環(huán)境微生物的檢測(cè)與分析

1、環(huán)境微生物的檢測(cè)與分析實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)一 土壤微生物拮抗菌的分離與測(cè)數(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關(guān)準(zhǔn)備工作及操作方法。2、初步掌握從土壤中分離微生物和測(cè)數(shù)的基本方法。3、了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握其配制過(guò)程和方法。4、掌握實(shí)驗(yàn)室?guī)追N滅菌方法及技術(shù)。5、掌握無(wú)菌操作技術(shù)。6、了解平板菌落計(jì)數(shù)的原理。7、識(shí)別土壤中幾大類(lèi)微生物的菌落特征。8、學(xué)習(xí)拮抗作用的試驗(yàn)方法，觀(guān)察微生物間的拮抗現(xiàn)象及抗生素的抗菌作用。二、實(shí)驗(yàn)材料1、器材：電子天平、帶有玻璃珠的三角瓶、搖床、1mL的無(wú)菌吸管、10mL的刻度試管、無(wú)菌水、搪瓷缸、玻璃涂棒、牛角匙、pH試紙、封口膜、記號(hào)筆、線(xiàn)繩、紗布、培養(yǎng)皿、高壓蒸

2、汽滅菌器、稱(chēng)量紙、藥匙、試管架、涂布棒、酒精燈、超凈工作臺(tái)、火柴。2、試劑和材料：無(wú)菌牛皮紙袋、無(wú)菌鏟、標(biāo)簽、打孔器，鑷子，牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、 葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、75%酒精、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、蒸餾水、新鮮馬鈴薯、10%酚酞、乳酸。三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）培養(yǎng)基的配制（1）配制牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普遍的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 配方如下：牛肉膏 3 g 蛋白胨 10g NaCl 5g 瓊脂 15-20g 水 1000

3、 mL pH 7.4-7.61、稱(chēng)量藥品按實(shí)際用量計(jì)算后，按配方稱(chēng)取各種藥品放入搪瓷缸中。牛肉膏和蛋白胨可分別放在小燒杯或表面皿中稱(chēng)量，用熱水溶解后倒入搪瓷缸。蛋白胨極易吸潮，故稱(chēng)量時(shí)要迅速。 2、加熱溶解 在搪瓷缸中加入少量少于所需的水量，然后放入鍋中，在電磁爐上小火加熱，并用玻璃棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則需先調(diào)pH值后再溶解瓊脂，在此過(guò)程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)充所失水分。3、調(diào)pH 用pH試紙或酸堿度計(jì)檢測(cè)培養(yǎng)基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)檢測(cè)，直至達(dá)到所需pH范圍。若偏堿，則用1 mol/

4、l HCL進(jìn)行調(diào)節(jié)。 pH調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。注意pH值不要調(diào)過(guò)頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4、過(guò)濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過(guò)濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過(guò)濾，以利結(jié)果的觀(guān)察。 5、分裝 按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)。分裝時(shí)可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約至試管高度的 1/5；分裝入三角瓶?jī)?nèi)的以不超過(guò)其容積的一半為宜，半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜。 6、加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脫脂棉）制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要適合，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞

5、總長(zhǎng)3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防止棉花脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時(shí)也可用試管帽、塑料塞或封口膜代替棉塞。 7、包扎 加塞后，將三角瓶的棉花外包一層牛皮紙或雙層報(bào)紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)先把裝同類(lèi)培養(yǎng)基的試管扎成捆后，再于棉花塞外包一層牛皮紙。然后用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、組別、日期。 8、滅菌 將上述培養(yǎng)基于121攝氏度濕熱滅菌30 min。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。 9、擺斜面 滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長(zhǎng)木條上，并調(diào)整斜度，使斜面的長(zhǎng)度不超過(guò)試管總長(zhǎng)的1/2；待其凝固， 10、無(wú)菌檢查

6、 將滅菌的培養(yǎng)基放入37攝氏度溫箱中培養(yǎng)2448h，無(wú)菌生長(zhǎng)即可使用?；騼?chǔ)存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。 （2）、配制高氏一號(hào)培養(yǎng)基 高氏一號(hào)培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線(xiàn)菌的合成培養(yǎng)基。 配方如下： 可溶性淀粉20g KNO3 1 g NaCl 0.5 g K2HPO4 0.5 g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01 g 瓊脂20g 蒸餾水1000mL pH7.47.61、 稱(chēng)量和溶解 先計(jì)算后稱(chēng)量，按用量先稱(chēng)取可溶性淀粉，放入搪瓷缸中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加少許少量少于所需的水量，放入鍋中在電磁爐上邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。對(duì)微量成分Fe

7、SO4·7H2O可先配制成高濃度的儲(chǔ)備液后再加入，方法是先在100 ml 水中加入1g的FeSO4·7H2O，配成0.01 mg/ml的儲(chǔ)備液，再在1000 ml的培養(yǎng)基中加入以上儲(chǔ)備液0.1 ml即可。待所有的藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如果要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過(guò)程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。 2、pH 調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無(wú)菌檢查同上。（3）配制馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。 配方如下： 去皮的馬鈴薯 200g 蔗糖 20g 瓊脂20g 蒸餾水1000mL，自然pH 1、稱(chēng)量和溶解 先計(jì)算后稱(chēng)量，按用量稱(chēng)取各成分。將去

8、皮的馬鈴薯切片后放入鍋中，然后加少許少于所需的水量在電磁爐上加熱20 min，然后用雙層砂布過(guò)濾，濾液重新放入鍋中煮沸，然后加入稱(chēng)量好的蔗糖和瓊脂，待各成分溶解后，補(bǔ)充水分至所需體積。 2、同（2）2 （二）制備土壤稀釋液 （1）取土壤 取表層以下 510 cm 處的土壤樣品，放入滅菌的牛皮紙袋中，用鉛筆填寫(xiě)好標(biāo)簽，袋內(nèi)外各具一張。 （2）土壤預(yù)處理及保存將采集的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室平攤在聚乙烯塑料布上，在室溫下陰干，土塊捏碎，并檢出植物根、莖、葉及石塊等雜物，約20號(hào)篩篩分。土壤處理好后備用，或放在4攝氏度冰箱暫存。（3）制備土壤稀釋液（要無(wú)菌操作） 1、制備土壤懸液取土樣 5 g，迅速倒入帶玻璃

9、珠的45 mL無(wú)菌三角瓶中（玻璃珠用量以充滿(mǎn)瓶底為最好），置搖床中振蕩 510 min，使土樣充分打散，即成 10-1 的土壤懸液。2、稀釋用無(wú)菌移液管吸10-1 的土壤懸液0.5 mL，放入4.5 mL 無(wú)菌水中，震蕩混勻即為10-2 稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-2 10-9 的稀釋液。注意：操作時(shí)移液管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換一支移液管，每次吸土液，要將移液管插在液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。實(shí)驗(yàn)三 變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析技術(shù)及其在微生物種群多樣性研究中的應(yīng)用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、了解并掌握變性梯度凝膠電泳的原理。2、掌握變性梯度凝膠電泳

10、分析植物內(nèi)生菌種群多樣性。二、實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)材料生長(zhǎng)健壯的植株。2、實(shí)驗(yàn)儀器PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、變性梯度凝膠電泳儀（儀器型號(hào)：Decode Universal Mutation Detection System）、凝膠成像及分析系統(tǒng)、高速離心機(jī)。 3、實(shí)驗(yàn)試劑（1）CTAB-NaCl4.1 g NaCl稱(chēng)溶解在80 mL水中，再緩慢加入10 g 的CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），加熱65溶解攪拌，定容至1000 mL。（2）50×TAE 緩沖液121 g Tris，18.6 g EDTA，量取28.6 mL冰醋酸，加水至500 mL，pH 8.5。（3）10% APS

11、（過(guò)硫酸銨貯存液）10 mL 配制：1g 過(guò)硫酸銨加水至10mL 。 （4）TEMED(N，N，N，N，四甲基乙二胺)10% APS：TEMED = 4.5：1（5）變性劑貯存液(0%)：6%丙烯酰胺100 mL 溶液：15 mL 40% Arc/Bis，2 mL50×TAE 緩沖液，加水至100 mL。（6）變性劑貯存液(100%)：6%丙烯酰胺15 mL 40% Arc/Bis；2 mL 50×TAE 緩沖液；40 mL去離子甲酰胺；42 g尿素，加水至100 mL。（7）溴化乙錠EB溶液50mg溴化乙錠溶于100ml雙蒸水，工作濃度為0.5g/ml，避光保存。（8）固

12、定液150 mL無(wú)水乙醇加入去離子水至500 mL。（9）固定液25 mL硝酸加入去離子水至500 mL。（10）0.12%銀染試劑0.18g AgNO3加入去離子水至150 mL，同時(shí)加入110 L 37%-40%的甲醛混勻即可，需新鮮配制。（11）顯色液4.5g Na2CO3加入去離子水至150 mL，需新鮮配制，4冰箱保存?zhèn)溆?，用前加?5 L甲醛構(gòu)成顯影液。（12）終止液15 mL冰乙酸加入去離子水至500 mL。4、PCR擴(kuò)增引物第一輪PCR引物：fM1: 5-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3 和rC5: 5-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3f515-GC

13、:5-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3 和rC5: 5-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3三、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）基因組提取及PCR擴(kuò)增1、總基因組的提取采用改良的CTAB法提取植物樣品的總基因組DNA，方法如下：（1）將預(yù)處理后的2 g樣品在無(wú)菌研缽內(nèi)用液氮充分研磨至細(xì)粉末狀，稱(chēng)取0.2 g樣品裝入1.5 ml 無(wú)菌的eppendorf管中。（2）加入1 mL CTAB提取液（65預(yù)熱），立即混勻，65水浴90 min，每間隔20-30 min輕輕顛倒eppendorf管混勻一次，12000 rpm 4離

14、心10 min。（3）取上清，加2/3體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），顛倒數(shù)次充分混勻，12000 rpm，4，離心10 min，如此重復(fù)至上層變澄清。（4）取上清，加2/3體積的氯仿/異戊醇（24：1），顛倒數(shù)次充分混勻，12000 rpm，4離心10 min。（5）取上清，加1/10體積的NaAC溶液和1個(gè)體積的無(wú)水乙醇（-20預(yù)冷），在-20下沉淀30 min以上，8000 rpm離心5 min。（6）棄上清，用70%酒精洗滌沉淀2次，8000 rpm離心5 min，真空干燥15 min。（7）加50 L TE溶液或ddH2O溶解DNA，取5 L 上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，

15、-20保存。2、16srDNA基因序列的PCR擴(kuò)增巢式PCR（Nested PCR）是使用兩對(duì)PCR引物擴(kuò)增目的DNA片段，第二對(duì)引物稱(chēng)為巢式引物，擴(kuò)增的目的片段包含在第一次PCR擴(kuò)增片段的內(nèi)部，保證第二次PCR產(chǎn)物幾乎或者完全沒(méi)有引物配對(duì)特異性不強(qiáng)造成的非特異性擴(kuò)增。因?yàn)榈诙?duì)引物要用于DGGE電泳分析，根據(jù)DGGE電泳的原理，上游引物的5端加上一段40 bp 左右的GC堿基序列（5-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG-3）。巢式PCR第一次PCR以總基因組為模板，擴(kuò)增出內(nèi)生菌的目的基因片段，第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物為模板，并

16、且退火溫度較高。反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer2.5 LdNTP Mixture(10 mM)0.5 LPrimer1 (10 pmol/µL)1.0 LPrimer2 (10 pmol/µL)1.0 LDNA模板1.0 LTaq （5 U/µL）0.2 LddH2O18.8 LTotal25 L反應(yīng)條件為：944min941min 501min 30cycles721min72 8min 8 （三）DGGE電泳采用Decode Universal Mutation Detection System（Bio-Rad，USA）對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行

17、電泳分離。具體步驟如下：1、膠槽的組裝先用95%乙醇清洗兩塊玻璃板及兩個(gè)間隔條，再用蒸餾水清洗一遍，干燥。將間隔條置于大玻璃板兩側(cè)邊緣并且缺口處放在內(nèi)側(cè)，再將小玻璃板放在上面并與之對(duì)齊，用夾子將兩塊玻璃板固定，并調(diào)水平及垂直平衡。2、DGGE膠的制做采用6%丙烯酰胺凝膠，根據(jù)不同目的片段的大小將0%和100%的變性劑按照相應(yīng)的比例配置不同的高濃度和低濃度的變性緩沖液，分別取高濃度和低濃度的變性劑溶液20 mL，加90 L的 4.5 L/mL 10% APS和20 L的lL/mL的TEMED（APS：TEMED =4.5:1），立即顛倒混合均勻。將高濃度變性劑溶液和低濃度變性劑溶液分別吸入相應(yīng)的

18、針筒，并固定在梯度形成器對(duì)應(yīng)的高低濃度兩側(cè)，將出膠針頭置于膠板之間。推動(dòng)梯度形成器，將膠灌入兩個(gè)玻璃板之間，注意避免產(chǎn)生氣泡。灌膠結(jié)束后，在膠板頂部小心傾斜插入梳子(避免產(chǎn)生氣泡)，靜置1.5-2 hr待膠凝固。及時(shí)將針筒中剩余的溶液排凈并清洗干凈。3、電泳在DGGE電泳槽中加入7L新鮮配置的1×TAE緩沖液，使電泳槽中的緩沖液頁(yè)面至“Full”和“Run”中間的位置，將膠板固定在黃色的凝膠板架上，放進(jìn)電泳槽中，最后將溫度控制器蓋在電泳槽上。接通電源，打開(kāi)電泳儀預(yù)熱使緩沖液的溫度達(dá)到60。輕輕將梳子拔出，將加樣孔中的緩沖液用加樣針吸出，緩緩加入約30 L 第二次PCR產(chǎn)物與6×Loading Buffer的混合液，100V電壓電泳12 hr。4、染色DNA染色采用銀染試劑盒進(jìn)行銀染，具體過(guò)程包括以下步驟：a) 固定1：將凝膠加入固定液1，輕輕搖動(dòng)孵育10 min，小心棄掉液體；b) 固定2：加入固定液2，輕輕搖動(dòng)孵育3 min，小心棄掉液體；c）用去離子水漂洗三次，每次5 min；d）銀染：加入0.12%銀染試劑暗處孵育20 min，棄液；e）去離子水沖洗兩次，每次2 min，充分倒掉去離子水；f）顯色：加入