藥品生物檢定技術簡介ppt

1、1一、教學目標一、教學目標1.熟悉生物檢定技術的概念；熟悉生物檢定技術的概念；2.熟悉藥品質(zhì)量控制中常用的生物檢定熟悉藥品質(zhì)量控制中常用的生物檢定技術項目；技術項目；3.了解有關藥品生物檢定技術的原理了解有關藥品生物檢定技術的原理4.了解基本的操作技術。了解基本的操作技術。第八章第八章 2 藥品生物檢定技術藥品生物檢定技術-利用利用生物生物體體（微生物、細胞、離體組織或動物（微生物、細胞、離體組織或動物）對藥物的）對藥物的特定藥性、毒性作用特定藥性、毒性作用，來，來測定生物藥品的測定生物藥品的效價效價，檢查藥品中的，檢查藥品中的有害物質(zhì)有害物質(zhì)以及對制劑進行以及對制劑進行微生物限度微生物限度、

2、無菌檢查、無菌檢查的技術方法。的技術方法。3第一節(jié)第一節(jié) 無菌檢查無菌檢查 無菌檢查法無菌檢查法-檢查藥品檢查藥品 、醫(yī)療、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種器具、原料、輔料及其他品種是否是否無菌的無菌的一種方法。一種方法。 它是判斷供試品是否被微生物它是判斷供試品是否被微生物污染的一種方法。污染的一種方法。4一、技術要求：一、技術要求： 純凈度純凈度10000級級的局部純凈度的局部純凈度100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)。級單向流空氣區(qū)域內(nèi)。 全過程全過程無菌操作無菌操作。 單向空氣區(qū)、工作臺面、環(huán)境符單向空氣區(qū)、工作臺面、環(huán)境符合國家相關標準。合國家相關標準。5二二 . 培養(yǎng)基（培養(yǎng)基（medium）1

3、、培養(yǎng)基：、培養(yǎng)基：是供微生物、植物、動物組織生長是供微生物、植物、動物組織生長 和維持用的人工配制的養(yǎng)料（營養(yǎng)物質(zhì)）和維持用的人工配制的養(yǎng)料（營養(yǎng)物質(zhì)） 保存：保存： 保存于保存于2-25。 應應防潮、避光、陰涼防潮、避光、陰涼處保存處保存 碳水化合物、含碳水化合物、含n物、無機鹽物、無機鹽一般含有：一般含有： 維生素、維生素、h2o 、 抗菌素、色素抗菌素、色素 62、種類、種類硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基：需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基：（改良馬丁培養(yǎng)基：（真菌培養(yǎng)基真菌培養(yǎng)基）選擇性培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基 對氨基苯甲酸培養(yǎng)基（對氨基苯甲酸培養(yǎng)基（磺胺類

4、磺胺類） 聚山梨酯聚山梨酯80（非水溶性供試品）非水溶性供試品）營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基： 0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基：葡萄糖肉湯培養(yǎng)基：改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：7聚山梨酯聚山梨酯80（20，40，60，65，80，85）（吐溫（吐溫80） tween 80： 0 / w脂肪酸山梨坦脂肪酸山梨坦（20，40，60，65，80）（司（司 盤）盤） span ： w / 0 親水，親油基團的表示方法親水，親油基團的表示方法83、培養(yǎng)基的適用性檢查：、培養(yǎng)基的適用性檢查： 無菌檢查：無菌檢查： 隨機抽隨機抽 5瓶（或支）瓶（或支） 生長生長 14天，應

5、無菌天，應無菌 靈敏度靈敏度證明所加的菌種能夠在培養(yǎng)基證明所加的菌種能夠在培養(yǎng)基 中生長良好中生長良好 。三三. .方法驗證試驗：方法驗證試驗： 正式測定之前，需要正式測定之前，需要先測定供試品是先測定供試品是否具有抑細菌和抑真菌作用、避免假陰性否具有抑細菌和抑真菌作用、避免假陰性出現(xiàn)。出現(xiàn)。 9（四）無菌檢查法：（四）無菌檢查法：1、檢查數(shù)量：、檢查數(shù)量：指一次試驗所用供試品指一次試驗所用供試品最最 小包裝容器的數(shù)量。小包裝容器的數(shù)量。 例：例：2支（瓶）支（瓶）/2板板12粒粒 檢查量：檢查量：指一次試驗所用供試品的指一次試驗所用供試品的總量總量 （g 或或 ml） 例：例： 210=20

6、ml 240.25=6g2、對照試驗：、對照試驗： 陽性對照陽性對照 陰性對照陰性對照103、檢查方法：、檢查方法：a、薄膜過濾法：、薄膜過濾法：應用廣、準確性高，適用應用廣、準確性高，適用 于任何藥品、尤其是具有抑菌作用的于任何藥品、尤其是具有抑菌作用的。 b、直接接種法：、直接接種法：操作簡便，適用于無操作簡便，適用于無 抑菌抑菌 作用的供試品。作用的供試品。（2）培養(yǎng)觀察：培養(yǎng)）培養(yǎng)觀察：培養(yǎng)14天，無細菌生長。天，無細菌生長。11（五）結果判斷：（五）結果判斷： 1、若澄清，、若澄清， 無菌無菌 符合規(guī)定符合規(guī)定 雖渾濁，但無菌雖渾濁，但無菌 符合規(guī)定符合規(guī)定 2、任一管渾濁有菌生長、

7、任一管渾濁有菌生長 不符合不符合 3、若試驗無效、若試驗無效 重試重試12 第二節(jié)第二節(jié) 微生物限度檢查微生物限度檢查目的：目的： 判斷藥品被污染的程度，細菌數(shù)判斷藥品被污染的程度，細菌數(shù) 越多越多藥品受污染大藥品受污染大 安全性越差。安全性越差。1. 定義定義檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料，檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料，輔料受微生物污染程度的方法。輔料受微生物污染程度的方法。 項目包括：項目包括：細菌數(shù)、細菌數(shù)、 真菌數(shù)、真菌數(shù)、 酵母菌數(shù)、控制菌數(shù)。酵母菌數(shù)、控制菌數(shù)。 132、技術要求：、技術要求： 結凈度結凈度10000級級以下以下 區(qū)域、工作臺、環(huán)境符合國家標準區(qū)域、工作臺、環(huán)境符合國家標

8、準 加入輔料（表面活性劑、中和劑、滅活加入輔料（表面活性劑、中和劑、滅活劑）劑）- 證明其對微生物生長存活無影響證明其對微生物生長存活無影響 30-35（細菌）（細菌） 23-28 （真菌、酵母菌）（真菌、酵母菌） 35-37 （控制菌）（控制菌）結果報告以結果報告以1g、1ml、10g、10ml、10 cm2143、檢驗量：、檢驗量：一次試驗所用供試品的量一次試驗所用供試品的量 （g、ml、cm2） 一般供試品為：一般供試品為：10g、10ml。 化學膜劑：化學膜劑：100 cm2 中藥膜劑：中藥膜劑：50cm24、供試品制備：、供試品制備：按照按照藥典藥典規(guī)定制備規(guī)定制備155、菌種：、菌

9、種：a.細、真、酵細、真、酵 ，對照試驗菌種，對照試驗菌種 ： 大腸埃希菌、大腸埃希菌、 金葡菌、枯草、白色念朱菌、黑曲霉金葡菌、枯草、白色念朱菌、黑曲霉b.控制菌，對照試驗菌種：大腸、金菌、乙型控制菌，對照試驗菌種：大腸、金菌、乙型 副傷寒副傷寒、銅綠假單胞菌、銅綠假單胞菌、芽孢梭菌、芽孢梭菌 傳代次傳代次 數(shù)：數(shù)： 5 代。代。6、培養(yǎng)基：、培養(yǎng)基：制備的滅菌條件：制備的滅菌條件：121 20min7、方法驗證、方法驗證 ： 確證所用方法適于該菌的計數(shù)確證所用方法適于該菌的計數(shù)檢查檢查168、方法：、方法：（1）細、真、酵：）細、真、酵： 測藥物在單位質(zhì)量測藥物在單位質(zhì)量 （體積）內(nèi)所存在

10、的活菌數(shù)量。（體積）內(nèi)所存在的活菌數(shù)量。 評價生產(chǎn)過程中原輔料設備、器具評價生產(chǎn)過程中原輔料設備、器具工藝、環(huán)境、操作者的衛(wèi)生狀況。工藝、環(huán)境、操作者的衛(wèi)生狀況。（2）方法：）方法： 平平 皿皿 法：法： 法定方法、最常用法定方法、最常用薄膜過濾法：薄膜過濾法：17（3）控制菌）控制菌 大腸埃希菌：大腸埃希菌：是是糞便污染糞便污染的指標菌的指標菌 大腸菌群：大腸菌群：是藥品、食品、飲水等的衛(wèi)生是藥品、食品、飲水等的衛(wèi)生 指標菌指標菌沙門菌：沙門菌： 是人畜共患的腸道病原菌，引起傷是人畜共患的腸道病原菌，引起傷 寒、腸炎、寒、腸炎、食物中毒食物中毒銅綠假單胞菌：銅綠假單胞菌：燒傷、燙傷燒傷、燙傷

11、、眼科、外科、眼科、外科 ， 引起化膿性感染引起化膿性感染金葡菌金葡菌 ： 化膿化膿 梭菌：梭菌： 破傷風、肉毒素破傷風、肉毒素18 第三節(jié)第三節(jié) 抗生素效價的微生物檢定法抗生素效價的微生物檢定法一、管碟法：一、管碟法：1、定義：、定義： 利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用擴散作用比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生生抑菌圈的大小抑菌圈的大小 以以 測定供試品效價的一種方測定供試品效價的一種方法法。 192、方法、方法 a. 二劑量法：二劑量法： 碟碟4 2個個 高：低（供試品）高：低（供試品） 劑距劑距 2：1 或或 4：1

12、 2個個 高：低（對照品）高：低（對照品） b. 三劑量法：碟三劑量法：碟6個個 3個個 高：中：低高：中：低 （供試品）（供試品） 劑距劑距 1：0.8 3個個 高：中：低（對照品）高：中：低（對照品）20二、濁度法二、濁度法標準曲線法標準曲線法二劑量法二劑量法三劑量法三劑量法21 防病、治病的防病、治病的 三大藥源三大藥源biopharmaceutics or biopharmaceuticalsbiochemical drugsbiotechnology drugsbiological products藥藥物物化化學學藥藥物物生生物物藥藥物物中中藥藥生生化化藥藥物物生生物物技技術術藥藥物

13、物生生物物制制品品第四節(jié)第四節(jié) 生化藥物的效價測定法生化藥物的效價測定法 p 25722一、生物藥物一、生物藥物 利用利用生物體、生物組織或器官生物體、生物組織或器官等成分，等成分，綜合運用綜合運用生物學、生物化學、微生物學、生物學、生物化學、微生物學、免疫學、物理化學和藥學的原理和方法免疫學、物理化學和藥學的原理和方法制備的一大類藥物。制備的一大類藥物。23包括：包括： 生化藥物、生物合成藥物生化藥物、生物合成藥物、生物制品。生物制品。24*（一）生化藥物（一）生化藥物（biochemical drugs） 從從動物、植物及微生物動物、植物及微生物中提取的，用中提取的，用 生物化學生物化學半

14、合成制備的或用半合成制備的或用現(xiàn)代生物技術現(xiàn)代生物技術制得的具有生物化學活性的物質(zhì)及其衍生制得的具有生物化學活性的物質(zhì)及其衍生物、降解物以及大分子的結構修飾物等。物、降解物以及大分子的結構修飾物等。二、生物藥物的分類二、生物藥物的分類25生化藥物：生化藥物： 例例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。動動物物植植物物微微生生物物提提取取現(xiàn)現(xiàn)代代生生物物技技術術生生命命基基本本物物質(zhì)質(zhì)及及衍衍生生物物降降解解物物大大分分子子的的結結構構修修飾飾物物生生物物- -化化學學半半合合成成26* * * * 2. 2. 基因工程藥物基因工程藥物-采用現(xiàn)代生采用現(xiàn)代生物基因技術，借助

15、某些微生物、動、物基因技術，借助某些微生物、動、植物來生產(chǎn)出所需的藥品。植物來生產(chǎn)出所需的藥品。 基因工程基因工程 生物工程生物工程 細胞工程細胞工程 酶工程酶工程 27應用前景：應用前景： 方便臨床用藥；方便臨床用藥； 彌補某些藥物的市場空缺；彌補某些藥物的市場空缺； 有利于臨床治療；有利于臨床治療； 有利于人類健康。有利于人類健康。 前景非常廣闊前景非常廣闊 28 *種類：種類： 1. 氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類 2.藥用藥用 酶類與輔酶類酶類與輔酶類 3. 多糖類多糖類 4. 脂質(zhì)類脂質(zhì)類 5. 核酸及其降解物和衍生物類藥物核酸及其降解物和衍生物類藥物29常見生化藥物：

16、常見生化藥物： 復合氨基酸、腦多肽、牛纖維蛋白原、水復合氨基酸、腦多肽、牛纖維蛋白原、水蛭素、生長素、催乳素、天花粉蛋白、輔酶蛭素、生長素、催乳素、天花粉蛋白、輔酶q10、蛋白水解酶、凝血酶、肝素、硫酸軟骨素蛋白水解酶、凝血酶、肝素、硫酸軟骨素a、靈、靈芝多糖、透明質(zhì)酸、黃芪多糖、人參多糖、膽芝多糖、透明質(zhì)酸、黃芪多糖、人參多糖、膽酸類、酸類、rna、dna、atp、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、6-巰巰基嘌呤、阿糖腺苷、環(huán)胞苷等?；堰?、阿糖腺苷、環(huán)胞苷等。30門冬酰胺酶門冬酰胺酶（抗腫瘤藥）（抗腫瘤藥） ch.p（2005）二部）二部 本品系自埃希大腸桿菌（本品系自埃希大腸桿菌（e.coli a

17、si.357）或歐文菌（或歐文菌（er-winia casotovora）中提取制備的）中提取制備的具有酰氨基水解作用的酶。具有酰氨基水解作用的酶。肝素鈉肝素鈉（抗凝血藥）（抗凝血藥） ch.p（2005）二部）二部 本品系自豬或牛的腸黏膜中提取的硫酸氨本品系自豬或牛的腸黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬黏多糖類物質(zhì)。基葡聚糖的鈉鹽，屬黏多糖類物質(zhì)。31門冬酰胺門冬酰胺（氨基酸類藥）（氨基酸類藥） ch.p（2005） 本品為門冬酰胺一水合物。按干燥本品為門冬酰胺一水合物。按干燥品計算，含品計算，含c4h7no4不得少于不得少于98.5%。32 生物合成藥物是由微生物代謝所生物合成藥物是由微

18、生物代謝所產(chǎn)生的藥物和必須利用微生物及其酶產(chǎn)生的藥物和必須利用微生物及其酶轉化反應共同完成的半合成藥物，如轉化反應共同完成的半合成藥物，如抗生素抗生素（二）生物合成藥物（二）生物合成藥物（biosynthetic drugs） 33（三）生物制品（三）生物制品（biological products） 是以是以微生物、細胞、動物或人源組織微生物、細胞、動物或人源組織和體液和體液等為原料，運用傳統(tǒng)技術或現(xiàn)代生等為原料，運用傳統(tǒng)技術或現(xiàn)代生物技術制成，用于人類疾病預防、治物技術制成，用于人類疾病預防、治療和診斷的藥品。療和診斷的藥品。收載在中國藥典（收載在中國藥典（2010年版）第三部年版）第三部

19、34 生物制品主要有生物制品主要有疫苗、免疫血清、血疫苗、免疫血清、血液制劑、免疫調(diào)節(jié)劑（胸腺肽、免疫核糖液制劑、免疫調(diào)節(jié)劑（胸腺肽、免疫核糖核酸）和診斷試劑核酸）和診斷試劑。35 三、生物制品的種類和特點三、生物制品的種類和特點（一）種類（一）種類 1. 疫苗類疫苗類 細菌類疫苗細菌類疫苗 （狂犬疫苗、卡介苗）（狂犬疫苗、卡介苗） 病毒類疫苗病毒類疫苗 （麻疹減毒活疫苗）（麻疹減毒活疫苗） 聯(lián)合疫苗聯(lián)合疫苗 雙價疫苗及多價疫苗雙價疫苗及多價疫苗362. 抗毒素及抗血清類藥物抗毒素及抗血清類藥物 3. 血液制品血液制品 由健康人的血液或經(jīng)特異免疫的人血由健康人的血液或經(jīng)特異免疫的人血漿，經(jīng)分離

20、、提純或由重組漿，經(jīng)分離、提純或由重組dna技術制成技術制成的血漿蛋白組分，以及血液細胞有形成分的血漿蛋白組分，以及血液細胞有形成分統(tǒng)稱為血液制品，主要用于臨床治療和被統(tǒng)稱為血液制品，主要用于臨床治療和被動免疫預防，如人免疫球蛋白動免疫預防，如人免疫球蛋白374. 重組重組dna制品制品 采用遺傳修飾，將所需制品的編碼采用遺傳修飾，將所需制品的編碼dna通過通過一種質(zhì)粒或病毒載體，引入適宜的微生物或細胞系，一種質(zhì)粒或病毒載體，引入適宜的微生物或細胞系，dna通過表達和翻譯后成為蛋白質(zhì)，再經(jīng)提取和通過表達和翻譯后成為蛋白質(zhì)，再經(jīng)提取和純化而回收所需制品制得。包括：純化而回收所需制品制得。包括：

21、細胞因子類（重組人干擾素）細胞因子類（重組人干擾素） 生長因子類（重組人表皮生長因子）生長因子類（重組人表皮生長因子） 激素類（重組人胰島素）激素類（重組人胰島素） 酶類（重組鏈激酶）酶類（重組鏈激酶） 疫苗（重組乙型肝炎疫苗）疫苗（重組乙型肝炎疫苗） 單克隆抗體單克隆抗體3838重組重組dna技術技術 3939國外國外重組重組dna制品制品中文名稱中文名稱 英文名或縮寫英文名或縮寫 適應癥適應癥 胰島素胰島素 humulinnovolinhumalog 糖尿病糖尿病 腫瘤壞死因子腫瘤壞死因子 tnf 各種腫瘤各種腫瘤集落刺激因子集落刺激因子 neupogen 人生長激素人生長激素 protr

22、opinhumatropenutropinaq 矮小病矮小病 人干擾素人干擾素 rhuifn2brhuifn2arhuifnb 抗癌抗癌rhuifnrlb hcv, 抗癌抗癌hbv,hvc等等 抗癌，多發(fā)硬化癥腎癌，慢性肉芽腫抗癌，多發(fā)硬化癥腎癌，慢性肉芽腫 白細胞介素白細胞介素 rhuil 化療，抗癌化療，抗癌 組織溶纖原激活劑組織溶纖原激活劑 rhutpa 腦栓塞，心梗腦栓塞，心梗 4040我國我國重組重組dna制品制品中文名稱中文名稱 英文名或縮寫英文名或縮寫 適應癥適應癥 重組人干擾素重組人干擾素a1b rhuifnaib 治療病毒性角膜炎治療病毒性角膜炎 上皮生長因子上皮生長因子 (

23、egf) 燒傷或創(chuàng)傷治療外用藥物燒傷或創(chuàng)傷治療外用藥物 粒細胞集落刺激因子粒細胞集落刺激因子 (gcsf) 癌癥癌癥 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子粒細胞巨噬細胞集落刺激因子 (gm-csf) 癌癥治療引起的白細胞減少癥癌癥治療引起的白細胞減少癥 紅細胞生成素紅細胞生成素 (epo) 治療慢性腎功能衰竭引起的貧血治療慢性腎功能衰竭引起的貧血 溶栓藥物鏈激酶溶栓藥物鏈激酶 (sk) 治療慢性腎功能衰竭引起的貧血治療慢性腎功能衰竭引起的貧血 重組人胰島素重組人胰島素 humulinnovolinhumalog 糖尿病糖尿病 白細胞介素白細胞介素-2 rhuil-2 類風濕類風濕 415. 診斷制品診斷

24、制品 體外診斷制品體外診斷制品 體內(nèi)診斷制品體內(nèi)診斷制品6. 其他制品其他制品（如胃蛋白酶）（如胃蛋白酶） 42*（二）生化藥物的（二）生化藥物的特點特點1. 分子量大、不是定值分子量大、不是定值2. 結構確認難結構確認難 ，需采用生化法確證，需采用生化法確證3. 需檢查生物活性需檢查生物活性4. 要求檢查安全性要求檢查安全性5. 需做效價測定需做效價測定431. 分子量大、不是定值分子量大、不是定值肝素肝素 1200015000（未分級）（未分級）低分子肝素低分子肝素 8000 （低分子量）（低分子量）重組人胰島素重組人胰島素 5807.89腺苷鈷胺腺苷鈷胺 1579.60右旋糖苷右旋糖苷7

25、0 64000 76000不定值不定值測定困難測定困難抗凝血抗凝血抗血栓抗血栓44 2. 結構確認難結構確認難 ，需采用生化法確證，需采用生化法確證理化方法理化方法 生化方法生化方法 氨基酸序列分析氨基酸序列分析 肽圖肽圖45例例 重組人粒細胞刺激因子注射液重組人粒細胞刺激因子注射液 ch.p（2005）3.1 原液檢定原液檢定3.1.12 肽圖（至少每半年測定肽圖（至少每半年測定1次）次） 依法測定（附錄依法測定（附錄 e），應與對照品圖形一致。），應與對照品圖形一致。3.1.13 n-末端氨基酸序列（至少每年測定末端氨基酸序列（至少每年測定1次）次） 用氨基酸序列分析儀測定，其用氨基酸序列

26、分析儀測定，其n-末端序列應為：末端序列應為： thr-pro-leu-gly-pro-ala-ser-ser-leu-pro-gln-ser-phe-leu-leu。 463. 需檢查生物活性需檢查生物活性例例 細胞色素細胞色素c溶液溶液 ch.p（2005） 【檢查】活力【檢查】活力 照細胞色素照細胞色素c活力測定活力測定法（附錄法（附錄 b）測定，不得低于）測定，不得低于95.0%。例例 尿激酶尿激酶 ch.p（2005） 【檢查】凝血質(zhì)樣活性物質(zhì)【檢查】凝血質(zhì)樣活性物質(zhì) 凝血質(zhì)樣活凝血質(zhì)樣活性為零值時的供試品酶活力，按每性為零值時的供試品酶活力，按每1ml中供試中供試品的單位表示，每品

27、的單位表示，每1ml應大于應大于150單位。單位。474. 要求檢查安全性要求檢查安全性例例 重組乙型肝炎疫苗（重組乙型肝炎疫苗（cho細胞）細胞） ch.p（2005）制造制造 細胞外源因子檢查：細菌和真菌、支原體、細胞細胞外源因子檢查：細菌和真菌、支原體、細胞病毒外源因子檢查均應為陰性。病毒外源因子檢查均應為陰性。檢定檢定 原液檢定原液檢定 牛血清白蛋白殘留量，牛血清白蛋白殘留量，cho細胞細胞dna殘留量，殘留量，cho細胞蛋白殘留量，無菌檢查，支原體檢查細胞蛋白殘留量，無菌檢查，支原體檢查 半成品檢定半成品檢定 無菌檢查，細菌內(nèi)毒素檢查無菌檢查，細菌內(nèi)毒素檢查 成品檢定成品檢定 無菌檢

28、查，異常毒性檢查，細菌內(nèi)毒素檢查無菌檢查，異常毒性檢查，細菌內(nèi)毒素檢查 485. 需做效價測定需做效價測定例例 門冬酰胺酶門冬酰胺酶 ch.p（2005） 按干燥品計算，每按干燥品計算，每1mg蛋白含門冬酰胺酶效蛋白含門冬酰胺酶效價不得低于價不得低于250單位。單位。例例 肝素鈉肝素鈉 ch.p（2005） 【效價測定】照肝素生物測定法（附錄【效價測定】照肝素生物測定法（附錄 d）測定，應符合規(guī)定；測得的結果應為標示量的測定，應符合規(guī)定；測得的結果應為標示量的91%110%。49四、生物制品的四、生物制品的全程、全面質(zhì)量控制全程、全面質(zhì)量控制 生物制品多數(shù)為生物活性分子，對人體而言往往生物制品

29、多數(shù)為生物活性分子，對人體而言往往是異源物質(zhì)，其化學性質(zhì)與生物學性質(zhì)都很不穩(wěn)定，是異源物質(zhì)，其化學性質(zhì)與生物學性質(zhì)都很不穩(wěn)定，又易受到微生物污染，故對生物制品的均一性、有效又易受到微生物污染，故對生物制品的均一性、有效性、安全性和穩(wěn)定性等都有嚴格要求。為了生產(chǎn)出藥性、安全性和穩(wěn)定性等都有嚴格要求。為了生產(chǎn)出藥理活性高、針對性強、毒性低、副作用小、療效可靠理活性高、針對性強、毒性低、副作用小、療效可靠及營養(yǎng)價值高的生物制品，必須對其原材料、生產(chǎn)過及營養(yǎng)價值高的生物制品，必須對其原材料、生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品進行全程質(zhì)量控制。程和最終產(chǎn)品進行全程質(zhì)量控制。 50 * * * * 一、鑒別方法：一、鑒別

30、方法： 理化鑒別法：化學鑒別法理化鑒別法：化學鑒別法 紫外分光光度法紫外分光光度法 hplchplc法法生化鑒別法：酶法生化鑒別法：酶法 電泳法電泳法 等電聚焦法等電聚焦法生物鑒別法：家兔驚厥試驗生物鑒別法：家兔驚厥試驗51（一）理化鑒別法一）理化鑒別法 1.1.化學鑒別法化學鑒別法： 例：溶菌酶例：溶菌酶 - conh- +cu- conh- +cu2+ 2+ 絡合顯色絡合顯色藥藥物物 + + 試試劑劑現(xiàn)現(xiàn)象象顏顏色色沉沉淀淀52胃蛋白酶胃蛋白酶 ch.p（2005）【鑒別】取本品的水溶液，加鞣酸、沒食【鑒別】取本品的水溶液，加鞣酸、沒食子酸或多數(shù)重金屬鹽的溶液，即生成沉淀子酸或多數(shù)重金屬鹽

31、的溶液，即生成沉淀谷氨酸鈉谷氨酸鈉 ch.p（2005）【鑒別】（【鑒別】（1）取本品約）取本品約5mg，加水，加水1ml使使溶解，加茚三酮試液數(shù)滴，加熱，溶液顯溶解，加茚三酮試液數(shù)滴，加熱，溶液顯藍色至紫藍色。藍色至紫藍色。532. 紫外分光光度法紫外分光光度法腺苷鈷胺腺苷鈷胺 ch.p（2005）（1）氯化鉀溶液中：）氯化鉀溶液中： max在在264nm、285nm、305nm及及460nm（2）磷酸鹽緩沖液（）磷酸鹽緩沖液（ph7.0）中，）中， max在在261nm、525nm543. 高效液相色譜法高效液相色譜法重組人胰島素重組人胰島素 ch.p（2005）【鑒別】【鑒別】 在效價測

32、定項下記錄的色譜在效價測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應與圖中，供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致。對照品溶液主峰的保留時間一致。55 1. 酶法酶法 高效、專一的催化某些生化反高效、專一的催化某些生化反應。應。 如如尿激酶尿激酶的鑒別。的鑒別。 （二）生化鑒別法（二）生化鑒別法56尿激酶尿激酶 本品系從新鮮人尿中提取的一種能激活纖維蛋白溶本品系從新鮮人尿中提取的一種能激活纖維蛋白溶酶原的酶。它是由高分子量尿激酶（酶原的酶。它是由高分子量尿激酶（mw 54 000）和）和低分子量尿激酶（低分子量尿激酶（mw33 000）組成的混合物，高分）組成的混合物，高

33、分子量尿激酶含量不得少于子量尿激酶含量不得少于90，每，每1mg 蛋白中尿激蛋白中尿激酶活力不得少于酶活力不得少于12萬單位。萬單位。 本品在生產(chǎn)過程中需經(jīng)本品在生產(chǎn)過程中需經(jīng)60加熱加熱10小時，以使病毒小時，以使病毒滅活。滅活。 57 【鑒別】【鑒別】 取效價測定項下的供試品溶液，用巴取效價測定項下的供試品溶液，用巴比妥氯化鈉緩沖液（比妥氯化鈉緩沖液（ph 7.8）稀釋成每）稀釋成每1ml 中含中含20單位的溶液，吸取單位的溶液，吸取1ml ，加牛纖維蛋白，加牛纖維蛋白原溶液原溶液0.3ml ，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液溶液0.2ml ，牛凝血酶溶液，牛凝血

34、酶溶液0.2ml ，迅速搖勻，迅速搖勻，立即置立即置370.5恒溫水浴中保溫，記時，反恒溫水浴中保溫，記時，反應系統(tǒng)應在應系統(tǒng)應在3045秒內(nèi)凝結，且凝塊在秒內(nèi)凝結，且凝塊在15分鐘分鐘內(nèi)重新溶解。以內(nèi)重新溶解。以0.9氯化鈉溶液作空白，同法氯化鈉溶液作空白，同法操作，凝塊在操作，凝塊在2 小時內(nèi)不溶（試劑的配制同效小時內(nèi)不溶（試劑的配制同效價測定）。價測定）。 58激激活活牛牛纖纖維維蛋蛋白白溶溶酶酶原原尿尿激激酶酶牛纖維蛋白酶牛纖維蛋白酶凝凝結結牛牛纖纖維維蛋蛋白白原原牛牛凝凝血血酶酶+溶解溶解,592. 電泳法電泳法例例 肝素鈉肝素鈉 ch.p（2005）【鑒別】（【鑒別】（1）取本品與

35、肝素標準品，分別）取本品與肝素標準品，分別加水制成每加水制成每1ml中含中含2.5mg的溶液，照電泳法的溶液，照電泳法（附錄（附錄f第三法）試驗，供試品和標準品第三法）試驗，供試品和標準品所顯斑點的遷移距離之比應為所顯斑點的遷移距離之比應為0.91.1。6061三、生物鑒別法三、生物鑒別法1. 血清學法血清學法 體外抗原抗體試驗體外抗原抗體試驗2. 生物學法生物學法 利用生物體對藥物的反應來鑒別藥物利用生物體對藥物的反應來鑒別藥物 如如 ：利用利用小鼠的驚厥小鼠的驚厥反應來鑒別胰島素反應來鑒別胰島素 62 利用胰島素的利用胰島素的降糖降糖作用。作用。 給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚給家兔大劑量

36、注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注厥，迅速靜注50% 50% gsgs，驚厥停止。，驚厥停止。63第五節(jié)第五節(jié) 藥品的安全性檢查藥品的安全性檢查 p258一、一、特殊雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)檢查 1. 宿主細胞（菌）蛋白殘留量的檢查宿主細胞（菌）蛋白殘留量的檢查 2. 外源性外源性dna殘留量的檢查殘留量的檢查 3. 產(chǎn)品相關雜質(zhì)的檢查產(chǎn)品相關雜質(zhì)的檢查 4. 殘余抗生素的檢查殘余抗生素的檢查64二、二、安全性檢查安全性檢查1. 熱原檢查熱原檢查 家兔法家兔法: 觀察觀察 2. 細菌內(nèi)毒素檢查細菌內(nèi)毒素檢查65鱟試劑法鱟試劑法 ( 大多數(shù)重組產(chǎn)品具有很高的生物活大多數(shù)重組產(chǎn)品具有很高的生物活性，特別是細胞

37、因子類產(chǎn)品本身就有很性，特別是細胞因子類產(chǎn)品本身就有很強的致熱原作用，因此強的致熱原作用，因此采用細菌內(nèi)毒素采用細菌內(nèi)毒素檢查代替熱原檢查檢查代替熱原檢查。663. 異常毒性檢查與特異性毒性檢查異常毒性檢查與特異性毒性檢查 使動物急性中毒死亡的物質(zhì)的使動物急性中毒死亡的物質(zhì)的限量檢查限量檢查。 以動物死亡與否為終點。以動物死亡與否為終點。 試驗動物：試驗動物：小鼠或豚鼠小鼠或豚鼠 檢檢 查：查：急性毒性物質(zhì)急性毒性物質(zhì)67觀察小鼠給藥后觀察小鼠給藥后48h是否死亡是否死亡。 靜注：靜注：iv 靜滴：靜滴：iv.gtt 皮下注射：皮下注射：i h 口服：口服：p.o 肌注肌注: im 腹腔注射腹

38、腔注射: i.p 皮內(nèi)注射皮內(nèi)注射: i.d 灌胃注射灌胃注射: ig684. 過敏反應檢查過敏反應檢查 檢查藥物中的檢查藥物中的 ：異性蛋白異性蛋白。觀觀察察過過敏敏性性現(xiàn)現(xiàn)象象豚豚鼠鼠注注射射藥藥液液 實驗動物：實驗動物：豚鼠豚鼠69過敏反應過敏反應:(超敏超敏/變態(tài)反應變態(tài)反應)型型(速發(fā)型速發(fā)型):青霉素過敏性休克、青霉素過敏性休克、過敏性過敏性哮喘哮喘 花粉花粉,真菌真菌,塵螨塵螨,動物皮毛動物皮毛型（型（細胞毒型細胞毒型）：血細胞減少癥，新生兒溶血）：血細胞減少癥，新生兒溶血, abo 血型不合血型不合（免疫復合物型免疫復合物型）：血清病、類風濕性關節(jié)炎）：血清病、類風濕性關節(jié)炎,

39、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（系統(tǒng)性紅斑狼瘡（sle）型（型（遲發(fā)型遲發(fā)型）：）： 接觸性皮炎、移植排斥接觸性皮炎、移植排斥, 傳染性變態(tài)反應傳染性變態(tài)反應705. 升壓物質(zhì)：升壓物質(zhì)：大大 鼠鼠 血壓上升血壓上升 降壓物質(zhì)：降壓物質(zhì)：麻醉貓麻醉貓 血壓下降血壓下降 檢查：檢查：導致血壓降低的導致血壓降低的雜質(zhì)、組胺雜質(zhì)、組胺、 類組胺類組胺 血血 壓：壓：單位面積血液對管壁的側壓力，單位面積血液對管壁的側壓力， 通常指的是通常指的是動脈血壓動脈血壓. （arterial blood pressure )711 mmhg=0.133 kpasbp (收縮壓收縮壓): 100-120mmhgdbp(舒張壓舒

40、張壓): 60-80mmhg 脈脈 壓壓: 30-40mmhg心率心率(heart rate) : 60-100次次/min心率平均次數(shù)心率平均次數(shù) : 75次次/min726. 無菌檢查法無菌檢查法 檢查藥物中是否染有檢查藥物中是否染有活菌活菌。 許多生化藥物不能高溫滅菌，需在無許多生化藥物不能高溫滅菌，需在無菌條件下制備。菌條件下制備。 73生物制品的生物制品的含量測定方法含量測定方法： 1.1.理化分析法理化分析法： 化學分析法：化學分析法：重量測定法、滴定分析法重量測定法、滴定分析法 電化學分析法：電化學分析法： 光譜分析法光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法：比色法、紫外分光、

41、熒光分光光法 色譜分析法色譜分析法：hplchplc法：法：rp-hplcrp-hplc、 hpiec hpiec 、 hpgfchpgfc、灌注色譜法、灌注色譜法、hpcehpce法法2.2.酶法酶法：酶活力測定法、酶分析法：酶活力測定法、酶分析法3.3.電泳法電泳法4.4.生物檢定法生物檢定法返 回74結果表示方法：結果表示方法： 百分含量百分含量適用于適用于成分已知、結成分已知、結 構明確構明確的生物制品的生物制品 生物效價或酶活力單位生物效價或酶活力單位 適用于適用于蛋白質(zhì)、酶類蛋白質(zhì)、酶類75一、理化分析法一、理化分析法 （一）（一） 滴定法滴定法例例 甘氨酸甘氨酸 ch.p（200

42、5） 【含量測定】【含量測定】 取本品約取本品約70mg，精密稱定，加無水，精密稱定，加無水甲酸甲酸1.5ml使溶解，加冰醋酸使溶解，加冰醋酸25ml，照電位滴定法（附，照電位滴定法（附錄錄 a），用高氯酸滴定液（），用高氯酸滴定液（0.1mol /l）滴定，并將）滴定，并將滴定的結果用空白試驗校正。每滴定的結果用空白試驗校正。每1ml高氯酸滴定液高氯酸滴定液（0.1mol/l）相當于）相當于7.507mg的的c2h5no2。76（二）（二） 光譜分析法光譜分析法 1. 紫外紫外可見分光光度法可見分光光度法 （1）比色法）比色法 （2）紫外分光光度法）紫外分光光度法 2. 熒光分光光度法熒光分

43、光光度法 77例例 細胞色素細胞色素c溶液溶液 ch.p（2005） 【含量測定】【含量測定】 精密量取含鐵量項下的供試精密量取含鐵量項下的供試品溶液品溶液1ml，置，置50ml量瓶中，用鑒別（量瓶中，用鑒別（2）項下）項下的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，加連二亞硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，加連二亞硫酸鈉約約15mg，搖勻，照紫外，搖勻，照紫外-可見分光光度法（附錄可見分光光度法（附錄 a），在約），在約550nm的波長處，以間隔的波長處，以間隔0.5nm找找出最大吸收波長，測定吸光度，按細胞色素出最大吸收波長，測定吸光度，按細胞色素c吸吸收系數(shù)（收系數(shù)（ ）為）為23.0計算，即得。計算，即得

44、。 %1cm1e78例例 五肽胃泌素五肽胃泌素 ch.p（2005） 【含量測定】取本品適量，精密稱定，加【含量測定】取本品適量，精密稱定，加0.01mol/l氨溶液溶解并定量稀釋制成每氨溶液溶解并定量稀釋制成每1ml中約中約含含50 g的溶液，照分光光度法（附錄的溶液，照分光光度法（附錄 a），在），在280nm的波長處測定吸收度，按的波長處測定吸收度，按c37h49n7o9s的吸的吸收系數(shù)（收系數(shù)（ ）為）為70計算，即得。計算，即得。%1cm1e79（三）（三） 高效液相色譜法高效液相色譜法1. 反相高效液相色譜法反相高效液相色譜法2. 離子對色譜法離子對色譜法3. 分子排阻色譜法分子排

45、阻色譜法80輔酶輔酶q10 ch.p（2005） 固定相固定相 十八烷基硅烷鍵合硅膠十八烷基硅烷鍵合硅膠 流動相流動相 甲醇甲醇-無水乙醇（無水乙醇（1：1） 檢測波長檢測波長 275nm 環(huán)孢素環(huán)孢素 ch.p（2005） 固定相固定相 十八烷基硅烷鍵合硅膠十八烷基硅烷鍵合硅膠 流動相流動相 乙腈乙腈-水水-四丁基甲醚四丁基甲醚-磷酸磷酸 （430：520：50：1） 檢測波長檢測波長 210nm 81二、生化分析法二、生化分析法（一）電泳法（一）電泳法 在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子或離子在電在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子或離子在電場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反場作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象叫電泳。方向遷移的現(xiàn)象叫電泳。 它主要是利用物質(zhì)在電場中遷移速度的不它主要是利用物質(zhì)在電場中遷移速度的不同進行分離。同進行分離。82常見電泳的分類：常見電泳的分類：1. 自由界面電泳自由界面電泳（u型管）型管） 溶液中不同分子在電場作用下各溶液中不同分子在電場作用下各自聚集而