第六章熒光分光光度法1

1、l基本要求：1.了解熒光光譜法的基本原理和應(yīng)用特點(diǎn)。2.了解熒光分光光度計(jì)的組成以及特點(diǎn)。3.掌握熒光光譜法的定量分析方法。掌握熒光光譜法的定量分析方法。4.了解影響熒光強(qiáng)度的因素。第一節(jié)第一節(jié) 概論概論 回顧： 四大類(lèi)電化學(xué)分析法光學(xué)分析法色譜分析法其它分析方法 原子光譜法 分子光譜法 X射線(xiàn)光譜法 核磁波譜法 紫外-可見(jiàn)光分光光度法 熒光分光光度法紅外吸收光譜法 拉曼光譜法 l熒光粉(俗稱(chēng)夜光粉)，通常分為光致儲(chǔ)能夜光粉和帶有放射性的夜光粉兩類(lèi)。 “熒光粉主要有增白作用，在紙張、包裝袋、洗衣粉、塑料、紡織品等上常有應(yīng)用，這也難怪塑料袋上檢出熒光粉?！?熒光粉的種類(lèi)很多，現(xiàn)在市場(chǎng)上常見(jiàn)的就有

2、500多個(gè)品種，性狀各異，我們常用的4打印紙上就有熒光粉。1.定量分析 能產(chǎn)生熒光 或能形成熒光配合物的物質(zhì)。2.簡(jiǎn)單定性 回答“是不是”。二、特點(diǎn)：二、特點(diǎn)： 靈敏度高，比吸收光譜法高10104倍。ppb選擇性比吸收光譜法好。一、分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光的產(chǎn)生 物質(zhì)吸收光輻射 價(jià)電子從基態(tài)躍到激發(fā)態(tài)，然后再回到基態(tài) 釋放能量以熱能的形式。以光輻射的形式。以光輻射形式釋放能量時(shí)，發(fā)射熒光。這種現(xiàn)象稱(chēng)為光光致發(fā)光致發(fā)光。熒光磷光無(wú)輻射躍遷激發(fā)態(tài)亞穩(wěn)態(tài)（三重態(tài)）基態(tài)分子的去活化過(guò)程：當(dāng)處于基態(tài)單重態(tài)（S0）的分子吸收波長(zhǎng)為1和2的輻射后,分別被激發(fā)到第一激發(fā)單重態(tài)（S1*）和第二激發(fā)單重態(tài)(S2

3、*)的任意振動(dòng)能級(jí)上,而后發(fā)生以下過(guò)程： 振動(dòng)弛豫: 在溶液中，受激的溶質(zhì)分子與溶劑分子碰撞，而失去過(guò)剩的能量，以10-1310-11 s的極快速度，降至同一電子態(tài)的最低能級(jí)上，這一過(guò)程屬于無(wú)輻射躍遷。內(nèi)轉(zhuǎn)換:當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非?？拷灾缕湔駝?dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，如第一激發(fā)單重態(tài)的較高振動(dòng)能級(jí)與第二激發(fā)單重態(tài)的某一較低振動(dòng)能級(jí)的位能相同，可發(fā)生電子由高電子能級(jí)以無(wú)輻射躍遷的方式躍遷至低能級(jí)上。此過(guò)程效率高，速度快，一般只需10-1310-11s。 熒光發(fā)射: 處于激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的分子，也存在幾種可能的去活化過(guò)程。若以10-910-7s左右的時(shí)間發(fā)射光量子回到基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)，這一過(guò)程就有熒光

4、發(fā)生。 最常見(jiàn)的光致發(fā)光：熒光和磷光。 兩者發(fā)光機(jī)理不同，壽命不同。熒光壽命10-910-6秒，磷光壽命10-310秒。 熒光可由激發(fā)態(tài)的分子產(chǎn)生，也可由激發(fā)態(tài)的原子產(chǎn)生，本章介紹分子熒光。 由于熒光的產(chǎn)生由價(jià)電子引起，所以，熒光光譜屬于電子光譜，其波長(zhǎng)范圍位于：紫外光區(qū)和可見(jiàn)光區(qū)。 激發(fā)光譜激發(fā)光譜 固定熒光波長(zhǎng)，以激發(fā)光波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度(F)所作的光譜曲線(xiàn)。300350400(nm) F【例】硫酸奎寧（0.1mol/L硫酸溶液）的激發(fā)光譜。 發(fā)射發(fā)射(熒光熒光)光譜光譜 固定激發(fā)光波長(zhǎng)，以熒光波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度F所作的光譜曲線(xiàn)。300350400(nm) F【例】蒽（乙醇溶液）的發(fā)射光譜。激發(fā)光

5、譜和熒光光譜: 硫酸奎寧的激發(fā)光譜和熒光光譜 蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜 熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大熒光波長(zhǎng)是鑒定熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大熒光波長(zhǎng)是鑒定物質(zhì)的根據(jù)，也是定量測(cè)定時(shí)最靈敏的條件物質(zhì)的根據(jù)，也是定量測(cè)定時(shí)最靈敏的條件。 分子要產(chǎn)生熒光，首先要能吸收紫外光或可見(jiàn)光。能產(chǎn)生熒光的分子具有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：共軛雙鍵剛性平面多環(huán)結(jié)構(gòu) 【例】芴具有剛性平面，產(chǎn)生的熒光比聯(lián)二苯強(qiáng)。CH2 1 1 具有共軛雙鍵體系的分子：具有共軛雙鍵體系的分子： 大多數(shù)熒光物質(zhì)都具有芳香環(huán)或雜環(huán)，因?yàn)檫@些化合物大多數(shù)熒光物質(zhì)都具有芳香環(huán)或雜環(huán)，因?yàn)檫@些化合物都具有易發(fā)生都具有易發(fā)生* *或或nn* *躍遷的電子共軛

6、結(jié)構(gòu)，躍遷的電子共軛結(jié)構(gòu)， 電電子的非定域性越大，就越容易被激發(fā)，分子的熒光效率越子的非定域性越大，就越容易被激發(fā)，分子的熒光效率越大，因此凡能提高大，因此凡能提高電子共軛程度的結(jié)構(gòu)，如對(duì)電子共軛程度的結(jié)構(gòu)，如對(duì)- -苯基化、苯基化、間間- -苯基化、乙烯化的作用都會(huì)增大熒光的強(qiáng)度。苯基化、乙烯化的作用都會(huì)增大熒光的強(qiáng)度。 2 2 苯環(huán)上取代基的類(lèi)型：苯環(huán)上取代基的類(lèi)型： 給電子基團(tuán)。如給電子基團(tuán)。如-OH-OH、-NH-NH2 2常使熒光增強(qiáng)。常使熒光增強(qiáng)。 與與電子體系互相作用較小的取代基。如電子體系互相作用較小的取代基。如-SO-SO3 3H H對(duì)分子對(duì)分子熒光影響不明顯。熒光影響不明顯

7、。 吸電子基團(tuán)如吸電子基團(tuán)如-COOH-COOH、-CO-CO減弱甚至破壞熒光。減弱甚至破壞熒光。 3 3 具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子：具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子： 剛性的不飽和的平面結(jié)構(gòu)具有較高的熒光效率，剛性的不飽和的平面結(jié)構(gòu)具有較高的熒光效率，分子剛性及共平面性越大，熒光效率越高，酚酞分子剛性及共平面性越大，熒光效率越高，酚酞和熒光素比較，熒光素中多一個(gè)氧橋，使分子的和熒光素比較，熒光素中多一個(gè)氧橋，使分子的三個(gè)環(huán)成一個(gè)平面，其共平面性增加，使三個(gè)環(huán)成一個(gè)平面，其共平面性增加，使電子電子的共軛度增加，因而熒光素有強(qiáng)烈熒光，而酚酞的共軛度增加，因而熒光素有強(qiáng)烈熒光，而酚酞的熒光很弱。的熒光很弱。C

8、OCOHOHO 酚酞 熒光素COCOHOHOO：量子效率，發(fā)射光量子與吸收光量子之比。 I0：入射光強(qiáng)度：摩爾吸光系數(shù) b： 光程 c：濃度F=2.303I0bc公式成立前提條件：bc=A0.05 即：當(dāng)試樣濃度較低時(shí)（c0.05/b），C與F方成線(xiàn)性。（如果濃度過(guò)高，分子碰撞機(jī)會(huì)增大，而產(chǎn)生無(wú)輻射去激活，造成線(xiàn)性偏離。）一、基本結(jié)構(gòu)示意圖一、基本結(jié)構(gòu)示意圖 特點(diǎn)：1 光源方向與檢測(cè)方向成直角； 2 二個(gè)單色器。顯示器檢測(cè)器熒光單色器樣品池激發(fā)光單色器光源1光源光源高壓汞蒸氣燈，氙燈。能提供紫外光和可見(jiàn)光，光強(qiáng)度比紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)光源大得多。2激發(fā)光單色器激發(fā)光單色器作用：提供單波長(zhǎng)的激

9、發(fā)光。色散元件：棱鏡或光柵。出射狹縫寬度可調(diào) 。3樣品池樣品池須用石英材料制成。4熒光單色器熒光單色器將樣品池中的散射光、反射光、雜質(zhì)熒光等濾掉，只讓熒光通過(guò)。出射狹縫寬度可調(diào)。5檢測(cè)器檢測(cè)器光電轉(zhuǎn)換元件，測(cè)定熒光的強(qiáng)度。光電轉(zhuǎn)換元件，測(cè)定熒光的強(qiáng)度。檢測(cè)方向與激發(fā)光方向垂直：在垂直方向上沒(méi)有透過(guò)光的檢測(cè)方向與激發(fā)光方向垂直：在垂直方向上沒(méi)有透過(guò)光的干擾。干擾。由于熒光的強(qiáng)度較弱，一般以光電倍增管作檢測(cè)器。一、定量方法一、定量方法 一般采用工作直線(xiàn)法。作CF直線(xiàn)。FC配制一系列待測(cè)成分的標(biāo)準(zhǔn)溶液 C1 C2 C3 C4 C5測(cè)出相應(yīng)的熒光強(qiáng)度 F1 F2 F3 F4 F5建立工作直線(xiàn)（ F C

10、） 作圖法 回歸法測(cè)量待測(cè)樣品，得F樣 從工作直線(xiàn)上找到待測(cè)成分的濃度C樣 由回歸方程計(jì)算出C樣定量分析方法校準(zhǔn)曲線(xiàn)法：校準(zhǔn)曲線(xiàn)法：以已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按試樣相同方法處理后，配成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在儀器調(diào)零后再以濃度最大的標(biāo)準(zhǔn)溶液作基準(zhǔn)，調(diào)節(jié)熒光強(qiáng)度讀數(shù)為100；然后測(cè)出其他標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)熒光強(qiáng)度和空白溶液的相對(duì)熒光強(qiáng)度；扣除空白值后，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；然后將處理后的試樣配成一定濃度的溶液，在同一條件下測(cè)定其相對(duì)熒光強(qiáng)度，扣除空白值后，從校準(zhǔn)曲線(xiàn)上求出其含量。分子熒光分析法在檢驗(yàn)中的應(yīng)用尿液中的色胺的測(cè)定尿液中的色胺的測(cè)定 尿中色胺的含量是色氨酸代

11、謝的尿中色胺的含量是色氨酸代謝的一個(gè)標(biāo)志。色胺有天然熒光，激發(fā)峰一個(gè)標(biāo)志。色胺有天然熒光，激發(fā)峰285nm285nm，熒光峰，熒光峰360nm360nm。把尿或組織液。把尿或組織液的色胺萃取出來(lái)，就可直接檢測(cè)。在的色胺萃取出來(lái)，就可直接檢測(cè)。在0.18g/15mL0.18g/15mL范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與色范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與色胺濃度呈線(xiàn)性關(guān)系胺濃度呈線(xiàn)性關(guān)系。 食品中維生素食品中維生素B B2 2的測(cè)定的測(cè)定: : 維生素維生素B B2 2（核黃素）在（核黃素）在430440nm430440nm藍(lán)光照射藍(lán)光照射下會(huì)發(fā)出綠色熒光，下會(huì)發(fā)出綠色熒光，emem為為535nm535nm。它在。它在pH67

12、pH67的的溶液中熒光強(qiáng)度最大，而在溶液中熒光強(qiáng)度最大，而在pH11pH11時(shí)熒光消失；但時(shí)熒光消失；但在堿性溶液經(jīng)光線(xiàn)照射發(fā)生分解作用或在酸性在堿性溶液經(jīng)光線(xiàn)照射發(fā)生分解作用或在酸性KMnOKMnO4 4氧化下都會(huì)生成熒光強(qiáng)度比維生素氧化下都會(huì)生成熒光強(qiáng)度比維生素B B2 2強(qiáng)得多強(qiáng)得多的黃光素，并可溶于氯仿。利用此性質(zhì)可提高測(cè)的黃光素，并可溶于氯仿。利用此性質(zhì)可提高測(cè)定的靈敏度和選擇性。定的靈敏度和選擇性。H3CH3CNNRNNHOOOCCCHCCHCH3CH3CCHCHCH3CCCHCCH2CH2CCH2 核黃素核黃素 黃光素黃光素 名稱(chēng) 強(qiáng)度 排名 欣卉 159.14 1 舒潔（Dis

13、ney） 173.67 2 五月花 195.89 3 清風(fēng)（抽式） 216.49 4 舒潔（一般） 234.54 5 心相?。ǔ槭剑?243.35 6 潔云（雅致） 257.19 7 妮飄（一般） 272.15 8 心相?。ū『桑?298.89 9 純點(diǎn) 300.9 10 妮飄（hello kitty） 妮飄（hello kitty） 11 妙芙（康師傅） 1010.83 12 思蜜兒（抽式） 1000以上 13 黃色一般草稿紙 999.99 14 A4紙 比普通草稿紙多很多 15 1激發(fā)光照射激發(fā)光照射有一些熒光物質(zhì)若受到強(qiáng)光照射，會(huì)發(fā)生分解而導(dǎo)致有一些熒光物質(zhì)若受到強(qiáng)光照射，會(huì)發(fā)生分解而導(dǎo)

14、致F。所以，熒光分光光度計(jì)通常在激發(fā)光單色器后裝配有光閘，在所以，熒光分光光度計(jì)通常在激發(fā)光單色器后裝配有光閘，在測(cè)定時(shí)才打開(kāi)光閘讓激發(fā)光照射樣品池。測(cè)定時(shí)才打開(kāi)光閘讓激發(fā)光照射樣品池。2溫度溫度溫度溫度，熒光效率下降，熒光效率下降，F(xiàn)。（。（因?yàn)椋瑴囟纫驗(yàn)?，溫度，增加分子間，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)而使能量消耗掉。）碰撞機(jī)會(huì)而使能量消耗掉。）4溶劑溶劑 有些溶劑會(huì)使熒光效率下降，也可能帶來(lái)干擾熒光。 苯胺pH712時(shí)，發(fā)蘭色熒光。pH2或PH13時(shí)，無(wú)熒光?！纠克裕袝r(shí)需要pH緩沖液控制pH值在適當(dāng)范圍內(nèi)。3pH值值 pH值能改變某些熒光物質(zhì)的電子構(gòu)型從而影響熒光強(qiáng)度。l靈敏度高?？筛哌_(dá)ppb級(jí)（10-9），甚至ppt級(jí)（10-12）。l選擇性好，與能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)少有關(guān)。三、定量分析的特點(diǎn)及應(yīng)用三、定量分析的特點(diǎn)及應(yīng)用一、概念l（熒光）激發(fā)光譜l（熒光）發(fā)射光譜l原子發(fā)射光譜是在原子化過(guò)程中自然發(fā)射的譜線(xiàn) 而原子熒光光譜是用另一波長(zhǎng)的譜線(xiàn)去激發(fā)原子發(fā)出與自然發(fā)射