實驗五動物細胞培養(yǎng)與細胞活性檢測

1、實驗五動物細胞培養(yǎng)實驗五動物細胞培養(yǎng)與活性檢測與活性檢測實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膌了解動物細胞培養(yǎng)的基本知識。l了解體外培養(yǎng)細胞的的基本形態(tài)類型；學(xué)會通過鏡檢判定體外細胞生長的狀態(tài)。l了解動物細胞的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)和凍存的基本方法。l掌握動物細胞的活性檢測基本方法。實驗原理實驗原理l細胞培養(yǎng)（Cell culture）是模擬機體內(nèi)生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。l原代培養(yǎng)：直接從供體取來的細胞，組織或器官進行的初次培養(yǎng)。通常把l第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。l傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)物長成單層細胞，達到一

2、定密度時，營養(yǎng)消耗殆盡，需要補充營養(yǎng)，分開擴大培養(yǎng)，使之繼續(xù)增殖。注意的是傳代的這個“代”與細胞分裂的一個世代不同，一代細胞約分裂35次，不要混淆。l動物細胞培養(yǎng)的基本條件l體外培養(yǎng)細胞的條件總原則就是要盡可能模擬細胞在體內(nèi)生長的環(huán)境，因此必要的營養(yǎng)、適宜的胞外環(huán)境以及嚴格的無菌條件是主要的三個方面。營養(yǎng)：早期培養(yǎng)主要采用天然的生物性液體，但其成分不確定，難以控制營養(yǎng)成分?，F(xiàn)廣泛使用的是化學(xué)成分明確的各種商品化的合成培養(yǎng)基，其主要成分包括各種氨基酸、維生素、無機鹽、葡萄糖等必要的營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基中還含有酚紅指示劑，使培養(yǎng)基的顏色可顯示細胞生長狀態(tài)。隨著細胞數(shù)目的增長，酸性代謝物增多，培養(yǎng)基變黃

3、。污染的培養(yǎng)物也會使培養(yǎng)基迅速變黃。l培養(yǎng)基在使用前還要加血清，它的主要作用有三點：一是提供生長因子、激素、酶等營養(yǎng)；二是中和有毒物質(zhì)，對細胞起著保護作用，尤其可中和培養(yǎng)中使用的胰蛋白酶的毒性。第三是提供黏附和伸展因子，是貼壁細胞附壁生長所必不可少的。所以，血清的品質(zhì)對細胞的生長有很大影響，通常換用新的批次的血清，要預(yù)先進行血清的篩選實驗。l一般進口的胎牛血清更有利于細胞的生長，但價格較昂貴，可根據(jù)培養(yǎng)細胞的要求選用。另外，有些細胞培養(yǎng)中還需要添加谷氨酰胺Gln胞外環(huán)境條件：主要是溫度、氣體和pH條件。這些胞外環(huán)境條件應(yīng)該符合細胞在體內(nèi)的生長環(huán)境。l哺乳動物適宜的培養(yǎng)溫度是37，鳥類是39，爬

4、行類是2225等；大多動物細胞適宜的pH條件都7.27.4，以不超過pH6.87.6，為宜。在動物細胞培養(yǎng)過程中隨著代謝產(chǎn)物的積累，酸性產(chǎn)物增多。培養(yǎng)基的pH會下降。因此實驗室通常使用CO2氣體體積占5%的空氣作為細胞培養(yǎng)的氣體條件，以使CO2溶解在溶液中形成NaHCO3和H2CO3的緩沖體系，維持pH的穩(wěn)定。另外，培養(yǎng)基中加入HEPES（羥乙基哌嗪乙烷磺酸）可更有效的維持體系的pH。l無菌：組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素之一就是要避免污染，要樹立無菌操作觀念，從實驗用品、培養(yǎng)基和試劑、操作環(huán)境的滅菌消毒到超凈臺下的實驗操作，每一步都應(yīng)該嚴謹規(guī)范。l以單層細胞方式生長的細胞分泌細胞外基質(zhì)和黏蛋白以附著

5、于生長表面。不但不同的細胞系附著于表面的黏附程度有差異，不同狀態(tài)的細胞這種黏附也有差異。比如衰老的二倍體細胞通常比年輕的二倍體細胞黏附得更牢固。絕大多數(shù)的貼壁細胞需要用胰蛋白酶優(yōu)先催化堿性氨基酸與鄰近氨基酸羧基間的肽鍵水解，從而分解粘蛋白、糖蛋白，使細胞脫壁；有些細胞系貼壁不強，只要用吸管吹打即可使細胞脫落分散，而不需要使用胰蛋白酶；還有些細胞貼壁能力很強需要使用其他的蛋白酶，比如彈性蛋白酶、鏈霉素的酶等。為保障胰蛋白酶的最佳活性，在進行胰蛋白酶處理前應(yīng)去除血清、Ca2+及Mg2+離子。實驗材料與試劑實驗材料與試劑l材料：肝癌7404細胞和 hela細胞。l設(shè)備與用品：倒置顯微鏡，普通光學(xué)顯微

6、鏡，CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺，高壓滅菌鍋，0.22m的一次性濾器，無菌一次性注射器，細胞培養(yǎng)瓶，移液管，1ml吸頭，200ul吸頭，15ml離心管，50ml離心管，無菌1.5ml離心管，酒精燈，脫脂棉，試管架等，24孔板，研缽，細胞計數(shù)板，1 ml移液器,200ul移液器。l 藥品與試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基；胎牛血清；DMEM培養(yǎng)基，含EDTA的0.25%胰蛋白酶，PBS,75%酒精，無菌去離子水，太子參，白茶，新潔爾滅實驗方法與步驟細胞復(fù)蘇實驗方法與步驟細胞復(fù)蘇l冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細胞造成傷害，導(dǎo)致細胞之死亡。l細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其

7、細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常。l材料 37oC恒溫水槽 、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)瓶 步驟：步驟：l將新鮮培養(yǎng)基置于370C水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。 l取出冷凍管，立即放入37oC 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化，以75%ethanol擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。 l將細胞懸浮液加入有培養(yǎng)液的離心管中，1,500rpm離心5，棄上清，加入1l培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)液至5-8ml.l放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞傳代培養(yǎng)細胞傳代培養(yǎng) l細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為

8、1:2至1:3，依細胞種類而異。 l 材料： 1.無菌磷酸生理緩沖液(D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na)： 以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于20oC，使用前放在37 oC 水槽回溫。 3. 新鮮培養(yǎng)基 4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶 步驟步驟附著型附著型細細胞胞1.吸掉舊培養(yǎng)液。 2.用D-PBS 洗滌細胞一至二次。 3.加入trypsin-EDTA 溶液(0.8ml/25cm2, 1ml/75cm2)，37oC 作用2分鐘左右，于倒立顯微鏡下

9、觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，細胞漂起，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液4. 加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。 懸浮型細胞懸浮型細胞1.吸出細胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1500 rpm 5 分鐘。 2.吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。 細胞計數(shù)細胞計數(shù)l計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)板或是Coulter counter 粒子計數(shù)器自動計數(shù)。 l血球計數(shù)板一般有二個chambers，每個chamber中細刻9

10、 個1 mm2 大正方形，其中4 個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1 mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2 x 0.1mm1.0 x 10-4 ml。使用時，計數(shù)四個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目之和除以4，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml 中之細胞數(shù)目。 細胞計數(shù)板細胞計數(shù)板細胞活性測定臺盼藍染色法細胞活性測定臺盼藍染色法l原理：細胞損傷或死亡時，臺盼藍可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA 結(jié)合，使其著色。而活細胞能阻止染料進入細胞內(nèi)。故可以鑒別死細胞與活細胞。實驗材料實驗材料l 4%臺盼藍母液：稱取4g臺盼藍，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100ml用濾紙過濾，4度保存。使用時。用PBS稀釋至0.4%l 吸管、血細胞計數(shù)板、顯微鏡步驟：步驟：l制備單細胞懸液。并作適當稀釋（106細胞/mll染色：細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9:1混合混勻。l計數(shù)：在三