核酸的降解與核苷酸代謝

1、9核酸的降解與核苷酸代謝   第十一章 核酸的酶促降解和核苷酸代謝11.1核酸的酶促降解 11.1.1核酸酶 11.1.2脫氧核糖核酸酶 11.1.3限制性內(nèi)切酶11.2核苷酸分解代謝 11.2.1核苷酸的降解 11.2.2嘌呤的降解 11.2.3嘧啶的降解11.3核苷酸的生物合成 11.3.1核糖核苷酸的合成 11.3.2脫氧核苷酸合成第十一章 核酸的降解與核苷酸代謝 11.1 核酸的酶促降解核酸的酶促降解生物體內(nèi)存在著多種降解核酸的酶類，這些酶在核酸徹底降解及周轉(zhuǎn)中起著重要作用。核酸在各種核

2、酸酶的催化下，逐步降解為多核苷酸、寡核苷酸，和單核苷酸：?jiǎn)魏塑账岬倪M(jìn)一步分解需要另外一些酶的催化，最終生成核糖或脫氧核糖以及嘌呤堿和嘧啶堿。這些堿基的分解則又經(jīng)過(guò)另外的酶進(jìn)行催化，最終生成代謝終產(chǎn)物而排出體外或進(jìn)行再利用。分解核酸的酶類根據(jù)其作用于核酸的部位分為內(nèi)切核酸酶(endonuclease)和外切核酸酶(exonuclease)。根據(jù)對(duì)底物的專一性又分為核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)、脫氧核糖核酸酶(dexyribonuclease，DNase)，兩者統(tǒng)稱為核酸酶(nuclease)，具有位點(diǎn)識(shí)別專一性的內(nèi)切酶又稱限制性內(nèi)切酶。11.1.1核酸酶核酸酶既可作用于RN

3、A，也可作用于DNA。11.1.1.1外切核酸酶外切核酸酶作用于核酸鏈的一端，逐個(gè)水解下核苷酸。它們是非特異性的磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶是從DNA或RNA的游離3-羥基端開(kāi)始，逐個(gè)水解下5-核苷酸；牛脾磷酸二酯酶則相反，從游離5-羥基端開(kāi)始，逐個(gè)水解下3-核苷酸11.1.1.2內(nèi)切核酸酶內(nèi)切核酸酶特異地水解多核苷酸內(nèi)部各鍵，它們是特異性強(qiáng)的磷酸二酯酶，如牛胰核酸酶作用于嘧啶核苷酸的磷酸二酯鍵，生成嘧啶核苷-3-磷酸或末端為嘧啶核苷-3-磷酸的寡核苷酸。其專一作用于RNA，對(duì)DNA及其它磷酸二酯化合物不作用或作用活性很低。牛胰RNase具有高度熱穩(wěn)定性。許多RNAase也都是如此。牛胰RNa

4、se(RNase )是最早分離純化并結(jié)晶的第一個(gè)RNase，由124個(gè)氨基酸組成。11.1.2 脫氧核糖核酸酶脫氧核糖核酸酶專一水解DNA，作用方式作為內(nèi)切酶，切斷雙鏈，或切斷單鏈，作為外切酶有53切割或是35切割。例如牛胰脫氧核糖核酸酶(DNase )，可切割雙鏈和單鏈DNA，產(chǎn)物為5-磷酸為末端的寡核苷酸，而牛脾脫氧核糖核酶(DNase )降解DNA產(chǎn)生3-磷酸為末端的寡核苷酸。還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有堿基專一性DNase，但是有序列專一性，這就是限制性內(nèi)切酶(restriction endonuclease)。11.1.3 限制性內(nèi)切酶W Arber，H Smith和D Nathans等人在1979

5、年發(fā)現(xiàn)在某些細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)存在一類能識(shí)別一定序列并水解外源雙鏈DNA的內(nèi)切核酸酶，其特點(diǎn)是具有極高的專一性，能識(shí)別DNA雙鏈上的特定位點(diǎn)，稱為限制性內(nèi)切酶(restriction  endonuclease)，也稱限制酶(restriction  enzyme)。限制酶由于其在基因工程上的重要作用而受到重視。細(xì)菌除具有限制酶外，還具有一種對(duì)自身DNA起修飾作用的甲基化酶。一種限制酶和其相應(yīng)的修飾酶對(duì)底物DNA的識(shí)別和作用的部位是相同的。修飾酶使該部位上的堿基甲基化，從而使限制酶對(duì)這種修飾過(guò)的DNA不再起作用。在細(xì)胞中，限制酶的生物學(xué)功能在于降解外源侵入的DNA，但不降解經(jīng)修飾酶

6、甲基化保護(hù)的自身DNA。限制酶具有很強(qiáng)的專一性。它們對(duì)底物DNA有特異的識(shí)別位點(diǎn)(或稱識(shí)別序列)。這些位點(diǎn)的長(zhǎng)度一般在48堿基對(duì)范圍內(nèi)。通常具有回文結(jié)構(gòu)(palindromic structure)。切割后形成粘性末端(cohesive end)或平齊末端(blunt end)。下面是大腸桿菌的一種限制酶EcoRI對(duì)DNA的識(shí)別順序(箭頭表示酶的作用點(diǎn))和酶作用產(chǎn)物的粘性末端。5pGAATTCp3  EcoRI         5pG       

7、;         pAATTCp33pCTTAAGp5           3pCTTAAp                Gp5環(huán)狀或線狀的雙鏈DNA分子經(jīng)限制酶作用后都形成線狀雙鏈DNA，每條單鏈的一端帶有識(shí)別順序中的幾個(gè)互補(bǔ)堿基，這樣的末端稱為粘性末端

8、。限制酶的命名較為特殊。以EcoRI為例，第一個(gè)大寫(xiě)字母E為大腸桿菌的屬名(Escherichia)的第一個(gè)字母，第二、三兩個(gè)小寫(xiě)字母co為它的種名(coli)的頭兩個(gè)字母。第四個(gè)字母用大寫(xiě)R，表示所用大腸桿菌的菌株。最后一個(gè)羅馬字表示從該細(xì)菌中分離出來(lái)的這一類酶的編號(hào)。限制酶是DNA的分子剪刀，是DNA體外重組技術(shù)和進(jìn)行大分子DNA分析的重要工具。它們的發(fā)現(xiàn)大大地促進(jìn)了基因工程的研究。目前已發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種可用于DNA研究的限制酶、連接酶和修飾酶等多種酶，總稱為分子生物學(xué)技術(shù)的“工具酶”11.2 核苷酸分解代謝11.2.1核苷酸的降解核苷酸經(jīng)核苷酸酶(nucleotidase)催化，水解為核苷及

9、無(wú)機(jī)磷酸。非特異性的核苷酸酶，能作用于一切核苷酸。某些特異性強(qiáng)的核苷酸酶只能水解3-核苷酸或5-核苷酸，分別稱為3-核苷酸酶或5-核苷酸酶。核苷經(jīng)核苷酶(nucleosidase)作用分解為嘌呤堿或嘧啶堿和戊糖。分解核苷的酶有兩類。核苷磷酸化酶(nucleoside  phosphorylase)廣泛存在于生命機(jī)體中，催化反應(yīng)可逆；而核苷水解酶(nucleoside  hydrolase)主要存在于植物、微生物體內(nèi)，只作用于核糖核苷，催化反應(yīng)不可逆。戊糖和戊糖-1-磷酸可進(jìn)入糖代謝分解或重新利用，嘌呤和嘧啶也可以繼續(xù)分解。11.2.2 嘌呤的降解腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤均經(jīng)脫氨氧化轉(zhuǎn)

10、變?yōu)辄S嘌呤再進(jìn)行降解，不同種類的生物分解嘌呤堿的酶系不一樣。人類、靈長(zhǎng)類、鳥(niǎo)類、爬蟲(chóng)類以及大多數(shù)昆蟲(chóng)中嘌呤的最終產(chǎn)物為尿酸；除了人類、靈長(zhǎng)類以外的哺乳動(dòng)物、腹足類則為尿囊素；某些硬骨魚(yú)中則尿囊素再繼續(xù)分解為尿囊酸；大多數(shù)魚(yú)類、兩棲類中尿囊酸再分解為尿素和乙醛酸；海洋無(wú)脊椎動(dòng)物星蟲(chóng)類、甲殼類則將尿素分解為氨和二氧化碳。從以上所述可以看出，生物進(jìn)化程度愈高，則分解嘌呤的能力愈差。高等生物具有完善的排泄系統(tǒng)，可以直接將代謝廢物排出體外（圖11-1）。  圖111  嘌呤的分解代謝在植物體中也發(fā)現(xiàn)了與嘌呤降解有關(guān)的酶。如黃嘌呤氧化酶、尿酸酶、尿囊素酶、尿囊酸酶，還發(fā)現(xiàn)了嘌呤的中間產(chǎn)

11、物如尿囊酸等。而且降解主要在儲(chǔ)藏或衰老組織中進(jìn)行。降解物主要以尿囊酸的形式運(yùn)輸?shù)接啄劢M織或根部貯存起來(lái)。11.2.3 嘧啶的降解與嘌呤分解類似，嘧啶分解時(shí)有氨基的首先水解脫氨基。胞嘧啶首先水解脫氨基，轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，尿嘧啶和胸腺嘧啶經(jīng)還原打破環(huán)內(nèi)雙鍵后，水解開(kāi)環(huán)成鏈狀化合物，再水解成CO2、NH3、-丙氨酸、-氨基異丁酸，后者脫氨基后進(jìn)入有機(jī)酸代謝或直接排出體外(圖11-2)。不同種類的生物對(duì)嘧啶的分解過(guò)程不一樣，在某些生物體內(nèi)，脫氨基作用也可在核苷酸、核苷或堿基水平上進(jìn)行。圖11-2嘧啶的分解代謝11.3 核苷酸的生物合成11.3.1核糖核苷酸的合成核苷酸是核酸合成的原料，所有的生物通常都能合

12、成各種核苷酸。常見(jiàn)的合成途徑有兩條：一條是利用氨基酸、磷酸戊糖等簡(jiǎn)單的化合物合成核苷酸，稱為從頭合成(de nove synthesis)；另一條是利用核酸降解或進(jìn)食等從外界補(bǔ)充的含氮堿基或核苷合成新的核苷酸，稱為救補(bǔ)途徑(salvage pathway)。11.3.1.1 嘌呤核苷酸的生物合成20世紀(jì)50年代后期，利用同位素標(biāo)記，以鴿肝為材料闡明嘌呤核苷酸的生物合成途徑，后來(lái)在其他動(dòng)、植物和微生物中也相繼找到了類似的酶和合成中間產(chǎn)物，因此，一般認(rèn)為在所有生物中合成嘌呤的過(guò)程基本相同。最先合成的是次黃嘌呤核苷酸(IMP)，再由IMP生成AMP和GMP。嘌呤環(huán)上第一位的N來(lái)自天冬氨酸的氨基氮，第

13、3位和第9位的N來(lái)自谷氨酰胺的酰胺氮，第2位和第8位的C來(lái)自甲酸鹽，第6位的C來(lái)自二氧化碳，第4位、第5位的碳和第7位的氮來(lái)自甘氨酸(圖11-3)。               圖11-3嘌呤環(huán)的元素來(lái)源1. IMP的生物合成次黃嘌呤核苷酸合成過(guò)程比較復(fù)雜，從5-磷酸核糖開(kāi)始到IMP生成為止，共11個(gè)反應(yīng)步驟，合成要點(diǎn)如下： 嘌呤核苷酸的合成并不是先形成游離的嘌呤，然后生成核苷酸，而是直接形成次黃嘌呤核苷酸。 5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphor

14、ibosyl-1-pyrophosphate， PRPP)是核苷酸中核糖磷酸部分的供體。 嘌呤的各個(gè)原子是在PRPP的C-1位置上逐漸加上去的。其關(guān)鍵步驟是從PRPP和谷氨酰胺形成5-磷酸核糖胺。在這個(gè)反應(yīng)里，C-1從-構(gòu)型轉(zhuǎn)變?yōu)?構(gòu)型。由此形成的CN糖苷鍵具天然核苷酸所特有的-構(gòu)型。這個(gè)反應(yīng)由焦磷酸的水解向前驅(qū)動(dòng)。 在5-磷酸核糖胺的氨基位置，由甘氨酸和甲川四氫葉酸先后提供C和N原子形成甲酰甘氨酰胺，至此嘌呤環(huán)骨架的4、5、7、8、9位順序已形成。 由谷酰胺的酰胺基提供第3位N原子，形成甲酰甘氨脒核苷酸，接著脫水閉環(huán)成5-氨基咪唑核苷酸，反應(yīng)所需能量來(lái)自ATP。 再后，由CO2、天冬氨酸、甲

15、酰四氫葉酸先后提供六元環(huán)上的其他原子，最后形成次黃嘌呤核苷酸。(圖11-4)114  次黃嘌呤核苷酸（IMP）的從頭合成2. GMP和AMP的合成IMP由天冬氨酸提供氨基轉(zhuǎn)移到C-6位上生成AMP，此過(guò)程需經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)，由GTP提供能量。另外IMP經(jīng)過(guò)脫氫酶催化的脫氫反應(yīng)，由NAD+接受脫下的氫，IMP生成黃嘌呤核苷酸(XMP)，再由谷氨酰胺提供酰胺上的氨，ATP供能，XMP轉(zhuǎn)變成GMP(圖11-5)。圖115 腺嘌呤核苷酸和鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的生成嘌呤核苷酸生物合成過(guò)程的闡明對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)及生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的意義。在了解核苷酸合成途徑的基礎(chǔ)上，人們可以設(shè)計(jì)有效的核苷衍生物作為治癌藥物，可以

16、指導(dǎo)有關(guān)核苷酸生產(chǎn)的菌種選育等。癌細(xì)胞內(nèi)核酸的合成作用要比正常細(xì)胞旺盛得多，如果適當(dāng)?shù)匾种坪塑账岬暮铣?，就有可能抑制癌?xì)胞的增生。如甲基氨基蝶呤和四氫葉酸的結(jié)構(gòu)很相像，對(duì)嘌呤核苷酸合成過(guò)程中第(4)、(10)兩反應(yīng)中的酶起競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，使反應(yīng)速度減慢或停止。目前在臨床上已用來(lái)治療各種急性白血病、絨毛膜上皮細(xì)胞癌、惡性葡萄胎等。肌苷酸(即次黃嘌呤核苷酸)是一種高效的助鮮劑。11.3.1.2 嘧啶核苷酸的生物合成1. 尿嘧啶核苷酸的生物合成由于嘧啶環(huán)較嘌呤簡(jiǎn)單，其合成途徑20世紀(jì)40年代即已闡明。其特點(diǎn)是先合成游離嘧啶環(huán)，再由PRPP提供磷酸核糖生成嘧啶核苷酸。用同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證明：嘧啶環(huán)上的N

17、-3來(lái)自NH3，C-2來(lái)源于CO2，其余四個(gè)原子來(lái)源于天冬氨酸(圖11-6)。動(dòng)物中，合成場(chǎng)所是肝臟。從氨甲酰磷酸合成開(kāi)始，到尿嘧啶核苷酸生成為止共需6個(gè)步驟(圖11-7)。兒童有一種生長(zhǎng)異常的遺傳性疾病一巨紅細(xì)胞貧血癥，患者排泄大量的乳清酸，這是由于患者體內(nèi)乳清酸核苷5-磷酸脫羧酶和乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的活力較低。當(dāng)用尿嘧啶核苷等嘧啶核苷來(lái)供給這些兒童食用時(shí)，貧血癥可得到改善，并且乳清酸的排出減少?？赡苁悄蜞奏ず塑战?jīng)磷酸化變成UMP，然后UMP可能變?yōu)槠渌奏ず塑账崾购怂岷偷鞍踪|(zhì)的合成重新恢復(fù)正常。此外增加細(xì)胞內(nèi)嘧啶核苷的濃度可抑制氨甲酰磷酸合成酶使乳清酸生成減少。圖116  嘧啶

18、環(huán)上各原子的來(lái)源圖117  尿嘧啶核苷酸的從頭合成2. 胞嘧啶核苷酸的合成尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘奏ず塑账崾窃诤塑杖姿岬乃缴线M(jìn)行的。在細(xì)菌中UTP直接與NH3作用產(chǎn)生CTP。而動(dòng)物組織中由Gln提供NH3，反應(yīng)要有ATP供能，由CTP合成酶催化反應(yīng)。3.胸腺嘧啶核苷酸的合成在DNA中存在著另一種嘧啶核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTMP)，它由dUMP在dTMP合成酶的催化下甲基化生成。由葉酸衍生物作為一碳單位的供體和還原劑(圖11-8)。圖11-8胸腺嘧啶的生物合成11.3.1.3 核苷酸合成的補(bǔ)救途徑哺乳動(dòng)物和微生物中存在許多催化嘌呤堿基和嘧啶堿基合成單核苷酸的酶，這樣可以使核酸降

19、解產(chǎn)物或外源補(bǔ)充的堿基得到直接利用。1. 嘌呤核苷酸合成的補(bǔ)救途徑在機(jī)體內(nèi)，除了上述從頭合成途徑外，嘌呤核苷酸的合成還有補(bǔ)救途徑。補(bǔ)救途徑就是利用從核酸分解產(chǎn)生的或新合成的現(xiàn)有的嘌呤堿同1磷酸核糖和ATP反應(yīng)或直接同PRPP反應(yīng)，直接生成嘌呤核苷酸的過(guò)程。前者需要核苷磷酸化酶（ribonucleoside phosphatase）和腺苷激酶（adenosine kinase）的催化，后者則需要磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（phosphoribosyl transferase）的催化：嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶在人類嘌呤核苷酸代謝中非常重要。在人類中發(fā)生了Lesch Nyhan綜合征，這是一種與X染色體連鎖的隱性伴性

20、遺傳代謝病，主要見(jiàn)之于男性，患者行為反常、智力遲鈍、痙攣性大腦麻痹且自我毀傷?；颊呦忍煨匀狈Υ吸S嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)。在正常的情況下嘌呤核苷酸的從頭合成和補(bǔ)救途徑之間存在平衡，缺少補(bǔ)救途徑會(huì)引起嘌呤核苷酸合成的增加，患者嘌呤核苷酸合成通常為正常值的200倍。嘌呤代謝嚴(yán)重紊亂，尿酸為正常值的6倍，血中尿酸水平升高。過(guò)多的尿酸導(dǎo)致腎結(jié)石和痛風(fēng)。這些癥狀可通過(guò)別嘌呤醇對(duì)嘌呤氧化酶的抑制而得到緩解，但對(duì)自殘癥狀無(wú)效?，F(xiàn)在還不知道缺少補(bǔ)救途徑為什么會(huì)造成如此嚴(yán)重的神經(jīng)病癥狀。2. 嘧啶核苷酸合成的補(bǔ)救途徑  除上述從頭合成途徑外，嘧啶核苷酸的合成也可以由外源性或由核酸降解生成

21、的嘧啶堿與5磷酸核糖焦磷酸或1磷酸核糖反應(yīng)直接合成，即補(bǔ)救途徑。其中，尿嘧啶核苷酸可以有以下兩種合成途徑：（1）尿嘧啶與5磷酸核糖焦磷酸經(jīng)尿嘧啶核苷酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（UMP phosphoribose transferase）的催化而生成：（2）尿嘧啶與1磷酸核糖經(jīng)尿苷磷酸化酶（uridine phosphorylase）的催化生成尿嘧啶核苷，后者在尿苷激酶(uridine kinase)的催化下，從ATP獲得磷酸基團(tuán)而生成尿嘧啶核苷酸：胞嘧啶不能直接從PRPP獲得磷酸核糖，但胞嘧啶核苷可以通過(guò)尿苷激酶生成胞嘧啶核苷酸：11.3.1.4 核苷二磷酸、核苷三磷酸的合成在生物體內(nèi)，核苷酸往往以核苷

22、二磷酸、核苷三磷酸的形式參與合成反應(yīng)。這些(d)NDP和(d)NTP的生成是在(d)NMP水平上，由ATP提供磷酸根，由相應(yīng)專一的激酶所催化合成。如腺苷酸激酶，鳥(niǎo)苷酸激酶、嘧啶核苷酸激酶所催化的核苷二磷酸生成的反應(yīng)：(d)AMP+(d)ATP(d)ADP+(d)ADP(d)GMP+(d)ATP(d)GDP+(d)ADP(d)CMP+(d)ATP(d)CDP+(d)ADP(d)UMP+(d)ATP(d)UDP+(d)ADP核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphoate kinase)使核苷二磷酸和核苷三磷酸相互轉(zhuǎn)變，該酶的特異性很低，所有核苷二磷酸和核苷三磷酸都可以作為磷酸根的受體和供體。(d)N1DP+(d)N2TP(d)N1TP+(d)N2DP11.3.2  脫氧核苷酸合成2-脫氧核糖核苷酸是脫氧核糖核酸(DNA)合成的前體物質(zhì)。它們都是由相應(yīng)的核苷酸通過(guò)以氫代替2-OH基團(tuán)還原得來(lái)。在某些微生物、動(dòng)植物中通常是在核苷二磷酸水平上發(fā)生還原反應(yīng)，而在另一些微生物如乳酸桿菌、枯草桿菌等以核苷三磷酸為還原底物