大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的幾種制備方法

1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的幾種制備方法感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells) ：常態(tài)的細(xì)胞不能攝入外部溶液中的DNA，所以要轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA進(jìn)入大腸桿菌必須首先制備感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞(competent cell) 。 轉(zhuǎn)化：是將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限

2、制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性?xún)?nèi)切酶和甲基化酶的突變株。 -互補(bǔ)現(xiàn)象：因?yàn)樵S多載體都帶有一個(gè)LacZ基因的調(diào)控序列和頭146個(gè)氨基酸的編碼信息，編碼-互補(bǔ)肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)（-互補(bǔ)）。當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)入可編碼?半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞中時(shí)，在異丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)下，宿主可同時(shí)合成這兩種肽段，雖然它們各自都沒(méi)有酶活性，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。所以稱(chēng)這種現(xiàn)象為-互補(bǔ)現(xiàn)象。由互補(bǔ)產(chǎn)生的-半乳糖苷酶(LacZ)能夠作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)而產(chǎn)生藍(lán)色的菌落，所以利用這個(gè)特點(diǎn)，在

3、載體的該基因編碼序列之間人工放入一個(gè)多克隆位點(diǎn)，當(dāng)插入一個(gè)外源DNA片段時(shí)，會(huì)造成LacZ()基因的失活，破壞-互補(bǔ)作用，就不能產(chǎn)生具有活性的酶。所以，有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒(méi)有重組質(zhì)粒的菌落為藍(lán)色。方法一：TSS方法制備感受態(tài)細(xì)菌（又稱(chēng)一步法）一、準(zhǔn)備工作1、緩沖液1×TSS的配制事先配制1M的氯化鎂：20.3g氯化鎂(6分子水結(jié)晶)，定容于100ml去離子水后封裝，不用滅菌。取干凈的100ml 量筒和100ml 燒杯，用量筒量取100ml去離子水，加入至燒杯中，取 1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化鈉，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，

4、5ml 的1 M氯化鎂，溶解后用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)整pH為6.5，混勻后用0.22um 濾器過(guò)濾除菌。儲(chǔ)存在4度，保質(zhì)期約6個(gè)月。2、已劃平板（或者用槍頭沾取并稀釋后涂布）并在培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)的菌種Dh5，用于接種并振蕩培養(yǎng)。兩個(gè)錐形瓶，分別裝有30 ml和50ml LB，滅菌后置于4冰箱備用。3、若干已滅菌的瓊脂平板，一個(gè)未加抗生素，用于第二步的接種，其余做轉(zhuǎn)化用。 二、感受態(tài)制備程序前一天晚上調(diào)單菌落至30 ml LB中過(guò)夜培養(yǎng)（12-16h），按1：100 比例將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液（500ul）加入到新鮮的50 ml LB培養(yǎng)液中，于37 振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4(培養(yǎng)時(shí)間2h4050

5、min)。冰浴30分鐘后4度1000g離心10min，棄上清，收獲細(xì)菌。加入原體積十分之一（這里為5 ml）的1× TSS 液(冰預(yù)冷)懸浮細(xì)胞，然后分裝成100l/份，全部冰上操作，-80保存。三、轉(zhuǎn)化取一管（100l）感受態(tài)細(xì)菌，（凍存細(xì)胞應(yīng)置于冰上緩慢融化后立即使用）加入3-5l DNA（0.1100ng），輕輕混勻后冰浴30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培養(yǎng)液，37度150r/min溫和振蕩培養(yǎng) 60min，涂布，室溫放置約20分鐘后放于37度恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)（17-20h）。方法二：CaCl2法細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法多以Mendel和Higa（1970）的發(fā)

6、現(xiàn)為基礎(chǔ)，其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽(yáng)離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化。 用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌。本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，且迅速、重復(fù)性好。1從37培養(yǎng)1620h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（如大腸桿菌DH5），或1ml新鮮的1620h過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中。于37劇烈振搖培養(yǎng)約23h（旋轉(zhuǎn)搖床200300r/min），每隔2030min測(cè)量OD600值0.4。 2在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置1020min。 3于4用Sorva

7、llGS2轉(zhuǎn)頭（或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭）以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞。 4倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。5以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上。6于4用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭（或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭）以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞。 7倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。8每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70貯存?zhèn)溆谩?用冷卻的無(wú)菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200l轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，每管加DNA

8、或連接反應(yīng)混合物（體積10l，DNA50ng），輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min。10將離心管放到預(yù)加溫到40的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s2min，不要搖動(dòng)試管。11快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻12min。12每離心管加800l SOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37，然后將管轉(zhuǎn)移到37搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。13將適當(dāng)體積（每個(gè)90mm平板可達(dá)200l）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/l MgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上。14將平板置于室溫至液體被吸收。15倒置平皿，于37培養(yǎng)，1216h后可出現(xiàn)菌落。方法三

9、： CAS super One-Step Competent Cell Preps Kit采用一種簡(jiǎn)單便捷的方法處理大腸桿菌，使其成為感受態(tài)細(xì)胞，便于質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化，可滿(mǎn)足一般實(shí)驗(yàn)的要求。與CaCl2法相比具有多種優(yōu)點(diǎn)：使用方便，只需一步即可完成感受態(tài)細(xì)胞的制備；轉(zhuǎn)化效率略高于CaCl2法，一般可達(dá)106-108cfu/g，滿(mǎn)足一般實(shí)驗(yàn)需要；感受態(tài)細(xì)胞制成后即可保存于-70，無(wú)須加入甘油，并且經(jīng)長(zhǎng)期保存活力無(wú)明顯下降。 一、準(zhǔn)備工作1 從液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌凍存菌，在LB平板上劃線(xiàn)，37過(guò)夜至長(zhǎng)出單菌落。挑形態(tài)飽滿(mǎn)的單菌落2個(gè)，分別接種5ml LB培養(yǎng)基中，37，250rpm，過(guò)夜

10、培養(yǎng)。2 次日從5ml LB培養(yǎng)物吸取200l轉(zhuǎn)入50ml LB培養(yǎng)基中（250ml 錐形瓶），37，250rpm培養(yǎng)2小時(shí)，此時(shí)OD600約0.40.5。二、感受態(tài)細(xì)胞的制備3 吸取1ml菌液到1.5ml離心管里，5000rpm離心5分鐘，棄去上清。 4 加入100l預(yù)冷的Solution A，懸浮菌體，冰浴30分鐘。 5 此時(shí)感受態(tài)細(xì)胞已經(jīng)制成可立即使用或-70保存。 三、細(xì)胞轉(zhuǎn)化6 在感受態(tài)細(xì)胞中加入100pg-10ng DNA，混勻，冰浴30分鐘，然后42 1分鐘熱擊，再次冰浴2 分鐘。加入0.9 ml LB 培養(yǎng)基，20l Solution B，37，振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。7 取適當(dāng)菌液（

11、100-200l）涂布相應(yīng)抗性的平板。8 過(guò)夜培養(yǎng)約16個(gè)小時(shí)，數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。補(bǔ)充說(shuō)明： 1 所用器具一定要清潔。2 操作步驟2 中培養(yǎng)基的裝量也是很重要的，建議裝量不要高于此值：500ml 錐形瓶裝100ml培養(yǎng)基，250ml錐形瓶裝50ml培養(yǎng)基。3 在收獲菌體前半小時(shí)還可以在培養(yǎng)基中加入20mM的MgCl2 ，效果會(huì)更好一些。4 為保證細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)后的菌體的OD值不要高于0.6。5 制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)所有操作盡量保證在冰上操作。6 細(xì)胞轉(zhuǎn)化操作步驟6中也可以不必進(jìn)行熱擊，冰浴后直接加入新鮮LB，簡(jiǎn)化操作 步驟，但轉(zhuǎn)化效率低于熱擊方法，適用于對(duì)轉(zhuǎn)化率要求不高的實(shí)驗(yàn)。 方法

12、四： CaCl2法1、取1%大腸桿菌E.coli接種于含2ml LB培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2、取0.1ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于含10ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37振蕩培養(yǎng)3h至OD600=0.3。 3、然后把培養(yǎng)物倒入1.5ml離心管中，冰浴10min。4、在4下以4000rpm離心5min，去上清液。5、把菌體懸浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min。6、然后再在4下以4000rpm離心10min，去上清液。7、將菌體懸浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。 方法五：1、將1ml過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌（如DH5、TG1、TM101）接種于100

13、ml 2×YT培養(yǎng)于500ml三角瓶。于37刷烈振蕩，通常200rpm培養(yǎng)的細(xì)菌密度約OD550=0.20.5(5×107cells/ml),需24h。2、將培養(yǎng)物放于冰上冷卻10min，于4離心細(xì)菌培養(yǎng)物，10000rpm離心10min。3、棄除上清，將細(xì)菌懸浮于原始培養(yǎng)體積的一半（約50ml）的50mM CaCl2和10mm TrisHCl（pH8.0）無(wú)菌冰預(yù)冷液體中。4、將細(xì)菌懸浮放在冰上約5min，然后將懸浮物于4 10000/rpm離心10min。5、棄上清，懸浮細(xì)菌于原始培養(yǎng)體積的1/15的50mM CaCl2和10mM TrisHCl（pH8.0）無(wú)菌冷凍中

14、。此時(shí)的細(xì)胞是感受態(tài)細(xì)胞，即可用于轉(zhuǎn)化。200l分裝于無(wú)菌的1.5ml微量離心管中，貯存于-80冰箱中。 方法六：TSB法1、藥品制備1M Mg2+ (1MMgSO4 和 1M MgCl2等體積混合)，用0.22um濾膜超濾除菌。TSB液（30mL/ 80mL菌液）（現(xiàn)配現(xiàn)用）： PEG33503gTryptone0.3gYeast extract0.15gNaCl0.3g以上 121, 15min 滅菌后，加入1MMg2+ 600uL , 以及DMSO 3mL。2、制備步驟（1）活化菌株 （2）挑單菌落培養(yǎng)于5mL的液體培養(yǎng)基中。（3）取液體培養(yǎng)物50uL于80mL的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)

15、。（4）370C培養(yǎng)3-4小時(shí)，OD600在0.4-0.6。（5）離心，去上清。（6）加入20mLTSB，重懸。（7）離心，去上清。（8）加入10mL TSB，再加入15-20%的甘油，分裝保存。注：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在冰上進(jìn)行；所用藥品均需滅菌。3、轉(zhuǎn)化程序（1）取出200l感受態(tài)細(xì)胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA或連接反應(yīng)混合物，DNA量通常50mg。用手指彈打試管10次，使之混勻，然后放在冰上4045min。 （2）將管放于42水浴中2min。（3）然后每管直接加入1.0ml2×YT培養(yǎng)基，倒置混勻，并于37培養(yǎng)812h，干浴或水浴，不需振搖。此期間使細(xì)菌生長(zhǎng)并開(kāi)始表達(dá)

16、抗菌素。（4）每200l轉(zhuǎn)化混合物分別于6個(gè)2×YT瓊脂培養(yǎng)板上補(bǔ)充相應(yīng)抗生素，并含有X-gal（20mg/ml）、IPTG（200mg/ml）。（5）鋪板使細(xì)菌混合物干后，倒轉(zhuǎn)平板放于3037培養(yǎng)箱中1822h?？寺≡诖似陂g應(yīng)該出現(xiàn)，否則轉(zhuǎn)化不成功。方法七：Inoue法制備超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞越干凈越好，越冷越好。1、將洗干凈的瓶子（500ml三角燒瓶）用Milli-Q水浸泡2-3小時(shí)，倒去燒瓶中的水并將燒瓶倒扣在吸水紙上2-3分鐘。用Milli-Q水配置250ml LB液體培養(yǎng)基。高壓滅菌。2、準(zhǔn)備兩盒1.5ml EP管，每盒中放置兩張吸水紙，共約兩百個(gè)。高壓滅菌。3、于早晨7-8點(diǎn)鐘

17、小搖菌種，挑取單菌落于5ml Milli-Q水配置且滅菌的LB液體培養(yǎng)基（無(wú)抗性）中，37培養(yǎng)12小時(shí)以上（OD600大于1.5）?？梢杂靡粋€(gè)新的50ml 進(jìn)口離心管（costa，BD等品牌都可以）來(lái)?yè)u細(xì)菌。4、晚上10點(diǎn)鐘左右，按1：100大搖細(xì)菌。超靜臺(tái)內(nèi)吸取2.5ml小搖細(xì)菌于高壓滅菌的250ml SOB培養(yǎng)基（無(wú)抗性）中， 18-22，200rpm搖過(guò)夜。5、第二天上午測(cè)量細(xì)菌OD600值。Top10, JM109等生長(zhǎng)速度快的細(xì)菌約在上午9點(diǎn)左右OD600達(dá)到0.55左右，DH5則要到下午4-6點(diǎn)鐘（可以多搖幾瓶細(xì)菌，梯度接菌，如1：50，1：100，1：200等）。6、將OD600

18、達(dá)到0.55的細(xì)菌置于冰上10min（OD600在0.4-0.8之間都可以，對(duì)結(jié)果影響不大）。7、4，4000rpm，10min集菌（用新的50ml 進(jìn)口離心管）。8、超靜臺(tái)內(nèi)棄上清，將管倒扣在事先滅好的吸水紙上，大力向下?lián)舸?，盡可能去掉剩余SOB(LB?)。9、每管倒入10ml 預(yù)冷的Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液，擰緊蓋子。在冰上來(lái)回滑動(dòng)重懸細(xì)菌（重懸的時(shí)間與向下?lián)舸虻牧Χ群蛠?lái)回滑動(dòng)的速度相關(guān)，這兩者與感受態(tài)效率沒(méi)有直接關(guān)系）。10、超靜臺(tái)內(nèi)向每管倒入約30ml 預(yù)冷的Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液，來(lái)回顛倒混勻。11、4，4000rpm，10min集菌。12、超靜臺(tái)內(nèi)棄上清，將管倒扣在事先滅好的吸水紙上（換

19、一張吧，別用剛才那張），大力向下?lián)舸颍M可能去掉剩余緩沖液。13、每管倒入10ml 預(yù)冷的Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液，擰緊蓋子。在冰上來(lái)回滑動(dòng)重懸細(xì)菌。 14、輕輕來(lái)回混勻（記住要輕輕）。置于冰上10min。 15、將冰浴的感受態(tài)細(xì)胞分裝到事先滅菌后并放到-20或4的EP管中，一個(gè)一個(gè)丟到液氮罐里，然后凍到-80（建議100l每管，傳說(shuō)液氮速凍可以提高5倍的感受態(tài)效率）。 感受態(tài)效率在108-107不等。方法八：大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備一、制備步驟1、將適合菌株（如XL1-Blue, DH5）置于LB或其他營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，在37下過(guò)夜培養(yǎng)。2、高溫滅菌大的離心瓶（250-500ml）。準(zhǔn)備幾瓶滅菌水（總量約1.5升），保存于冷凍室中以備重懸浮細(xì)胞用。3、轉(zhuǎn)移0.2-1ml過(guò)夜培養(yǎng)物至裝有500ml LB（或其