發(fā)酵法制γ癸內(nèi)酯

1、發(fā)酵法制-癸內(nèi)酯 -第五期大學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃（srtp） 內(nèi)容：1.-癸內(nèi)酯 1.1 什么是-癸內(nèi)酯 1.2 -癸內(nèi)酯的制備方法 1.3 -癸內(nèi)酯的研究現(xiàn)狀2.發(fā)酵法制-癸內(nèi)酯 2.1 實(shí)驗(yàn)原理 2.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器 2.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程及方法 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.5 數(shù)據(jù)分析與討論3.結(jié)論及感想1. -癸內(nèi)酯 1.1 什么是-癸內(nèi)酯 ？v含有五元內(nèi)酯環(huán)的十碳化合物v分子量：170.25；分子式： ；相對(duì)密度：0946；折光指數(shù)n：1452；沸點(diǎn)130135 5mmhg；閃點(diǎn)158 v性質(zhì)：無(wú)色淡黃色的略微粘稠的液體，不溶于水，可溶于乙醇、油脂v天然存在于桃子、草莓、椰子、芒果、杏、啤酒

2、、朗姆酒 ,也存在于乳制品的風(fēng)味物質(zhì)中 ,已在 120多種食物的香氣成分中發(fā)現(xiàn)了這種化合物v-癸內(nèi)酯具有強(qiáng)烈的果香和奶油香氣,稀釋時(shí)有桃子香氣 10182c h o1.2-癸內(nèi)酯的制備方法：v微生物發(fā)酵法：解脂假絲酵母菌v化學(xué)合成方法：由烯烴作原料1.3- 癸內(nèi)酯的現(xiàn)狀癸內(nèi)酯的現(xiàn)狀 ： 內(nèi)酯類(lèi)香料是香料家族中成員最少的一類(lèi)，而且在自然界中存在很少，內(nèi)酯類(lèi)香料的香氣一般較為高雅，適宜調(diào)配各種香精。內(nèi)酯類(lèi)與酯類(lèi)在香氣特征上有相似之處，即均具有突出的果香香氣，廣泛用于配制食用香精和日用香精，并用作合成香料、藥物和農(nóng)藥的中間體以及聚合物和共聚物用溶劑等。 2.發(fā)酵法制-癸內(nèi)酯 2.1實(shí)驗(yàn)原理：蓖麻油酸

3、甲酯合成 - 癸內(nèi)酯： 解脂假絲酵母菌 （yarrowia lipolytica as2.1405），對(duì)于甘油酯和烷烴類(lèi)物質(zhì)有很強(qiáng)的代謝能力，是工業(yè)上應(yīng)用較為廣泛的一種菌種。蓖麻油來(lái)源豐富，且價(jià)格低廉，蓖麻油中含有的大量蓖麻油酸(順式 - 12- 羥基 - 十八碳 - 9- 烯酸)是 - 癸內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化前體，在轉(zhuǎn)化過(guò)程中 r()- 蓖麻油酸的手性中心傳遞到 - 癸內(nèi)酯上，且蓖麻油同時(shí)也可作為微生物生長(zhǎng)的碳源，是生物法制備天然香料- 癸內(nèi)酯的理想原料。通過(guò)改進(jìn)發(fā)酵工藝，控制代謝途徑等手段來(lái)提高 yarrowia lipolytica as2.1405代謝蓖麻油生物合成內(nèi)酯的效率，使 - 癸內(nèi)酯的發(fā)

4、酵制備最終達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求，對(duì)于我國(guó)天然香料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著巨大的推動(dòng)作用。2.2實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器：v實(shí)驗(yàn)用菌株：解脂假絲酵母（yarrowia lipolytica）v主要實(shí)驗(yàn)試劑：-癸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品、酵母膏、蛋白胨、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、磷酸氫二鈉、吐溫80、葡萄糖、蓖麻油v主要實(shí)驗(yàn)儀器：無(wú)菌操作臺(tái)、高壓鍋、氣象色譜儀、阿貝折射儀、hyg加回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速藥瓶柜、離心機(jī)實(shí)驗(yàn)中所需培養(yǎng)基的配制：種子培養(yǎng)基：v葡萄糖 15.00g/lv蛋白胨 2.50 g/lv磷酸二氫鉀 0.50 g/lvmgso4.7h2o 2.40g/lv磷酸氫二鈉 1.20g/lv吐溫80 4.00 g/lv酵母膏

5、2.50 g/l發(fā)酵培養(yǎng)基：v葡萄糖 15.00g/lv蛋白胨 2.50 g/lv磷酸二氫鉀 0.50 g/lvmgso4.7h2o 2.40g/lv磷酸氫二鈉 1.20g/lv吐溫80 4.00 g/lv蓖麻油 50.00 g/lv酵母膏 2.50 g/l2.3實(shí)驗(yàn)過(guò)程及方法：.菌種培養(yǎng)：(1).配制培養(yǎng)基：v配置菌種培養(yǎng)基500ml，ph 調(diào)至6.5。v將菌種培養(yǎng)基500ml分裝于三個(gè)150ml錐形瓶?jī)?nèi)，用棉花報(bào)紙封裝好，標(biāo)記，放置在高壓鍋內(nèi)滅菌（121 ，0.1mp,20 min）。v將滅菌后的種子培養(yǎng)基置于 30 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h ，以便查看是否滅菌完全。(2).培養(yǎng)過(guò)程：v24h

6、后，觀(guān)察培養(yǎng)基仍澄清、無(wú)渾濁現(xiàn)象，則未染菌，實(shí)驗(yàn)可繼續(xù)進(jìn)行。v在無(wú)菌操作臺(tái)上接種（準(zhǔn)備工作：先開(kāi)紫外線(xiàn)燈進(jìn)行殺菌，一段時(shí)間后，關(guān)上紫外燈進(jìn)行操作），用酒精進(jìn)行消毒，在酒精燈外焰無(wú)菌區(qū)以一接種環(huán)的菌量接種至每150ml種子培養(yǎng)基中,然后密封完全。v將接種后的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)在hyg- 回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜（25、175 r/min ）中，培養(yǎng)24 h。.發(fā)酵培養(yǎng)：（1）.配制培養(yǎng)基：v配置發(fā)酵培養(yǎng)基500ml，ph調(diào)制6.5。v將發(fā)酵培養(yǎng)基500ml分裝于三個(gè)150ml錐形瓶?jī)?nèi)，用棉花報(bào)紙封裝好，標(biāo)記，放置在高壓鍋內(nèi)滅菌（121 ，0.1mp,20 min）。v將滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基置于 30 培養(yǎng)

7、箱培養(yǎng) 24 h ，以便查看是否滅菌完全。（2）.培養(yǎng)過(guò)程：v24h后檢查結(jié)果，培養(yǎng)基表面出現(xiàn)白色斑狀物，說(shuō)明染菌（原因是瓶口沒(méi)封好，報(bào)紙有破損）照相同配方從新做一次，條件相同。v發(fā)酵培養(yǎng)基澄清，無(wú)渾濁現(xiàn)象，說(shuō)明未染菌可以繼續(xù)使用。同時(shí)觀(guān)察培養(yǎng)了24h后的種子培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)溶液較渾濁，說(shuō)明菌種生長(zhǎng)較好，有一定數(shù)量的菌種產(chǎn)生。v分別將號(hào)瓶?jī)?nèi)的菌種培養(yǎng)基各10ml加入到對(duì)應(yīng)號(hào)瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后放置hyg- 回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中培養(yǎng)48h（25，175r/min）。（3）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：v 48小時(shí)后觀(guān)察，發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵完全，表面無(wú)油狀物，蓖麻油發(fā)酵完全，培養(yǎng)基呈乳白色，渾濁，打開(kāi)后塞子后可以聞到明顯

8、的桃香味。 . -癸內(nèi)酯的提取:(兩種提取方法)(1).低速離心、萃取(4500r/min,10min)(2).高速離心、萃取(10000r/min,10min).測(cè)定方法：(1).氣象色譜檢測(cè)法 :v色譜柱(agilent 19091j-413 hp-5),毛細(xì)管色譜柱,柱長(zhǎng)15 m,內(nèi)徑0.25 mm； v載氣:氦氣,壓力 0.5 mpa； v柱箱溫度采用程序升溫:40 保持 1 min,以 6 / min 的速度升溫至160 ,保持 2 min,再以 8 /min 的速度升溫至230 并保持20 min;進(jìn)樣口溫度為 250;分流比10：1;進(jìn)樣體積1.0 l v檢測(cè)器:氫火焰離子檢測(cè)器

9、(fid),檢測(cè)器溫度 250 。(2).阿貝折射儀檢測(cè) ：v準(zhǔn)備工作：阿貝折射儀、擦鏡紙、擦鏡液（無(wú)水乙醇 乙醚=1 1各20ml）、標(biāo)品、樣品v相同條件下分別檢測(cè)第一次離心所得液的上層油層和下層液體及第二次離心所得液的油層和下層液體的折光率，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì) 2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果：v1.通過(guò)觀(guān)察最后的發(fā)酵液，聞其氣味，有很明顯的桃香味，與標(biāo)品-癸內(nèi)酯及相關(guān)文獻(xiàn)的描述的氣味相符，可初步判定發(fā)酵液中含有-癸內(nèi)酯。v2.氣相色譜檢測(cè)結(jié)果：檢測(cè)幾次均無(wú)結(jié)果，由于儀器陳舊，不易點(diǎn)火等客觀(guān)條件機(jī)器出現(xiàn)機(jī)械漂移，無(wú)法檢測(cè)；之后負(fù)責(zé)老師陳老師分析主要原因?yàn)閷W(xué)校的氣相色譜儀內(nèi)的毛細(xì)管柱（5%苯基的甲基聚硅氧烷）為非極性，而我們實(shí)驗(yàn)條件毛細(xì)管柱應(yīng)為極性，條件不一致，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)等客觀(guān)條件，故放棄該方案。v3.阿貝折射儀檢測(cè)結(jié)果：v標(biāo)品折光率n1=1.4510 v樣品： n2=1.4510 2.5數(shù)據(jù)分析與討論：v經(jīng)分離提純的-癸內(nèi)酯樣品的折光率與標(biāo)準(zhǔn)品的折光率相等，可以定性檢測(cè)到產(chǎn)品中含有-癸內(nèi)酯。3.結(jié)論及感想v本實(shí)驗(yàn)主要涉及的研究方法是酵母菌的斜面培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)，毛細(xì)管氣相色譜條件測(cè)- 癸內(nèi)酯的含量及阿貝折射儀檢測(cè)法定性分析等方法。v目前生產(chǎn)- 癸內(nèi)的方法有化學(xué)合成和生物合成兩種方法，本實(shí)