生化試驗設(shè)計PPT課件

1、最熟悉 而又最而又最陌生陌生 血紅蛋白血紅蛋白的分離、純化，鑒定的分離、純化，鑒定和定量和定量第1頁/共26頁試驗報告單試驗報告單實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒炘噭嶒灢襟E實驗結(jié)果臨床意義第2頁/共26頁實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?，掌握自主設(shè)計實驗的步驟與方法；2,血紅蛋白的分離、純化、鑒定和定量的方法；3,熟悉血紅蛋白分離提純的原理。第3頁/共26頁實驗原理血紅蛋白概況 血紅蛋白是紅細(xì)胞的主要成分，在正常情況下，每個紅細(xì)胞均含有一定量的血紅蛋白。血紅蛋白是由珠蛋白和亞鐵血紅素組成的結(jié)合蛋白質(zhì)。血紅蛋白除能與氧結(jié)合形成氧合血紅蛋白外，還能與某些物質(zhì)作用形成多種血紅蛋白衍生物。它們具有特定的色澤和吸光譜，在臨床上

2、，可用以診斷某些變性血紅蛋白血癥和血紅蛋白的定量測定。第4頁/共26頁實驗原理基本原理 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、吸附性質(zhì)、親和力、溶解度等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)第5頁/共26頁試驗原理試驗原理不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不一樣，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不一樣。凝膠電泳法原理凝膠色譜法原理透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留袋內(nèi)，以達(dá)到清除小分子雜質(zhì)的目的。透析法原理當(dāng)不同蛋白質(zhì)通過凝膠時相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠的內(nèi)部通道，而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法

3、進(jìn)入內(nèi)部通道只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。標(biāo)準(zhǔn)比色法原理在一定量的血液中，在一定量的血液中，血紅蛋白經(jīng)少量的鹽血紅蛋白經(jīng)少量的鹽酸的作用，使亞鐵血酸的作用，使亞鐵血紅素變成高鐵血紅素。紅素變成高鐵血紅素。呈現(xiàn)較穩(wěn)定的棕色，呈現(xiàn)較穩(wěn)定的棕色，用水稀釋后與標(biāo)準(zhǔn)色用水稀釋后與標(biāo)準(zhǔn)色比較，即可得出每比較，即可得出每100ml100ml血液中的含量血液中的含量第6頁/共26頁實驗試劑實驗試劑1、0.9%的氯化鈉溶液2、蒸餾水 3、有機溶劑（甲苯）4、磷酸緩沖液 5、檸檬酸鈉 6、凝膠色譜柱實驗所需用品7、SDS-PAGE實驗所需用品8、血紅蛋白計、0.

4、1mol/L鹽酸溶液、載玻片、刺血針第7頁/共26頁實驗步驟實驗步驟樣品處理a、洗滌紅細(xì)胞：在采血容器中加入適量檸檬酸鈉，取血后，進(jìn)行低速短時間離心，將離心后的血液靜置片刻，待分層明顯后，用膠頭吸管吸出上層黃色透明血漿，然后用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液洗滌，低速短時間離心，重復(fù)4-5次，直至上清液中沒有黃色，表明已洗凈。第8頁/共26頁實驗步驟實驗步驟樣品處理 b、血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原血液體積，再加40%體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘。第9頁/共26頁實驗步驟實驗步驟樣品處理 c、離心：將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10分鐘，

5、試管中的溶液會分為四層：最上層為無色透明的甲苯層；中上層為白色薄層固體的脂溶性物質(zhì)的沉淀層；中下層為紅色透明的血紅蛋白的水溶液層；最下層為暗紅色其他雜質(zhì)的沉淀層。第10頁/共26頁實驗步驟實驗步驟樣品處理 d、分離血紅蛋白溶液：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，在分液漏斗中靜置片刻后，分離出下層紅色透明液體。第11頁/共26頁粗分離 取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，pH為7.0，透析12小時，目的是除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)或用于更換樣品中的緩沖液。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。第12頁/共26頁純化a、凝膠色

6、譜柱的制作：取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。（注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。）組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。第13頁/共26頁b、凝膠色譜柱的裝填 凝膠的選擇：材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。 凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。 凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱

7、裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。 注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。第14頁/共26頁c、樣品加入與洗脫：調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。洗脫：小心加入pH=7.0 的2

8、0mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。第15頁/共26頁鑒定（SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳） 1，安裝垂直板電泳裝置第16頁/共26頁鑒定（SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳）2，制膠：，制膠：（分離膠和濃縮膠）（分離膠和濃縮膠）3，樣品預(yù)處理，樣品預(yù)處理上樣上樣第17頁/共26頁鑒定（SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳） 4，電泳 + 染

9、色 + 脫色第18頁/共26頁鑒定（SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳） 5，分析marker蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物的遷移率第19頁/共26頁血紅蛋白含量的測定血紅蛋白含量的測定 用滴管加0.1mol/L HCl于血紅蛋白稀釋管內(nèi)，到刻度10處。用刺血針刺破指尖采血，血滴宜大些。用血紅蛋白吸管的尖端接觸血滴，吸血至刻度20ul處（0.02ml）。用濾紙片或棉球擦凈吸管口周圍的血液，將吸管插入血紅蛋白稀釋管的鹽酸內(nèi)，輕輕吹出血液至管底部，反復(fù)吸入并吹出稀釋管內(nèi)上層的鹽酸，洗滌吸管多次，使吸管內(nèi)的血液完全洗入稀釋管內(nèi)。搖勻或用小玻璃棒攪勻后，放置10min，使鹽酸與血紅蛋白充分作用。 把

10、稀釋管插入標(biāo)準(zhǔn)比色架兩色柱中央的空格中，使無刻度的兩側(cè)面位于空格的前后方，便于透光和比色。 第20頁/共26頁 用滴管向稀釋管內(nèi)逐滴加入蒸餾水，邊滴邊攪拌邊觀察顏色，直至顏色與標(biāo)準(zhǔn)玻璃色柱相同為止。稀釋管上液面的刻度讀數(shù)即為每100ml血液血紅蛋白的克數(shù)。 第21頁/共26頁實驗結(jié)果 血紅蛋白參考值 成年男性：1.31.5g/L；成年女性：1.11.4g/L ；兒童：（依年齡而異）1.21.4g/L。第22頁/共26頁臨床意義 一般來說，在疾病狀況下，血紅蛋白的增減是與紅細(xì)胞的改變相平行的，即引起紅細(xì)胞增多的疾病，也會使血紅蛋白含量增加。使紅細(xì)胞減少的疾病，也使血紅蛋白含量減少。在貧血時，血液中的紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白濃度都有不同程度的下降，但不一定按相同的比例變化。有時紅細(xì)胞數(shù)量可以減少很多，而血紅蛋白的濃度的降低卻相對地不那么顯著，見于大細(xì)胞性貧血，由于單個紅細(xì)胞所含的血紅蛋白量較正常者為多。相反，也有的紅細(xì)胞減少得不很多，而血紅蛋白濃度卻顯著降低。