表達(dá)水稻矮縮病毒外殼蛋白P8基因的轉(zhuǎn)基因水稻具有對(duì)該病毒中度的抗性

1、表達(dá)水稻矮縮病毒外殼蛋白P8基因的轉(zhuǎn)基因水稻具有對(duì)該病毒中度的抗性 摘要：對(duì)表達(dá)水稻矮縮病毒外殼蛋白P8基因的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行了遺傳研究，結(jié)果表明S8基因在轉(zhuǎn)基因株系T0-2的T1及T2代中穩(wěn)定遺傳并表達(dá)。病毒抗性試驗(yàn)結(jié)果表明，T1及T2代轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)病毒表現(xiàn)出中度的抗性，這說(shuō)明病毒抗性性狀可以穩(wěn)定遺傳。這是關(guān)于水稻矮縮病毒的病原引起抗性的首次報(bào)道。關(guān)鍵詞：水稻；水稻矮縮病毒；外殼蛋白基因；病毒抗性提取之前我們已經(jīng)獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株水稻（Oryza sativa L.） 含S8因編碼的水稻矮縮病毒（RDV）的外鞘蛋白通過(guò)粒子轟擊。在這項(xiàng)研究中，證實(shí)了在S8基因已 穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的自交T1和初級(jí)

2、T2后代 獲轉(zhuǎn)基因水稻植株行T0-2?？共《緦?shí)驗(yàn)表明，T1和T2 轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出抗RDV感染，說(shuō)明傳動(dòng)平穩(wěn)的電阻的特性。這項(xiàng)研究是關(guān)于病原體衍生的第一次報(bào)告 抗水稻矮縮病毒，phytoreovirus的一員。 介紹水稻矮縮病毒（ RDV ），這是病原體引起水稻矮縮病，確實(shí)埃韋勒損壞水稻生產(chǎn)在東南亞的區(qū)域。它是一個(gè)構(gòu)件家庭屬phytoreovirus的呼腸孤病毒和由兩個(gè)葉蟬發(fā)送pecies ，黑尾葉蟬和Recilla dorssalis （ Boccardo和米爾恩，1984）。RDV基因組由12個(gè)雙鏈RNA片段（ S1到S12）的。S1，S2 ，S3， S7和S8的編碼結(jié)構(gòu)蛋白，而S4，S6

3、 ， S9，S10 ， S11和S12編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（ Xu等，1998; Zhang等， 1997） 。近日， Pns6被鑒定為一種病毒移動(dòng)蛋白和Pns10作為RNA沉默抑制RDV的（ Li等人， 2004年，曹等人， 2005） 。 P2蛋白被確定為互動(dòng)，體內(nèi)與在赤霉素的酶（GA）的生物合成途徑以及這一相互作用導(dǎo)致GA減退積累和對(duì)矮化表型表現(xiàn)出byRDV感染的水稻植物（ Zhu等，2005）。第八大段（ S8 ）編碼外層外殼蛋白（鈴木和菅原， 1991） 。 外殼蛋白介導(dǎo)的抗性（ CPMR ） ，一種策略是指病毒電阻通過(guò)在轉(zhuǎn)基因植物病毒外殼蛋白的表達(dá)介導(dǎo)的，是一個(gè)來(lái)源于病原體的抵抗力（ ;

4、威爾遜，1993 Lomonnossoff ， 1995）的例子。由于CP的轉(zhuǎn)基因煙草具有顯著抵抗的第一次報(bào)告煙草花葉病毒的感染（鮑威爾- Abel等，1986）， CPMR已被廣泛地應(yīng)用于一個(gè)廣闊植物品種和一些病毒成員表現(xiàn)出不同程度的成功的。大部分CPMR的例子都涉及病毒的單鏈RNA的基因組和雙子葉植物物種（格魯梅特，1995）。在水稻中，最重要的一個(gè)的情況下谷類植物為主要食物來(lái)源，為人類特別是對(duì)人的發(fā)展中國(guó)家，病毒外殼蛋白基因的抗病毒轉(zhuǎn)基因植物制作了防治水稻條紋葉枯病， tenuivirus的成員（ Hayakwa等， 1992） 。 RDV外層外殼蛋白的轉(zhuǎn)化被提及的報(bào)告Matsumura

5、等。沒(méi)有進(jìn)一步的分析（松村和田林， 1995） 。最近Sivamani等。 （ 1999）報(bào)道CP-介導(dǎo)的保護(hù)對(duì)水稻東格魯球狀病毒（ RTSV ）在轉(zhuǎn)基因水稻植株。之前我們已經(jīng)報(bào)道 水稻與S8的基因編碼的大米的外殼蛋白轉(zhuǎn)化矮縮病毒通過(guò)粒子轟擊（ Zheng等， 1997） 。在這里，我們提出在S8中的轉(zhuǎn)基因和抗RDV在T1的特性數(shù)據(jù)和T2代。材料和方法植物材料。轉(zhuǎn)基因水稻植株行T0-2表達(dá)RDV S8的基因 通過(guò)粒子轟擊（Zheng等，1997），并獲得自交得到的種子。 T1和T2代的苗在隨后的研究中使用。PCR分析和Southern雜交。總DNA進(jìn)行從葉中提取 轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的水稻植物的根據(jù)

6、默里組織和 湯普森（1980）。對(duì)于分離分析，聚合酶鏈反應(yīng)是 以闡明S8序列中的T1和T2子代的存在 原代轉(zhuǎn)基因水稻品系T0-2。用于PCR的引物和條件 人所描述的鄭等人一樣。 （1997）。對(duì)于南方的分析，基因組DNA用XhoI消化并用探針含有1.4kb的片段 S8編碼區(qū)所描述的鄭等人。 （1997）。在T1和T1的后代RDV外層外殼蛋白的Western blot分析?？?蛋白質(zhì)被同時(shí)從轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)化的植物中提取和 使用兔多克隆引發(fā)抗血清進(jìn)行Western印跡 RDV，所描述的鄭等人。 （1997）。病毒耐藥檢測(cè)。已被允許訪問(wèn)72小時(shí)葉蟬 到RDV感染的植物被用于接種。 1012天齡的稻

7、 苗接種單株3帶毒成蟲(chóng)，并保持在 騰籠換24小時(shí)的訪問(wèn)期間。葉蟬，然后取出，將植物 轉(zhuǎn)移到防蟲(chóng)籠和維護(hù)溫室。外觀 癥狀是經(jīng)過(guò)12-28天拿下。結(jié)果在S8基因T1和T1后代的分離分在我們以前的研究中，轉(zhuǎn)基因水稻植株T0-2表達(dá)RDV外層被毛 蛋白質(zhì)獲得與自交T1后代顯示出1:1的分離比 在S8轉(zhuǎn)基因（Zheng等，1997）。那么它的T1工廠，T1-1，一名被選為 產(chǎn)生T2后代，并進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。從T1-1 T2幼苗總DNA，通過(guò)PCR使用引物分析 具體到RDV S8基因的編碼區(qū)。 20人中，有30 T2苗木顯示 陽(yáng)性，說(shuō)明具有3:1（2分離比協(xié)議 試驗(yàn)），盡管1:1的 率被發(fā)現(xiàn)在T1代（Z

8、heng等，1997）。T1和T2后代，這是積極的PCR分析，進(jìn)一步進(jìn)行 Southern分析來(lái)檢測(cè)S8基因整合在T1和T2代。如 如圖1所示，所有的T 1（圖1A）和T2后代（圖1B）顯示出 同樣的集成模式為T0，表明S8基因T1的穩(wěn)定遺傳和 T2。圖。1。T1的（A）和T2（B）從轉(zhuǎn)基因水稻品系后代基因組DNA凝膠印跡分析 T0-2。從初級(jí)轉(zhuǎn)化T0-2（泳道T0）中分離基因組DNA，5種不同的T1 在后代（車道上1-4），T1轉(zhuǎn)化T1-1（泳道T1-1），4種不同的T2后代（泳道1-4 B）和非轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物（NC）分別用XhoI消化和雜交用 RDV S8基因的1.4kb的片段。分子量標(biāo)記

9、（以KB為單位）都在左側(cè)。 在S8基因在T1和T2代的表達(dá) 由T1和T2植物的葉中提取總蛋白經(jīng)受 西方墨點(diǎn)法使用抗血清提出對(duì)RDV。在S8編碼的產(chǎn)品 在所有包含在S8的轉(zhuǎn)基因（圖2）的T1和T2子代進(jìn)行檢測(cè)。 連同46kDa帶，S8的主要產(chǎn)物編碼的蛋白，42kDa蛋白 帶也被觀察。該頻帶被確定為一個(gè)翻譯后 該46kDa蛋白的裂解產(chǎn)物（Mao等人，1998）。圖。 2。Western印跡法檢測(cè)在T1（A）和T2（B）的后代RDV S8編碼產(chǎn)物的 從轉(zhuǎn)基因T0-2水稻品系。答：從初級(jí)提取的蛋白質(zhì)（每通道為15g） 轉(zhuǎn)化T0-2（泳道T0），T1子代（泳道1-4），未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株（NC）和 從RD

10、V感染水稻（PC）。從T1 B.提取的蛋白質(zhì)（每通道為15g）（泳道 T1-1），T 2子代（泳道1-4），未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株（NC）和從RDV感染的水稻 廠（PC）。病毒抗性測(cè)定在T1和T2代由于RDV由葉蟬感染水稻植株只有通過(guò)傳輸，飼喂RDV感染的帶毒植物葉蟬被用作載體RDV在接種病毒耐藥檢測(cè)。與空載體，轉(zhuǎn)基因水稻相同的品種為S8的轉(zhuǎn)基因植物，作為對(duì)照。 1012天舊的T1，T2和控制苗接種和癥狀進(jìn)行評(píng)分12-28接種后幾天。與對(duì)照植物中，T1和T2代轉(zhuǎn)基因相比植物表現(xiàn)出延遲的和較不嚴(yán)重的癥狀，和植物的數(shù)量表示疾病癥狀也減少了。病毒耐藥檢測(cè)接種28天后的結(jié)果詳列于表1 。這些數(shù)據(jù)表明，該百分

11、比植物示出在T1和T2轉(zhuǎn)基因植物中的疾病癥狀的是低于對(duì)照植物和統(tǒng)計(jì)學(xué)的，這種差異是顯著性（P <0.05）。這是表明，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)RDV外層外殼蛋白表現(xiàn)出對(duì)RDV感染和抗性性狀阻力適中水平已穩(wěn)定地從T1到T2代傳輸。 表1中。病毒耐藥檢測(cè)在T1和T2轉(zhuǎn)基因水稻植物呈現(xiàn)在接種植株總數(shù)疾病癥狀的數(shù)量。 A，B，C是不同的籠接種由帶毒葉蟬。討論我們?cè)诒狙芯恐?，產(chǎn)生抗病毒水稻品種的方法是 基于對(duì)病原體衍生的阻力的概念（PDR），其已被用于 許多報(bào)告通過(guò)對(duì)病毒衍生的表達(dá)來(lái)設(shè)計(jì)抗病毒 在轉(zhuǎn)基因植物（Baulcombe，1996）的基因或基因組的片段。在這項(xiàng)研究中， 來(lái)源于病原體的抗性最早是在水稻矮

12、縮病毒，成員報(bào)道 phytoreovirus。與此同時(shí)，我們證明了外殼蛋白介導(dǎo)的抗 病毒感染是適用于phytoreovirus的雙鏈RNA病毒。 病毒抗性試驗(yàn)的結(jié)果清楚地表明，有顯著水平 保護(hù)轉(zhuǎn)基因植物相比，與對(duì)照植物。盡管如此， 抗性程度的可變性存在。這是因?yàn)槊浇槔ハx(chóng) 用于接種，并在這類型的挑戰(zhàn)，病毒的劑量傳送到 由葉蟬不同的植物是可變的。此外，不同的生理 條件和CP在接種時(shí)的表達(dá)水平也可影響 病毒的抵抗力。這種變異是在病毒耐藥檢測(cè)也觀察 到CP轉(zhuǎn)基因水稻的水稻條紋病毒（RSV）（Hayakawa等人，1992），并在 阻力測(cè)定水稻東格魯球狀病毒CP基因植物（RTSV） （Sivamani等

13、人，1999），這兩種病毒是通過(guò)昆蟲(chóng)媒介和昆蟲(chóng)載體上發(fā)射被用于具有挑戰(zhàn)性。我們的研究結(jié)果表明，表達(dá)RDV CP基因在轉(zhuǎn)基因水稻 植物賦予阻力下對(duì)水稻矮縮病中等水平 溫室條件。和抗性性狀已被穩(wěn)定地傳送到 下一代。這些轉(zhuǎn)基因水稻抗性性狀的田間表現(xiàn) 需要的植物的轉(zhuǎn)基因水稻植物中的使用前要分析 今后的育種計(jì)劃水稻矮縮病的控制。致謝。我們要感謝T.大村博士的慷慨抗血清的禮物 對(duì)RDV P8。這項(xiàng)工作是由教育部（20020001038），以YL支持， 中國(guó)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（39870027），國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究（973合同編號(hào) 62000016204），中國(guó) - 加拿大生物技術(shù)和歐洲聯(lián)盟（合同編號(hào)ERB C

14、II*-CT94-0088）的3x3合作項(xiàng)目。參考文獻(xiàn)Baucombe DC（1996）：病原體衍生于病毒的耐藥機(jī)制 轉(zhuǎn)基因植物。植物細(xì)胞8，1833年至1844年Boccardo G，米爾恩RG（1984）：植物呼腸孤病毒組。植物的CM/ AAB說(shuō)明 病毒，294號(hào)XS，周平，張猛，朱順豐，鐘XH，蕭Q，丁乙，李瑛（2005年）： 從植物雙鏈鑒定的RNA沉默抑制的 RNA病毒。病毒學(xué)雜志。 79，13018-13027格魯梅特R（1995）：作物抗病毒基因工程。 HortScience30， 早川，朱Y，伊藤K，木村Y，木村Y，伊澤T，島本須K，鳥(niǎo)山明S （1992）：基因工程水稻抗水稻條紋葉枯病，一個(gè) 昆蟲(chóng)傳播的病毒。 PROC。 NATL。 ACAD。科學(xué)。美國(guó)89，9865-98