(fā)展，該 方法將血液采集到特殊的保存試管一一cellsave屮，避免損傷到ctc。ctc的直徑介于1

18、0到20um之間，與其他血細胞相比體積較大。由于體積較大，ctc可以 從血液學細胞中分離出現(xiàn)來（圖2a）。已經(jīng)證明不同癌癥類型的ctc大小不同。根據(jù)ctc的 大小選擇分離技術(shù)如過濾和梯度離心能很好地分離較大的ctco細胞變型性是一種能作為標志物的重要性質(zhì)，能夠區(qū)分良性和惡性細胞。與其他血細胞如紅 細胞和白細胞相比，ctc的可變形性較差（圖2a）,因此可以利用基于可變形性的細胞分離 技術(shù)。1511941280927016006.jpg圖2： ctc檢測/分離的技術(shù)方法。（a）基于ctc物理特性的方法演示。和正常血液學細胞如白細胞（藍色）和紅細胞（紅色 小橢圓）相比，ctc （紅色不規(guī)則形狀）的體

19、積較大，可變形性結(jié)構(gòu)較差，在電場屮顯示出 固有的介電性能。（b）基于ctc生物學特性的方法演示。使用抗上皮標志物（如抗epcam抗體）、間葉細胞 標志物（如抗波形蛋白抗體）和干細胞樣標志物（如抗-cd44）可以陽性富集ctc或使用白 細胞損耗抗cd45抗體陰性檢測ctcoctc存在一些與其來源相似的生物學特性，如細胞表面生物標志物。上皮細胞粘附分子 （epcam）是一種上皮組織癌癥中典型表達且不會在血液學細胞中表達的跨膜糖蛋白。因此, 利用抗epcam抗體，可以選擇性地從外周血液中捕獲上皮細胞癌ctc （圖2b）。許多技術(shù) 利用這一目標作為ctc檢測的基木原理。此外，更加深入的研究顯示，細胞在

20、血液屮遷徙的 過程屮,ctc可能會發(fā)生cmt過程。這些ctc可能缺乏上皮標志物并獲得emt相關標志物。 這種ctc的動態(tài)過程對能受到治療壓力選擇的驅(qū)動并源于療法耐受性。另一個ctc亞組是 干細胞樣細胞。通過對腫瘤特征的深入研究，癌癥干細胞（csc）已經(jīng)被認為有助于csc模 式中不同癌癥類型的癌癥評估和表型、功能性多樣性評估。csc還被認為有可能介導癌癥轉(zhuǎn) 移和療法耐受性的出現(xiàn)。但是難以從實體瘤組織屮直接獲得干細胞。因此，該ctc子群體是 一種令人感興趣的研究癌癥“多能性”的ctc。除了一些癌癥類型共有的常見標志物之外，每種特殊癌癥類型還有一些組織特異性抗原，其 屮一些已經(jīng)被研究了很多年。例如，

21、braf的突變狀態(tài)已經(jīng)是部分黑素瘤的既定診斷目標。在分離的ctc屮實現(xiàn)的對該基因的測序顯示出黑素瘤的異質(zhì)性。her2過表達在15%至30% 的侵襲性乳腺癌中發(fā)揮著重要作用。最近幾年，它還被用作檢測ctc的標志物。己經(jīng)表明 her2呈陽性的ctc的存在和出現(xiàn)頻率與患者較差的結(jié)局有關。如前所述，在循環(huán)中不僅檢測出單細胞形式的ctc,還檢測出ctm形式的ctco對ctm的 研究是一個正在發(fā)展的領域，有前景的數(shù)據(jù)顯示ctm在癌癥的轉(zhuǎn)移擴散屮發(fā)揮著巨大作用。 最近，一種針對性分離ctm的設備己經(jīng)研發(fā)成功,稱之為cluster-chip （簇芯片）。ctm的 形成尚未被完全了解：例如，ctm是直接從腫瘤上

22、分離還是單個ctc從腫瘤上分離后在血 流中聚集在-起形成了 ctmo有證據(jù)顯示ctm不僅包含腫瘤細胞，還包含wbc和血小板。 以前人們認為ctm因為太大而不能穿過毛細血管。但是，最近的一項研究表明利用微流體 設備進行的試驗顯示腫瘤細胞簇能變形并穿過5至10 um的毛細血管，這說明ctc簇在癌 癥向遠端散播并形成轉(zhuǎn)移病變方面發(fā)揮著巨大的作用。4. ctc檢測和分離的技術(shù)方法由于血液屮循環(huán)ctc的頻率極低，ctc的富集是ctc分析的首要和最關鍵步驟。最主要的挑 戰(zhàn)是從巨量血細胞背景中精準分離ctc,不能有任何的假陽性或假陰性檢測并在無損傷的情 況下分離ctc,這樣才能在分子層面進行后續(xù)分析。隨著技

23、術(shù)的快速發(fā)展以及跨學科合作的 不斷進步，越來越多的ctc檢測平臺已經(jīng)出現(xiàn)。總的來說ctc分離技術(shù)可以分為2類（圖2）,（1）基于ctc物理特性（大小、可變形性、電荷）；（2）基于ctc的生物學特性（膜蛋白 表型）?；赾tc物理特性的試驗顯示在執(zhí)行分離時，區(qū)分具有不同生化特性的ctc子群體 的偏倚較低，但是由于存在和ctc物理特性相似的.血液成分的污染，所以該方法的靈敏度較 低?；赾tc表型特性的方法通常靈敏度很高，但是rh于針對陽性和/或陰性選擇的特定抗 原的抗體，該方法可能會錯過一些ctc的子群體?；赾tc大小的過濾方法依靠的是大部分ctc比正?？诩毎筮@一事實。過濾器的孔徑為6 -s

24、um；因此，大部分的白細胞會穿過過濾孔，但體積較大的ctc會留在過濾膜上。該方 法的優(yōu)勢是簡單且不需要繁雜并且可能對ctc完整性造成損害的預處理步驟。基于ctc大 小的過濾系統(tǒng)使用方便，但是仍存在局限性如ctc大小的范圍等問題。該方法可能會損失體 積較小的ctc。為了克服這一缺點，正在開發(fā)同時釆用基于ctc大小和可變形性的技術(shù)平臺。采用表面蛋白分離ctc的方法利用ctc膜表達的特殊抗原如epcam將其從其他血液成分中 區(qū)分出來。特定的血細胞標志物也可用于ctc的陰性選擇去除產(chǎn)生污染的血細胞，例如cd45 （淋巴細胞常見抗原）。應用最廣泛的ctc檢測平臺之一是cellsearch,該平臺主要基于

25、ctc 的epcam表達，目前該平臺是唯一經(jīng)過美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于ctc計算且經(jīng)過 臨床確認的平臺。cellsearch系統(tǒng)采用與鐵磁流體納米粒子結(jié)合的epcam抗體標記ctc。在 磁場中分離后,分離的細胞采用細胞角蛋白（ck） 8/18/19, 4, 6 diamidino-2-phenylindole 和pan-leukocyte標準cd45進行免疫熒光染色。一些癌癥類型已經(jīng)確認了 cellsearcho利用 每7.5ml血液5個ctc的臨界值，通過ctc計數(shù)可以將癌癥患者進一步區(qū)分為不同的無進 展生存（pfs）率和總存活（os）率的組。最近，cellsearch系統(tǒng)的應用得到進

26、一步發(fā)展，其 可以作為第一富集步驟，隨后可以聯(lián)合不僅能計數(shù)而且能進行后續(xù)批暈或單個ctc分析的技 術(shù)。除了基于epcam的陽性ctc檢測方法外，還有一些富集ctc的陰性方法。這些方法利 用有核血細胞如cd45的表面標志物來標定血細胞并采用免疫磁性粒子將其清除。具有更高靈敏度的微流體平臺能采用進一步的ctc分離方法分離罕見的ctc- 2007年， nagrath等人的報告稱第一代epcam陽性ctc微流體捕獲設備已經(jīng)出現(xiàn)。隨后，得到強化的 第二代和第三代微芯片平臺接連出現(xiàn)，這兩代設備分別采用herringbone-chip （hb-chip）和 ctc-ichip,處理性能、處理速度和應用性都得

27、到了改善。在一個小型前列腺癌患者群體中采 用hb-chip的結(jié)果顯示15名患者中的14人呈ctc陽性。這些患者的亞組中還檢出了 ctc簇。 hb-chip經(jīng)過進一步調(diào)整后，利用抗間葉細胞和抗上皮標志物的雞尾酒抗體可以從乳腺癌患 者中檢出ctc （yu等人的研究）。為了克服特異抗原分離的局限性，2013年同時利用陽性選 擇和陰性清除模式的ctc-ichip得以岀現(xiàn)。該設備能檢測廣泛的癌癥類型屮的ctc,超越了 己知的表位。而且，分離未固定的細胞提高了核酸的質(zhì)量，實現(xiàn)了強大的后續(xù)ctc分析。但 是，該微流體芯片在ctc檢測方面的應用還需要更大的患者群體進一步確認。在所有基于epcam的ctc檢測方

28、法中，gilupi cellcollector是唯一的可以避免在小量血液樣 品中尋找ctc這一局限性的技術(shù)：該技術(shù)利用具有抗epcam抗體功能的不銹鋼絲插入肘部 靜脈血流中一一支持在體內(nèi)進行ctc的分離和計數(shù)。鋼絲在血流中停留30分鐘，相對于釆 集大約1.5l的血量，提高了分離ctc的機會。作為唯一的體外分離設備，獲得了在患者中 進行臨床應用的ce認證。從2012年首次出現(xiàn)開始，cellcollector獲得了 ctc領域越來越多 的關注。在一項肺癌研究中，gorge等人的報告顯示cellcollector的ctc檢測靈敏度髙于 cellsearcho他們的研究還發(fā)現(xiàn)除了 ctc計算功能外，c

29、ellcollector有通過后續(xù)dpcr分析進 一步評估分離的批量細胞的目標基因的突變狀態(tài)的可能。和其他新試驗一樣，cellcollector 需要在大型臨床試驗中進行確認，在不遠的將來我們就能看到現(xiàn)行研究的報告。最近出現(xiàn)了 新版本的cellcollectorcatch and release detector,我們的研究證明了該試驗。該試驗同樣為體內(nèi)ctc富集，隨后進行細胞分離步驟的設計，該試驗捕獲的ctc可以被釋放并被后 續(xù)單一 ctc分析采集。盡管該試驗尚未得到臨床使用的認證，但是我們的體外研究得到的數(shù) 據(jù)表明不僅細胞可以得到高效釋放，而r可以回收具有高質(zhì)量dna的細胞，能夠進行微陣

30、列比較基因組雜交(array-cgh)和下一代測序(ngs)。rt-qpcr是一種用于研究rna表達且具有髙靈敏度和髙特異性的常規(guī)技術(shù)oadnatest系統(tǒng)結(jié) 合具有qpcr分析的免疫磁性粒子epcam陽性細胞富集循壞ctc進行檢測和特征描述。以 特殊癌癥轉(zhuǎn)錄為目標的試驗現(xiàn)在己經(jīng)可以用于幾種癌癥，這些癌癥包括結(jié)腸癌、乳腺癌、前 列腺癌和卵巢癌。為了證明結(jié)合qpcr能否提高ctc檢測的靈敏度，有些已經(jīng)執(zhí)行了一些 mbc研究并將之與adnatest和cellsearch相比較。比較的結(jié)果顯示并不一致。muller等人執(zhí) 行了一項包括254名mbc患者的研究，證明在預測臨床結(jié)局方面，cellsear

31、ch系統(tǒng)的性能優(yōu) 于adnatest o另一項比較mbc的研究顯示adnatest和cells在ctc鑒別方面取得的結(jié)果類似， ctc陽性樣品的檢測率比較一致，達到了 80%。在一項比較cellsearch、adnatest和靈敏多 重rt-qpcr進行ck19hr乳腺珠蛋白檢測的試驗中，van der auwera等人的小組發(fā)現(xiàn)多重 rt-qpcr是檢測ctc最靈敏的技術(shù)。為了區(qū)分凋亡的ctc和存活的ctc,兒年前alix-panabie'res的小組開發(fā)了一種功能性細胞培 養(yǎng)實驗一一上皮免疫斑點（epispot）試驗。該試驗基于活細胞在短期培養(yǎng)的環(huán)境中能分泌 和釋放蛋白質(zhì)的原理。這

32、些蛋白可以被預先包被在膜上的抗體捕獲。因此，epispot試驗能 基于免疫斑點計數(shù)對存活的ctc進行檢測和定量。該試驗的優(yōu)勢在于檢測并不以特定的ctc 亞型作為目標蛋白，能夠基于研究目標自由選擇ctc類型。該試驗已經(jīng)在一些癌癥類型屮得 到了確認，包括乳腺癌和前列腺癌。此外，這種多參數(shù)技術(shù)是冃前唯一一種能檢測存活單個 ctc分泌的蛋白圖譜的技術(shù)，但是該技術(shù)目前還不能實現(xiàn)對檢測到的ctc進行進一步分離和 分析。最近，kushke等人將epispot試驗和cellcollector和cellsearch系統(tǒng)相結(jié)合,得到的 報告顯示與使用單一技術(shù)相比，聯(lián)合兒種技術(shù)獲得高風險前列腺癌ctc累積陽性率較高

33、。他 們的研究揭示聯(lián)合采用不同的技術(shù)能使ctc檢測獲益并提高不足的陽性率。除了專門用于ctc檢測的平臺之外，新出現(xiàn)的技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)后續(xù)的ctc排序分類。其中一 項著名的新技術(shù)是deparray系統(tǒng)，該系統(tǒng)能基于雙向電泳（dep）處理單個細胞。和ctc富 集方法如cellsearch結(jié)合，deparray能有效地對單個ctc進行分類，并將其轉(zhuǎn)移到后續(xù)分析 用的試管中。5. ctc的特征現(xiàn)有的研究已經(jīng)將ctc從簡單的計數(shù)擴展到更加強大的分子分析。ctc的特征描述經(jīng)歷了兒 個階段：從基礎細胞表型的免疫化學特征到高分辨率基因組分析；從ctc的大批量分析到單 個細胞的分子特征描述。采用最新的和最強大的ct

34、c富集和計算方法，現(xiàn)在已經(jīng)可以對罕見 細胞進行準確的特征描述。最常用的方法在雜交、array-cgh和ngs分析中采用pcr和熒光 方法。有意思的是，實體瘤中的一些得到了良好描述的遺傳不穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)移事件證明了不同 癌癥類型的ctc也不同。例如，前列腺癌中成功鑒別hi tmprss2-erg基因融合、ar變體的 獲得或pten的喪失。其他例子包括mbc屮her2的過表達，肺癌屮egfr突變和黑素瘤的 braf突變。這些ctc特征研究分別提供了癌癥的實時生物學信息，指導了病例的臨床管理， 還有助于加深對癌癥轉(zhuǎn)移和演進的理解。5.1 ctc表型特征的分析和鑒別ctc表現(xiàn)岀多種形式的表型異質(zhì)性。文獻屮

35、記述的表型包括上皮、間葉細胞、干細胞樣細胞 和csc。每種表型都有不同的標志物，對治療決策的制定之意義也不同。此處我們將更加詳 細地敘述不同的表型。5.1.1上皮表型ctc的一般定義是，它們是一種具有完整胞核、細胞角蛋白（如細胞角蛋白8/18）和/或其 他上皮標志物如epcam表達呈陽性，白細胞標志物cd45表達呈陰性的細胞。上皮表型可 以被認為是ctc的經(jīng)典特征。大部分分離ctc的技術(shù)都是基于這種表型。5.1.2間葉細胞表型多種癌癥中重復觀測到emt過程。失去上皮標志物而獲得emt表型被認為與較差的預后和 藥物耐藥性有關。在血液小循環(huán)的ctc可能會在遷徙中失去其上皮標志物。因此，通過檢測 c

36、tc亞組來描述其特征并更好地理解癌癥狀態(tài)十分關鍵。一些ctc分離技術(shù)側(cè)重于上皮標志 物，可能會錯失間葉細胞表型的ctco因此，開發(fā)了一些epcam之外的富集技術(shù)，如陰性 富集。陰性富集的原理是僅去除cd45呈陽性的血細胞并進行過濾。yu等人描述了乳腺癌患 者的ctc的emt標志物的特征。他們利用rna原位雜交試驗并從純上皮與全間葉細胞表型 雜交鑒別了涵蓋全譜系的ctc。除了常見表達的emt標志物，一些研究在mbc患者中基于 多種標志物如cd46或cd49f （基于cd49f的ctc選擇改進了跨乳腺癌亞型的檢測）檢測 epcam呈陰性的ctc；在結(jié)腸直腸癌患中檢測絲束蛋白3呈陽性的ctc （絲束

37、蛋白3是一種 新型ctc標志物，該標志物經(jīng)受了上皮一間葉細胞的轉(zhuǎn)化并與結(jié)腸直腸癌的預后有關）。5.1.3雜交（上皮/間葉細胞）表型除了 emt過程，一小部分ctc似乎從上皮表型轉(zhuǎn)化為更加間葉細胞化表型。這種轉(zhuǎn)化被認 為是一種平滑的過程，使得ctc表達上皮和間葉細胞2種標志物。lecharpentier等人從轉(zhuǎn)移 的非小細胞肺癌患者體內(nèi)分離了同時表達波形蛋白（i'可葉細胞標志物）和細胞角蛋白的ctco5.1.4循環(huán)干細胞 目前，一些表面標志物己經(jīng)得到成功檢測并用于此類細胞亞型的富集。干細胞標志物aldh1 通常被認為是i'可葉細胞表型的ctc共表達的標志物。一般來說具備功能細胞樣

38、表型的ctc 可能更加耐藥并可能具有轉(zhuǎn)移的潛力。從mbc患者體內(nèi)分離的ctc中，一大部分的ctc存 在aldh1表達陽性（69%）,表明一些ctc不僅表達emt標志物還會表達干細胞標志物。在這種情況下，一種ctc能存在不同的表型，相同的患者也可能存在具有不同表型的ctc, 這表明了不同情況的動態(tài)變化。但是我們目前尚不清楚的是哪種表型“更加危險”，或哪種 表型更容易形成轉(zhuǎn)移病變。每種表型的存在及其重要性都得到了普遍接受，我們需要工具來 研究dna、rna上的單個細胞并在蛋白質(zhì)組學的層面進一步理解這些細胞的生物學特性。 在后續(xù)章節(jié)中，我們將側(cè)重每種生物學目標單個細胞不同的分析方法。5.2 rt-q

39、pcr分析的ctc特征作為一種潛在的腫瘤分析物質(zhì)，平?？梢圆捎媒鯚o創(chuàng)的方式輕易地從血液屮獲得ctc。除 了 ctc的計數(shù)之外，ctc包含的分子信息是一種有前景的方法，能加深對治療反應和疾病進 展的理解。rt-qpcr是一種普遍用于ctc分子特征描述的方法。lianidou等人從事ctc分子 分析工作多年，他們開發(fā)了一種多重pcr結(jié)合液態(tài)微粒微陣列的方法同吋檢測多個基因的 表達水平。在2011年，他們的小組研究乳腺癌cst6,brms1和sox17的啟動子甲基化狀態(tài)， 并斷定癌癥抑制基因和轉(zhuǎn)移抑制基因的甲基化是ctc出現(xiàn)的標志。最近在一個尚風險前列腺 癌患者群體中，他們對已經(jīng)確認的以上皮標志物

40、、干細胞標志物、emt標志物、psa、tmerss2 erg融合絲朿蛋白3為目標的rt-qpcr試驗進行了檢驗。他們利用cellsearch系統(tǒng)進行檢 驗，報告了 87%的ctc樣品陽性率，表明至少上述日標中的一種出現(xiàn)了陽性表達。該試驗似 乎具有在正常造血細胞背景中區(qū)分ctc的潛力，因為健康個體中沒有檢出上述目標。其他研 究也顯示在ctc mrna層面檢測ck19可能是無病存活和化療耐藥性的獨立預測因素。5.3批量/單一細胞層面的高分辨率ctc特征精準醫(yī)療需要準確分析疾病基因組特征的能力。利用ctc作為鑒別基因組變異的工具能支持 或補充傳統(tǒng)的活組織檢查。尤其是不可觸及轉(zhuǎn)移組織或重復活檢采樣不可

41、實現(xiàn)的情況下。ctc 用于疾病監(jiān)測非常有用。ctc動態(tài)變化的綜合分析能提供一致的、近乎無創(chuàng)的的疾病進展監(jiān) 測方法，性能優(yōu)于在治療開始時對原發(fā)組織進行一次分析。過去，生物和遺傳分析通常都基于來自細胞群體的大量物質(zhì)。但是，目前測序技術(shù)已經(jīng)取得 了巨大的進步，因此目前可以實現(xiàn)單一細胞測序。該技術(shù)已經(jīng)從基于單一 pcr的分析前進 到單細胞ngs和單細胞rna測序。fi標是描述單一細胞的基因組特征。一個二倍體人體細胞包含7pgdna0分子技術(shù)通常需要較大數(shù)量的基因組dna。為了獲取足 夠的材料在全基因組層面分析單個細胞，需要對基因組dna進行擴增。在過去的25年屮, 一些全基因組擴增技術(shù)(whole g

42、enome amplification wga)已經(jīng)hl現(xiàn)，現(xiàn)在這些技術(shù)變得 更加可靠。這些擴增方法基于pcr或多重置換擴增。每種wga方法具有其自身的特點，如 擴增偏倚、基因組覆蓋、等位基因漏失和優(yōu)先擴增。應該基于研究的問題和后續(xù)應用選擇適 當?shù)膚ga方法。在單一細胞層而研究ctc需要非常先進的平臺來應對2個主要的挑戰(zhàn):罕見細胞和低模板量 (dna/rna/蛋白質(zhì))。一些研究顯示原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤的ctc具有一些相同的特征。很明 顯，每個細胞都是獨一無二的，每種ctc變化的分析也是動態(tài)可變的。2014年，lohr等人 的報告稱一個綜合平臺能夠?qū)υ从谇傲邢侔┗颊叩腸tc進行分離、鑒別和外顯子測

43、序。前列 腺癌ctc的分析極為重要，因為這種癌癥可能會轉(zhuǎn)移到骨骼，這是活檢不可觸及的部位。他 們的數(shù)據(jù)揭示可以利用單一核苛酸變體進行腫瘤演進過程研究、監(jiān)測癌癥進展并通過跟蹤 ctc執(zhí)行基因型導向療法，尤其是需要進行轉(zhuǎn)移癌癥采樣時。為了完全描述ctc的特征，許多研究結(jié)合不同的方法來將單一 ctc作為分子分析的純粹樣 品。一個例子是結(jié)合cellsearch (富集前步驟)和deparray (單細胞選擇)技術(shù)。這種聯(lián)合 技術(shù)已經(jīng)成功地應用于一些研究并顯示出同一個患者的ctc存在分子異質(zhì)性,遠端轉(zhuǎn)移組織 的ctc遺傳特性與原發(fā)腫瘤組織也不同。為了將ctc作為診斷工具使用，polzer等人開發(fā)出 一個

44、對乳腺癌患者的ctc進行分子特征描述的工作流程。首先，他們利用cellsearch系統(tǒng)富 集ctc,接著采用deparray系統(tǒng)區(qū)分單個ctc。之后使用amplil試劑盒擴增該細胞并采用 array-cgh和測序進行分析。他們研究erbb2 (her2)、pik3ca點突變的拷貝數(shù)擴增以及原 發(fā)腫瘤和ctc屮的全基因組拷貝數(shù)變化(copy number alternations cnas),結(jié)果顯示大部分 乳腺癌患者屮，ctc同樣具有erbb2擴增。有意思的是，他們觀測到ctc和原發(fā)瘤z間pik3ca 突變存在較高的不一致率一一66%o但是作者并未執(zhí)行原發(fā)瘤亞克降分析排除先前存在的克 隆。ct

45、c特征還可以用于監(jiān)測治療時疾病的進展。dago等人分離了 ctc,擴增了 dna并研究了 去勢耐受性前列腺癌患者的ctc的cna。他們利用ngs方法分析單一細胞的全基因組拷貝 數(shù)并研究了化療和靶向療法執(zhí)行期間cna的變化。在靶向療法期間出現(xiàn)了一個新的克隆， 表明myc和androgen受體(ar)的擴增，說明對抗荷爾蒙療法存在耐藥性。另一個臨床相 關應用是對癌癥相關基因進行大規(guī)模平行測序。heitzer等人利用array-cgh研究了結(jié)腸直腸 癌患者的ctc以及68個與結(jié)腸直腸癌相關基因。同時他們利用相同的癌癥相關基因?qū)υl(fā) 腫瘤進行深度測序。通過這個方法，他們發(fā)現(xiàn)ctc中檢測岀的一些突變在亞

46、克隆層面上原發(fā) 腫瘤也可以檢出。根據(jù)數(shù)據(jù)評估消耗的時間和成本，這種研究ctc的靶向方法對減少易管理 部分的測序數(shù)據(jù)非常有用。ctc另一個非常強大的用途是ctc衍生的外植體(cdx)o hodgkinson等人證明小細胞肺癌患 者的ctc在免疫力低下的小鼠身上對以致癌。該致癌性cdx在體內(nèi)容易運動并能作為研究 藥物耐藥性機制的可行方法。一個理解潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移形成生物學的重要方法是癌癥細胞的轉(zhuǎn)錄組分析。基于mrna的 方法可以更詳細地了解不同細胞類型的功能和活動。對于研究腫瘤組織屮的基因表達，微陣 列研究易于執(zhí)行，但進行來自臨床樣品的單個細胞的mrna研究仍然是一項技術(shù)挑戰(zhàn)。一 個成功的方法是利用

47、癌癥相關基因的轉(zhuǎn)錄圖譜。powell等人利用87個基因研究乳腺癌細胞 系和乳腺癌患者ctc?；诒磉_數(shù)據(jù)，他們將ctc分為2類：一類具有較強的表達細胞，另 一種具有較弱的表達細胞。他們發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)移有關的基因以及與emt有關的基因(vimentin.zeb2)表達相對穩(wěn)定，表明其為侵襲性表型。在該研究屮，他們第一時間展示了將個體ctc 基因表達作為單個細胞急性研究的可行性，而不是作為混合的ctc研究。在相似的研究中， chen等人研究了轉(zhuǎn)移的前列腺癌的ctc的emt相關基因。基于84個emt相關基因和參考 基因的表達，他們能鑒別出在去勢耐受性癌癥中表達的emt相關基因的亞組。有趣的是， 他們提供了

48、獨特的的emt基因標簽，盡管ctc代表高度異質(zhì)性細胞群體。為了宏觀地了解基因表達，微陣列或mrna測序是理想的方法選擇。但是和單一細胞dna 分析類似，單一細胞的mrna需要首先進行全轉(zhuǎn)錄組擴增。一般來說,rna被逆轉(zhuǎn)錄為cdna, 隨后在進行測序或基因表達微陣列分析前進行文庫制備。一項冋顧性研究已經(jīng)對單一細胞 rna測序進行了回顧。在yu等人進行的研究中，他們對內(nèi)生小鼠胰腺癌模型衍生的ctc進 行了 mrna測序。作者鑒別發(fā)現(xiàn)ctc屮wnt2的富集，表明失巢凋亡的抑制、轉(zhuǎn)移傾向加強、 錨非依賴性球體的形成。他們斷定wnt信號的非經(jīng)典活動對能會促進胰腺癌的轉(zhuǎn)移。在后 續(xù)研究中，采用非監(jiān)督分級群

49、居分析了 ctc的mrna圖譜，揭示不同于匹配原發(fā)腫瘤和癌 癥細胞系的3種遠端表達模式。第-種與ctc相關的表達模式高度表達上皮標志物，成為'經(jīng) 典ctc表型”；第二種與ctc相關的表達模式過表達血小板標志物如cd41和cd61,表明該 ctc被血小板覆蓋。最后一種表達模式顯示細胞增生標志物mki67的富集。有意思的是，作 者認為的經(jīng)典ctc表型是上皮細胞鈣粘蛋白的一般下調(diào)和emt間葉細胞轉(zhuǎn)錄的上調(diào)。值得 注意的是，上調(diào)的間葉細胞基因在ctc之間的表達具有多相性。經(jīng)典ctc表型的一般主題 是與基質(zhì)相關的細胞外基質(zhì)蛋白的表達，表明其在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮活躍的作用。5.4體外培養(yǎng)的功能化ct

50、c特征認為培植體內(nèi)的ctc是嚴峻的挑戰(zhàn)主要因為ctc在循環(huán)中非常罕見。ctc非常脆弱的特點和 不為人知的恰當?shù)腸tc培養(yǎng)條件使得它們難以培養(yǎng)。此外，目前大部分的技術(shù)是在固定步驟 之后鑒別ctc,不能進行后續(xù)培養(yǎng)。盡管存在這些挑戰(zhàn)，但是一些關于ctc培養(yǎng)的研究已經(jīng) 陸續(xù)發(fā)表。有意思的是，盡管許多ctc源于上皮，但是可以在懸浮狀態(tài)下進行培養(yǎng)而無需粘 附到培養(yǎng)盤的底部。2013年,zhang等人利用乳腺癌患者腦部轉(zhuǎn)移病變的樣品第一次成功地進行了長期ctc培養(yǎng)。 具有特定腦部轉(zhuǎn)移標志物“her2+/egfr+/hpse+/notchl”的epcam陰性ctc系被研發(fā)和鑒 別出來。利用異種移植小鼠模型，這些細胞被證明具有高度的侵襲性并能轉(zhuǎn)移到遠端器官位 點。yu等人利用微流體設備大量分離ctc。分離的ctc隨后被置于條件經(jīng)過調(diào)整的體內(nèi)培養(yǎng)。 他們能從6/36名患者中建立ct