第三章基因工程載體PPT課件

1、第三章第三章 基因工程載體基因工程載體第一節(jié)第一節(jié) 克隆載體克隆載體第二節(jié)第二節(jié) 表達(dá)載體表達(dá)載體第三節(jié)第三節(jié) 特殊用途載體特殊用途載體DNADNA： 1 1）獨(dú)立的一個(gè)包括啟動(dòng)子（）獨(dú)立的一個(gè)包括啟動(dòng)子（promoter)promoter)、編碼區(qū)（、編碼區(qū)（encoding encoding region)region)和終止子（和終止子（terminator)terminator)的基因，的基因，or or 組成基因的某組成基因的某個(gè)元件，個(gè)元件，一般是不可以進(jìn)入受體細(xì)胞一般是不可以進(jìn)入受體細(xì)胞的；的； 2 2）采用理化方法進(jìn)入細(xì)胞后，也不容易在受體細(xì)胞內(nèi)維持。）采用理化方法進(jìn)入細(xì)胞后，

2、也不容易在受體細(xì)胞內(nèi)維持。所以，所以，通過不同途徑能將承載的外源通過不同途徑能將承載的外源DNADNA片段帶入受體細(xì)胞，片段帶入受體細(xì)胞，并在其中得以維持的并在其中得以維持的DNADNA分子稱為基因工程載體。分子稱為基因工程載體。 載體 （Vectors）定義：在基因工程操作中，定義：在基因工程操作中，把能攜帶外把能攜帶外源源DNADNA進(jìn)入受體細(xì)胞的進(jìn)入受體細(xì)胞的DNADNA分子叫載體分子叫載體。 載體 （Vectors）u運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 u為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 u為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件為外源

3、基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件 載體的功能載體的功能 目的基因能否有效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并在其中維持高效表達(dá)，目的基因能否有效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并在其中維持高效表達(dá)，在很大程度上決定于載體在很大程度上決定于載體 。 （1 1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制，oriori。 （3 3）多克隆位點(diǎn)：多克隆位點(diǎn)：外源基因插入的外源基因插入的單一單一限制酶位點(diǎn)。限制酶位點(diǎn)。 基因工程對(duì)載體的要求基因工程對(duì)載體的要求（7 7）具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移。 （2 2）有選擇性標(biāo)記有選擇性標(biāo)記 Amp Ampr r、TetTetr r、KanKanr r等等。（4 4

4、）分子量小，分子量小，可容納較大的外源基因片段。可容納較大的外源基因片段。（5 5）拷貝數(shù)多，拷貝數(shù)多，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。（6 6）具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性。具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性。pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)大腸桿菌質(zhì)粒載體大腸桿菌質(zhì)粒載體 pBR322pBR322結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖 復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn) 遺傳標(biāo)記基因遺傳標(biāo)記基因克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn) 載體載體 的種類的種類 按功能分類

5、按功能分類 克隆載體克隆一個(gè)基因或克隆載體克隆一個(gè)基因或DNADNA片斷片斷 表達(dá)載體用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)表達(dá)載體用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá) 整合載體把一個(gè)基因插入到染色體組中整合載體把一個(gè)基因插入到染色體組中 按來(lái)源分類按來(lái)源分類 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 噬菌體載體噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體 人工染色體載體人工染色體載體 載體的種類和特征質(zhì)粒質(zhì)粒*受體細(xì)胞受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)插入片斷插入片斷舉例舉例 E.coli環(huán)狀環(huán)狀 8kbpUC18/19 , T-載體等載體等 噬菌體噬菌體E.coli線狀線狀9 - 24kb EMBL系列，系列， gt系列系列絲狀噬菌體及噬菌粒絲狀噬菌體及噬菌粒E.co

6、li環(huán)狀環(huán)狀 10 kbM13mp系列系列粘粒載體粘粒載體E.coli環(huán)狀環(huán)狀35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome)E.coli環(huán)狀環(huán)狀300 kb Pel oBAC系列系列YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞線性染色體線性染色體 100 - 2000 kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳類細(xì)胞哺乳類細(xì)胞線性染色體線性染色體 1000 kb病毒載體病毒載體動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀環(huán)狀

7、SV40 載體，昆蟲載體，昆蟲 桿狀病毒載體桿狀病毒載體穿梭載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞 和細(xì)菌和細(xì)菌環(huán)狀環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，質(zhì)粒，PBV, Ti質(zhì)粒質(zhì)粒第一節(jié)第一節(jié) 克隆載體克隆載體1. 1. 質(zhì)粒載體（質(zhì)粒載體（plasimid vectorsplasimid vectors）2. 2. 噬菌體載體（噬菌體載體（phage vectorsphage vectors）3. 3. 柯斯質(zhì)粒載體（柯斯質(zhì)粒載體（cosmid vectorscosmid vectors） 4. 4. 人工染色體載體（人工染色體載體（B/Y/HACB/Y/HAC） 質(zhì)粒質(zhì)粒是是一種廣泛從在于細(xì)菌細(xì)胞中一種廣泛從在于細(xì)

8、菌細(xì)胞中染色體以外的染色體以外的能自主能自主的復(fù)制的復(fù)制的裸露的的裸露的環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNADNA分子，比病毒更簡(jiǎn)單。分子，比病毒更簡(jiǎn)單。并不是寄主生長(zhǎng)所必需的，但可以賦予寄主某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力（帶有抗性基因等） 。 質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒的生物學(xué)特性（1）質(zhì)粒的概念）質(zhì)粒的概念 差異很大，最小的只有差異很大，最小的只有1kb1kb, ,只能編碼中等大小只能編碼中等大小的的2-32-3種蛋白質(zhì)分子，最大的達(dá)到種蛋白質(zhì)分子，最大的達(dá)到200kb200kb。 質(zhì)粒的生存在寄主細(xì)胞中質(zhì)粒的生存在寄主細(xì)胞中“友好友好”地地“借居借居”，它可以賦予寄主一些非染色體控制的遺傳性狀，以它可以

9、賦予寄主一些非染色體控制的遺傳性狀，以利于寄主的生存利于寄主的生存。比如，對(duì)抗菌素的抗性，對(duì)重金。比如，對(duì)抗菌素的抗性，對(duì)重金屬的抗性等。屬的抗性等。（2）質(zhì)粒的大?。┵|(zhì)粒的大?。?）質(zhì)粒的生存）質(zhì)粒的生存 質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNADNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制自主復(fù)制。質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA上的上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系。決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系。根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為兩大復(fù)制類型：分為兩大復(fù)制類型： 嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（stringent

10、plasmidstringent plasmid） ( (拷拷貝數(shù)少，為貝數(shù)少，為1-51-5個(gè)個(gè)) ) 松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（relaxedrelaxed） ( (拷貝數(shù)多，可拷貝數(shù)多，可達(dá)達(dá)10-20010-200個(gè)拷貝個(gè)拷貝) ) （4）質(zhì)粒的自主復(fù)制性）質(zhì)粒的自主復(fù)制性因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。 兩個(gè)質(zhì)粒在兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱共存的現(xiàn)象稱質(zhì)質(zhì)粒的不相容性。粒的不相容性。具有不相容性的具有不相容性的質(zhì)粒組成的群體質(zhì)粒組成的群體稱為稱為不相容群不相容群，一般具有一般具有相同的相同的復(fù)制子復(fù)制子

11、。 （5）質(zhì)粒的不相容性）質(zhì)粒的不相容性（6）質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性）質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性基因工程一般只能利用非接接合型質(zhì)粒，保證分子操作過基因工程一般只能利用非接接合型質(zhì)粒，保證分子操作過程中質(zhì)粒在細(xì)胞中的穩(wěn)定性。程中質(zhì)粒在細(xì)胞中的穩(wěn)定性。Tra protein from conjugative plasmidbom siteMob genemob mRNAMob proteinopen recipient cellhelper plasmid 即即mobmob基因的產(chǎn)物可打開非接合質(zhì)粒的基因的產(chǎn)物可打開非接合質(zhì)粒的bom bom 位點(diǎn)位點(diǎn)(oriT(oriT位點(diǎn)位點(diǎn)) )，借助接合質(zhì)粒借助接合質(zhì)粒tra

12、tra基因基因的產(chǎn)物，使非接合質(zhì)粒被動(dòng)遷移到受體細(xì)的產(chǎn)物，使非接合質(zhì)粒被動(dòng)遷移到受體細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為胞中，這種現(xiàn)象稱為遷移作用遷移作用(mobilization)(mobilization)。大腸桿菌接合（大腸桿菌接合（conjunctionconjunction）質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的的tratra基因基因E.ColiE.Coli產(chǎn)生菌毛產(chǎn)生菌毛宿主與受體細(xì)胞結(jié)合宿主與受體細(xì)胞結(jié)合遺傳物在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移遺傳物在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移（指令）（指令）（遷移）（遷移）（7）攜帶特殊的遺傳標(biāo)記）攜帶特殊的遺傳標(biāo)記 野生型的質(zhì)粒野生型的質(zhì)粒DNADNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基

13、因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：附加性狀，包括： 物質(zhì)抗性物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物有機(jī)物 物質(zhì)合成物質(zhì)合成 抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿 這些標(biāo)記基因?qū)@些標(biāo)記基因?qū)NADNA重組分子的篩選具有重要意義重組分子的篩選具有重要意義 定義定義: :在基因工程中使用與選擇重組體在基因工程中使用與選擇重組體DNADNA轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因細(xì)胞的基因 1. 1. 指示外源指示外源DNADNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞

14、 2. 2. 指示外源指示外源DNADNA分子是否插入載體分子形成了重組分子是否插入載體分子形成了重組子子 遺傳標(biāo)記基因遺傳標(biāo)記基因標(biāo)記基因的作用標(biāo)記基因的作用1. 1. 抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） a.a. 抗生素抗性基因抗生素抗性基因: Ap: Apr r ，TcTcr r ，CmCmr r，KanKanr r，G418G418r r，HygHygr r ，NeoNeor r b. b. 重金屬抗性基因重金屬抗性基因: Cu: Cur r ，ZnZnr r ，CdCdr r c. c. 代謝抗性基因代謝抗性基因: TK: TK，抗除草劑基因，抗

15、除草劑基因 2. 2. 營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營(yíng)養(yǎng)物合成酶主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營(yíng)養(yǎng)物合成酶類的基因，類的基因， 這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1TRP1，URA3URA3，LEU2LEU2，HIS4HIS4等。等。 3. 3. 生化標(biāo)記基因生化標(biāo)記基因 其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)，如其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)，如lacZlacZ， GUSGUS，CAT CAT 4. 4. 噬菌斑噬菌斑標(biāo)記基因的種類標(biāo)記基因的種類 質(zhì)粒的存在形式質(zhì)粒

16、的存在形式有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種。雙螺旋三種。雙螺旋共價(jià)閉合雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）環(huán)（超螺旋）開環(huán)雙螺旋開環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口）（一個(gè)裂口）線狀雙螺旋線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口）（兩個(gè)裂口）（8）質(zhì)粒的存在形式）質(zhì)粒的存在形式質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率 同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：泳遷移率不同：scDNAscDNA最快、最快、l DNAl DNA次之、次之、ocDNAocDNA最慢。最慢。SCSCOCOCL L天然質(zhì)粒的局限性天然質(zhì)粒的局限性 天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)

17、低、天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建人工構(gòu)建。人工組建的質(zhì)粒人工組建的質(zhì)粒 人工組建的質(zhì)粒的第一個(gè)字母是質(zhì)粒英文名字人工組建的質(zhì)粒的第一個(gè)字母是質(zhì)粒英文名字（plasmidplasmid）的第一個(gè)字符）的第一個(gè)字符p p，用小寫。，用小寫。p p后有后有2 2個(gè)字母是大個(gè)字母是大寫，表示質(zhì)粒的作者和實(shí)驗(yàn)室名稱，再其后為質(zhì)粒的編號(hào)。寫，表示質(zhì)粒的作者和實(shí)驗(yàn)室名稱，再其后為質(zhì)粒的編

18、號(hào)。如如pBR322pBR322，字母，字母p p代表質(zhì)粒，代表質(zhì)粒，BRBR是構(gòu)建該質(zhì)粒的研究人員是構(gòu)建該質(zhì)粒的研究人員的姓名，的姓名，322322代表代表構(gòu)建的一系質(zhì)粒的編號(hào)。構(gòu)建的一系質(zhì)粒的編號(hào)。 質(zhì)粒載體的命名原則質(zhì)粒載體的命名原則 第一階段第一階段（19771977年前）天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的年前）天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如利用，如pSC101, ColE1, pCR, pBR313pSC101, ColE1, pCR, pBR313和和pBR322pBR322。 第二階段第二階段增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），增大載體容量（降低載體長(zhǎng)度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如建立多

19、克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUCpUC系列系列載體。載體。 第三階段第三階段完善載體功能以滿足基因工程克隆完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如中的不同要求，如M13mpM13mp系列載體，含系列載體，含T3T3，T7T7，sp6sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。質(zhì)粒載體的發(fā)展概況質(zhì)粒載體的發(fā)展概況質(zhì)粒載體的構(gòu)建質(zhì)粒載體的構(gòu)建5 5. .根據(jù)基因工程的特殊要求根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件加裝特殊的基因元件7 7、達(dá)到預(yù)期目的前提下，構(gòu)建過程應(yīng)力求簡(jiǎn)單、達(dá)到預(yù)期目的前提下，構(gòu)建過程應(yīng)力求簡(jiǎn)單質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體：作為基因工

20、程載體，質(zhì)粒至少應(yīng)該具備作為基因工程載體，質(zhì)粒至少應(yīng)該具備復(fù)制的起復(fù)制的起始區(qū)始區(qū)、選擇標(biāo)記基因區(qū)選擇標(biāo)記基因區(qū)、多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)等部分。等部分。 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類： 高拷貝質(zhì)粒高拷貝質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù)拷貝數(shù)1000-3000 1000-3000 擴(kuò)增基因擴(kuò)增基因 低拷貝質(zhì)粒低拷貝質(zhì)粒 來(lái)自來(lái)自pSC101 pSC101 拷貝數(shù)小于拷貝數(shù)小于10 10 表達(dá)某些毒性基因表達(dá)某些毒性基因 溫敏質(zhì)粒溫敏質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)

21、測(cè)序質(zhì)粒測(cè)序質(zhì)粒 含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker polylinker 整合質(zhì)粒整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn) 便于外源基因的整合便于外源基因的整合 穿梭質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒 裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子 便于基因克隆便于基因克隆 表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件 探針質(zhì)粒探針質(zhì)粒 裝有報(bào)告基因裝有報(bào)告基因 便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選 質(zhì)粒載體的分類質(zhì)粒載體的分類（1 1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體）高

22、拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1ColE1、pMB1pMB1、pMB9pMB9 松弛型質(zhì)粒。松弛型質(zhì)粒。具有低分子量、高拷貝數(shù)的優(yōu)點(diǎn)。具有低分子量、高拷貝數(shù)的優(yōu)點(diǎn)。具有氯霉素?cái)U(kuò)增效應(yīng)：每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)具有氯霉素?cái)U(kuò)增效應(yīng)：每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)1000100030003000個(gè)！個(gè)！用途：用途：適合大量增殖克隆基因適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。量的基因產(chǎn)物。質(zhì)粒載體的分類質(zhì)粒載體的分類（2 2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體由由pSC101pSC101派生來(lái)的載體。派生來(lái)的載體。特點(diǎn)是拷貝數(shù)低。特點(diǎn)是拷貝數(shù)低。pLG338pLG338、pLG339pLG339等等適合

23、于適合于克隆含量過高克隆含量過高對(duì)寄主代謝有害的基因。對(duì)寄主代謝有害的基因。減少蛋白質(zhì)產(chǎn)物對(duì)寄主細(xì)胞的毒害。減少蛋白質(zhì)產(chǎn)物對(duì)寄主細(xì)胞的毒害。（3 3）溫控的質(zhì)粒載體）溫控的質(zhì)粒載體一些低拷貝基因是溫度敏感型，一些低拷貝基因是溫度敏感型，如如pBEU1pBEU1、pBEU2pBEU2溫度低（溫度低（ 40 40 o oC C），），拷貝數(shù)很快增加到拷貝數(shù)很快增加到 10001000個(gè)。個(gè)。（4 4） 插入失活型質(zhì)粒載體插入失活型質(zhì)粒載體 載體的克隆位點(diǎn)位于其載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。外源因內(nèi)部。外源DNADNA片段插入會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)基因片段插入會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)

24、基因（如（如tettetr r、ampampr r、cmcmr r等）失活。等）失活。如如pDF41pDF41、pDF42pDF42、pBR322pBR322?？股乜剐钥股乜剐酝庠赐庠碊NADNA無(wú)抗生素抗性無(wú)抗生素抗性（5 5）正選擇的質(zhì)粒載體正選擇的質(zhì)粒載體 經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體天然質(zhì)粒，屬天然質(zhì)粒，屬嚴(yán)緊型低拷貝嚴(yán)緊型低拷貝質(zhì)粒。質(zhì)粒。9.09 kb9.09 kb。四環(huán)。四環(huán)素抗性素抗性TetTetr r。ColE1ColE1天然質(zhì)粒，天然質(zhì)粒，屬松弛型、高拷貝質(zhì)粒屬松弛型、高拷貝質(zhì)粒，6.66.6K Kb b。有氯霉素?cái)U(kuò)增效應(yīng)，每個(gè)細(xì)胞有氯霉素?cái)U(kuò)增效應(yīng)，每個(gè)

25、細(xì)胞1000-30001000-3000拷貝拷貝選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記大腸桿菌素（大腸桿菌素（colicincolicin）E1E1和對(duì)和對(duì)E1E1免疫的免疫的基因（基因（immE1immE1）pcolicinE1能殺死不含能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，質(zhì)粒的菌，形成噬菌斑。形成噬菌斑。 colicin E1colicin E1基因的結(jié)構(gòu)基因的結(jié)構(gòu)ceaimmkil結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因 殺死不含有殺死不含有ColE1ColE1細(xì)菌的原因細(xì)菌的原因cea + kilcea + kil基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物 不被其他細(xì)菌的不被其他細(xì)菌的colicin E1colicin E1所殺死

26、的原因所殺死的原因immimm基因基因EcoR IEcoR I位于位于E1E1內(nèi)部，插入外源內(nèi)部，插入外源DNADNA導(dǎo)致導(dǎo)致E1E1失失活，使受體菌不能合成活，使受體菌不能合成E E（ColE1ColE1- -），但仍），但仍表現(xiàn)出對(duì)表現(xiàn)出對(duì)E1E1免疫型（免疫型（ImmE1ImmE1+ +）。）。EcoR I 唯一的克隆位點(diǎn)Colicin E1外源外源DNADNA無(wú)無(wú)Colicinl用對(duì)外源用對(duì)外源colicin E1colicin E1的免疫性和自身不能的免疫性和自身不能合成合成colicin E1colicin E1作選擇，操作非常繁雜。作選擇，操作非常繁雜。pBR322pBR322：

27、p:p:質(zhì)粒；質(zhì)粒；BRBR：質(zhì)粒兩位主要質(zhì)粒兩位主要構(gòu)建者姓氏的第一個(gè)構(gòu)建者姓氏的第一個(gè)字母；字母；322322：實(shí)驗(yàn)編號(hào)實(shí)驗(yàn)編號(hào)人工構(gòu)建載體人工構(gòu)建載體三個(gè)親本質(zhì)粒：三個(gè)親本質(zhì)粒：pMB1pMB1: :出發(fā)質(zhì)粒出發(fā)質(zhì)粒(ColE1)(ColE1)pSF2124: AmppSF2124: Ampr rpSC101: TetpSC101: Tetr rpSF2124pMB1pSC101氨芐青霉素和四環(huán)素抗性氨芐青霉素和四環(huán)素抗性24個(gè)單一克隆位點(diǎn)。個(gè)單一克隆位點(diǎn)。9 9個(gè)導(dǎo)致個(gè)導(dǎo)致TetTetr r基因失活基因失活3 3個(gè)會(huì)導(dǎo)致個(gè)會(huì)導(dǎo)致AmpAmpr r基因失活基因失活pBR322pBR322

28、的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn) 雙抗生素抗性選擇標(biāo)記雙抗生素抗性選擇標(biāo)記 抗生素抗性基因的插入失活效應(yīng)是檢測(cè)重抗生素抗性基因的插入失活效應(yīng)是檢測(cè)重組體質(zhì)粒的有效方法，組體質(zhì)粒的有效方法，分兩次先后選擇：分兩次先后選擇：沒有獲得載體的寄主細(xì)胞沒有獲得載體的寄主細(xì)胞 在在AmpAmp或或TetTet中中都都死亡。死亡。獲得獲得重組載體重組載體的寄主細(xì)胞的寄主細(xì)胞 在在AmpAmp或或TetTet其中之一其中之一中死亡。中死亡。重 組 DNAAmprTcs提 取 DNA 電 泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs轉(zhuǎn) 化 無(wú) 菌 落陽(yáng) 性 菌 落篩 選 重 組 子2)DNA重 組無(wú) DN

29、A插 入有 DNA插 入外 源 DNA1)限 制 酶 切pBR322pBR322重組克隆的篩選重組克隆的篩選 重組克隆的重組克隆的 “插入失活插入失活”篩選方法篩選方法 pBR322pBR322插入在插入在TetTetr r中，基因型為中，基因型為TetTets s 、AmpAmpr r在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)；上不生長(zhǎng)； pBR322pBR322插入在插入在AmpAmpr r中，基因型為中，基因型為TetTetr r 、AmpAmps s、在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，在含有四環(huán)素培養(yǎng)在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基

30、上不生長(zhǎng)，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基可生長(zhǎng)；基可生長(zhǎng)； 而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長(zhǎng)的是非重組型。這種而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長(zhǎng)的是非重組型。這種在一個(gè)基因位點(diǎn)中插入外源在一個(gè)基因位點(diǎn)中插入外源DNADNA片段，從而使該基因活性片段，從而使該基因活性喪失的現(xiàn)象叫喪失的現(xiàn)象叫插入失活。插入失活。 氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可 10003000cop10003000copiesies 安全安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mobmob（mobilizationmobilization）。不能）。不能通過接合轉(zhuǎn)移。通過接合轉(zhuǎn)移。 高拷貝數(shù) 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大

31、長(zhǎng)度長(zhǎng)度4363bp4363bp，易于純化，可以攜帶，易于純化，可以攜帶6-8Kb6-8Kb的外源的外源DNADNA片段。片段。具有較多的單一酶切位點(diǎn)（具有較多的單一酶切位點(diǎn)（2424種）種）保留了轉(zhuǎn)移蛋白（保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mobmob）的作用位點(diǎn)。）的作用位點(diǎn)。pBR322的缺點(diǎn)能夠被能夠被ColKColK質(zhì)粒編碼的質(zhì)粒編碼的mobmob蛋白識(shí)別，如蛋白識(shí)別，如果再有果再有F F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！ 刪除刪除mobmob識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別位點(diǎn)（如質(zhì)粒（如質(zhì)粒pBR327pBR327、pAT153pAT153等）。等）。pAT153pAT153：從從pBR322pBR

32、322上切去上切去HaeIIHaeII片斷，既除去了片斷，既除去了mobmob識(shí)別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。識(shí)別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。PBR322的改進(jìn)pBR325pBR325：在在pBR322pBR322位點(diǎn)上接入一段來(lái)自噬菌體位點(diǎn)上接入一段來(lái)自噬菌體PICmPICm的的HaeIIHaeII酶切片斷（帶有氯霉素酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因抗性基因cmlcmlr r）。）。 cmlcmlr r上也帶一個(gè)上也帶一個(gè)EcoRIEcoRI位點(diǎn)。位點(diǎn)。使使EcoRI EcoRI 也成為插入失活型位點(diǎn)。也成為插入失活型位點(diǎn)。 改造EcoR I 位點(diǎn) pUC pUC系列載體系列載體 在在pBR322p

33、BR322的基礎(chǔ)上改造而成。的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。屬正選擇載體。pUC7pUC7、pUC8pUC8、pUC9pUC9、pUC10pUC10、pUC11pUC11、pUC18pUC18、pUC19pUC19（1 1）元件來(lái)源）元件來(lái)源c. c. laczlacz基因：大腸桿菌基因：大腸桿菌laclac操縱子操縱子DNADNA區(qū)段，編碼區(qū)段，編碼-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 - -肽鏈，是肽鏈，是LacZLacZ氨氨基端的一個(gè)片段基端的一個(gè)片段. .載體用載體用于可編碼半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。于可編碼半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。d. MCS d. MCS 多克隆位點(diǎn)。多克隆

34、位點(diǎn)。a .oria .ori來(lái)自來(lái)自pBR322pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)b. b. 標(biāo)記基因（標(biāo)記基因（amprampr）:pBR322:pBR322的的AmpAmpr r基因基因 （2 2）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn) 具有具有MCSMCS（多克隆位點(diǎn)）區(qū)段：位于（多克隆位點(diǎn)）區(qū)段：位于lacZlacZ基因的基因的55端。端。1010個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，但它不破個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，但它不破壞該基因功能。壞該基因功能。 IPTGIPTG：異丙基異丙基-D-D-硫代半乳糖苷，乳糖硫代半乳糖苷，乳糖類似物，又稱為類似物，又稱為安慰誘導(dǎo)物安慰誘導(dǎo)物，可代替，可代替乳糖乳糖誘誘導(dǎo)乳

35、糖操縱子結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，即可誘導(dǎo)導(dǎo)乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，即可誘導(dǎo)laczlacz所編碼的半乳糖苷酶氨基末端片段所編碼的半乳糖苷酶氨基末端片段（肽）肽）的合成。的合成。 x-galx-gal：5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖半乳糖苷，為苷，為生色底物，生色底物，半乳糖苷酶半乳糖苷酶+ x-gal+ x-gal 藍(lán)色藍(lán)色-互補(bǔ)互補(bǔ)：pUCpUC類載體帶有類載體帶有l(wèi)aczlacz基因，基因，編碼半乳編碼半乳糖苷酶氨基端片段（糖苷酶氨基端片段（-肽），肽），此片段與宿主細(xì)胞所此片段與宿主細(xì)胞所編碼的編碼的羧基端半乳糖苷酶羧基端半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)，形成有實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)

36、互補(bǔ)，形成有功能的半乳糖苷酶，功能的半乳糖苷酶，稱稱-互補(bǔ)互補(bǔ)。-肽，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生半乳糖苷酶的羧基端片肽，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生半乳糖苷酶的羧基端片段。兩種片段形成有功能的半乳糖苷酶，從而使段。兩種片段形成有功能的半乳糖苷酶，從而使x xgalgal水解，產(chǎn)生水解，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)藍(lán)色物質(zhì)，使，使非重組菌落呈現(xiàn)藍(lán)非重組菌落呈現(xiàn)藍(lán)色色。-肽，肽，互補(bǔ)顯色反應(yīng)互補(bǔ)顯色反應(yīng) PUCPUC載體的優(yōu)點(diǎn)：載體的優(yōu)點(diǎn)： a a 具有具有更小的相對(duì)分子質(zhì)量更小的相對(duì)分子質(zhì)量和更和更高的拷貝數(shù)高的拷貝數(shù)，平均每個(gè)細(xì)胞可達(dá)平均每個(gè)細(xì)胞可達(dá)500-700500-700個(gè)拷貝個(gè)拷貝b b 具有具有MCSMCS片段片段，可把具有兩種不同粘性末，可把具有兩種不同粘性末端的外源端的外源DNADNA片段直接克隆到片段直接克隆到pUCpUC類載體上。類載體上。c c 可以用可以用組織化學(xué)方法組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體