現(xiàn)代微生物學(xué)實驗指導(dǎo)

1、實驗一、微生物學(xué)基礎(chǔ)實驗實驗1. 鞭毛染色法及活菌活動性暗視野顯微鏡觀察【目的要求】1了解細菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色的方法，并了解鞭毛的形態(tài)特征。2學(xué)習(xí)暗視野顯微鏡操作技術(shù)。 【實驗器材】 菌種：枯草芽孢桿菌12d牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物，銅綠假單細胞菌12d牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物。 溶液和試劑：硝酸銀染色液、香柏油、二甲苯、0.01美蘭水溶液。 儀器和其他用品：酒精燈，載玻片，蓋玻片，顯微鏡，雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，接種環(huán)，小試管，燒杯，試管架，鑷子等?！净驹怼?細菌的鞭毛極纖細，直徑一般為0.1-0.2um，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法

2、，則在普通光學(xué)顯微鏡下也能看到它。 鞭毛染色的基本原理是：在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。 采用鞭毛染色法雖能觀察到鞭毛的形態(tài)、著生位置和數(shù)目，但此法既費時又麻煩。如果僅須了解某菌是否有鞭毛，可采用懸滴法或壓滴法直接在光學(xué)顯微鏡下檢查活細菌是否具有運動能力，以此來判斷細菌是否有鞭毛。此法較快速、簡便。壓滴法是將菌液滴在普通的載玻片上，然后蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。暗視野顯微鏡又叫暗場顯微鏡，是一種通過觀察樣品受側(cè)向光照射時所產(chǎn)生的散射光來分辨樣品細節(jié)的特殊顯微鏡。暗視野顯微鏡和一般的明視野顯微鏡區(qū)別

3、在于二者的聚光器不同，暗視野顯微鏡裝有一個中央遮暗的聚光器，使光線不能通過聚光器，而只能從聚光器四周邊及未遮暗的部位斜射到載玻片的標本上。因光線是斜射的，不能進入物鏡，故觀察的視野是暗的，而聚光器斜射到菌體上的光線，因光散射作用而使菌體發(fā)出亮光，反射到物鏡內(nèi)，這樣在顯微鏡中可見到暗視野中明亮的物像。暗視野顯微鏡主要用于檢查未染色標本的形態(tài)和運動能力。 【操作步驟】 1鞭毛染色（硝酸銀染色法） （1）載玻片制備：將載玻片用洗滌劑清洗干凈，置于95%乙醇中浸泡5min，使用時用鑷子取出在火焰上燒去乙醇及可能殘留的油跡。 （2）制片：在載玻片一端滴一滴清水，用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)物種蘸一兩下，再在清水中

4、蘸一兩下，然后傾斜玻片，使液體緩慢流向載玻片另一端，用吸水紙洗去多余液體，自然干燥。 （3）染色：滴加硝酸銀染液A液覆蓋菌面35min后用蒸餾水充分洗去A液。用硝酸銀染液B液洗去殘留水分后，再滴加B液覆蓋菌面4050秒，其間可用微火加熱，當菌面出現(xiàn)明顯褐色時，立即用蒸餾水沖洗，自然干燥。2、運動觀察（1）使用研究用暗視野顯微鏡，或?qū)⑵胀ü鈱W(xué)顯微鏡上的聚光器取下，換上暗場聚光器。 （2）不論是使用干燥物鏡還是油浸物鏡，鏡檢時都應(yīng)在聚光器的上透鏡上加一大滴香柏油。 （3）將制作好的細菌懸滴標本片置于載物臺上，上升聚光器至頂部使油與載玻片接觸。 （4）放大光源 。 （4）進行聚光器光軸調(diào)節(jié)及調(diào)焦。用

5、10*物鏡找到被檢物像，關(guān)小聚光器虹彩光圈至可在視野中看到視場光闌的輪廓，再上下緩慢調(diào)整聚光器，這樣會使視場光闌的像變得清晰，如視場光闌不在場中央，利用聚光器外側(cè) 的兩個調(diào)節(jié)鈕進行調(diào)整，當亮光點調(diào)到場中央后，再將其開大，即可進行觀察。 實驗2. 熒光原位雜交技術(shù)【目的要求】 通過實驗了解熒光原位雜交技術(shù)的基本原理和在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。掌握原位雜交技術(shù)的操作方法，熟練掌握熒光顯微鏡的使用方法 【基本原理】 熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是一個很重要的生物學(xué)實驗技術(shù)，它的特點是原位，無需經(jīng)過PCR，可以用于對環(huán)境樣品中特定的微生

6、物進行定量分析。下面是以活性污泥為例的FISH實驗步驟及方法。非生物學(xué)專業(yè)的同學(xué)請不要往下看了?！緦嶒炂鞑摹縔染色體探針、人外周血中期染色體細胞標本、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400、熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200L移液器、20L移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20。 【操作步驟】 1 載玻片涂層處理(1) 將載玻片置于鹽酸乙醇溶液（1%HCl in 70% Ethanol）中清洗(2) 晾干后放入poly-L-lysine(0.01%)溶液中5分鐘(3) 放入60烘箱60分鐘烘干或者放在室溫過夜晾干2樣品固定（Sample fixa

7、tion）(1) 在樣品（活性污泥）中加入3倍體積的4% 多聚甲醛，置于4冰箱固定3小時以上或者過夜(2) 離心，棄去多聚甲醛，加入相同體積的PBS(3) 離心，棄去PBS，加入相同體積的乙醇+PBS(w/w 1:1)(4) 固定后的樣品放入-20冰箱保存。3 脫水 （Dehydration）(1) 將適量固定后的樣品放在載玻片上，(2) 放入46烘箱烘干10分鐘(3) 依次浸入50%，80%，96%的乙醇溶液，各3分鐘(4) 在空氣中晾干4 雜交(1) 加10微升Hybridization buffer（配制方法見下面表格）到玻璃片的樣品上，盡量讓樣品全被覆蓋(2) 在Hybridizati

8、on buffer上加1微升探針（Probe）(3) 在50ml離心管中放一張潤濕的吸水紙，將玻璃片放入，然后一起放到46恒溫箱，雜交1.5小時(4) 將Washing buffer（配制方法見下面表格）預(yù)熱到48，準備下一步使用5沖洗(1) 雜交1.5小時之后，快速將玻璃片放入48Washing buffer(2) 在48恒溫箱中放置30min(3) 用超純水潤洗玻璃片，然后再空氣中晾干6鏡檢晾干后，將樣品用適量的antifading reagent 覆蓋，蓋上蓋玻片，然后就可以放到共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscopy）下觀察了。Hybridiz

9、ation buffer配制方法： Washing buffer配制方法：實驗3. 細菌化學(xué)趨向性測定【目的要求】 通過研究細菌運動方式，了解細菌的趨向性. 通過研究細菌的趨向性，了解細菌的生 活方式，有利于微生物的培養(yǎng)。 【實驗器材】 實驗儀器:基顯微鏡、培養(yǎng)皿、載玻片、鑷子、濾紙等。 試劑:瓊脂培養(yǎng)基、,細菌、NACL試劑等。 【基本原理】 某些細菌在一定的生長因子下快速生長繁殖;某些細菌在一定的特殊環(huán)境下,例如:光 照、一定的PH、一定的溫度下有利于生長.本實驗通過對照試驗對三種細菌進行在特殊因子下進行培養(yǎng),觀察細菌的運動趨勢,并作出明確判斷,細菌的化學(xué)趨向性。 【操作步驟】 1、取18

10、一24小時待檢菌培養(yǎng)物,用0.9%NaCL配成濁度達20麥氏單位的濃懸液。 2、將瓊脂溶化于0.9%的NACL溶液中,制成0.6%的瓊脂基。 3、將此半固休瓊脂溶化,冷卻,待冷至40一50時,在3ml瓊脂基中加入3 ml待檢菌懸液,混勻,注入小培養(yǎng)皿中。 4、冷凝后在驚脂表面滴一滴5不同濃度的化學(xué)趨向性試驗物質(zhì),并在另一部位滴加等量0.9%NaCI作為對照。 5、37孵育1小時,檢查滴加試驗物質(zhì)部分濁度變化。濁度增加為陽性趨化性,局部透亮為陰性趨化性。再用配有測微器的顯微鏡測是濁度變化區(qū)的直徑。 6、也可用直徑1mm的濾紙片,用試驗物溶液潤濕,并貼敷于驚脂基表面,觀察結(jié)果(標準同上)此類紙片于

11、37干燥后,在4可長期保存。 以類鼻疽桿菌,綠膿桿菌,霍亂弧菌各一株作為試驗菌。結(jié)果類鼻疽桿菌和綠膿桿菌對。.IML一精氨酸,。.IM DL一顆氨酸,0.IML一異亮氨酸等都有陽性趨化作用。類奧疽桿菌對。.IML一半朧氨酸有陽性趨化作用。 7、實驗結(jié)果及預(yù)測 通過實驗對照可以證明細菌的趨向性。實驗二、分子生物學(xué)技術(shù)在微生物學(xué)中的應(yīng)用實驗1. 土壤微生物總DNA提取【目的要求】 學(xué)習(xí)從土壤微生物中提取總DNA并純化的方法?！緦嶒炂鞑摹?TENP緩沖液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)、PBS緩沖液(

12、137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)、DNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)、蛋白酶K(25 mg/mL)、溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)、20% SDS、氯仿、異戊醇、異丙醇、70%乙醇、RNAse 20 mg/mL、QIAX大片段凝膠回收試劑盒(Qiagen)50mL、1.5 mL離心管、搖床、高速離心機、水浴鍋、電泳槽、電

13、泳儀、渦旋儀、土壤樣品【操作步驟】 1. 總DNA提?。?1) 取2 g土樣，置于50mL滅菌的離心管中；(2) 加入10 mL TENP緩沖液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)懸浮土樣，200轉(zhuǎn)搖床振蕩10min充分混勻；(3) 10 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌多次至上清基本為無色；(4) 用5 mL PBS緩沖液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)漂洗一

14、次；(5) 沉淀加入13.5 mL DNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)，混勻后加入100 L蛋白酶K(25 mg/mL)和200 L溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)，37水浴30 min，每隔10 min顛倒混勻；(6) 加入2 mL 20% SDS，65水浴2 h，每隔20 min顛倒混勻；(7) 8 000 r/min室溫離心15 min，取上清，用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次；(8) 水相中加入0.6倍體積的異丙醇，4沉淀過

15、夜；(9) 11 000 r/min 4離心20 min收集DNA沉淀；(10) 70%乙醇漂洗兩次，干燥后用100 L ddH2O(含RNAse 20 mg/mL)溶解，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管。2. 總DNA純化：(1) 配制0.8%瓊脂糖凝膠；(2) 每個上樣孔加入50 L粗DNA，進行低電壓長時間電泳(4, 25 V, 8 h)；(3) 電泳結(jié)束后，切下主帶所在的凝膠(膠的體積盡可能小)；QIAX大片段凝膠回收試劑盒(Qiagen)回收：加入3倍體積的Buffer QX及適量的QIAX(Glassmilk)，55溫浴10 min，每隔2 min輕輕用手指彈起沉淀(回收大片段時不要渦旋)，

16、待凝膠完全溶解，12 000 g離心1 min，棄上清；再加入500 L Buffer QX洗滌沉淀1次以消除剩余凝膠；再用500 L Buffer PE洗滌沉淀2次，將沉淀晾干，加入適當體積的ddH2O，離心后收集上清，瓊脂糖凝膠電泳確定回收效率。實驗2. 菌落PCR【目的要求】學(xué)習(xí)菌落pcr方法，比較菌落PCR和常規(guī)PCR差別。 【基本原理】 菌落PCR可不必提取基因組DNA，不必酶切鑒定，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增，省時少力。建議使用載體上的通用引物。通常利用此方法進行重組體的篩選或者DNA測序分析。最后的PCR產(chǎn)物大小是載體通用引物之間的插入片斷大小。菌落PC

17、R與我們通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以單個菌作為模板。是一種可以快速鑒定菌落是否為含目的質(zhì)粒的陽性菌落。操作簡單，快捷，陽性率較高，在轉(zhuǎn)化鑒定中較常見。【操作步驟】 1、PCR混合液的制備Taq buffer（10×） 180uldNTP（2.5 mM） 2025 ulPrimer Forward（引物濃度在10Pmol） 5 ulPrimer Reverse（引物濃度在10Pmol） 5 ulddH2O 147 ulTaq（2U/ul） 1215 ul2、常溫下隨機挑選轉(zhuǎn)化板上的轉(zhuǎn)化子，用滅菌的牙簽或槍頭挑取單個菌落（強調(diào)單個，不能是雙克?。?，在LB瓊脂糖平板上輕點，做

18、一拷貝；然后將沾有菌體的牙簽或槍頭置于相應(yīng)的裝有PCR管中或者96空pcr反應(yīng)板（管子做好記號，如平板上點的是1#，則管子上也標1#，以便篩選到克隆后的擴到培養(yǎng)），挑好單克隆菌落后將之前配制好的PCR混合液加入體系是30ul。3、將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中，按常規(guī)條件擴增。4、將擴增出來的反應(yīng)液中加入溴酚藍或是其他染料，電泳檢測是否得到目的片斷。如有則為陽性克隆。5、將已經(jīng)接種有菌落的平板置37培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，使菌落擴增；次日挑選陽性克隆做進一步篩選或培養(yǎng)。步驟2也可以不點板，直接接種搖菌，如果早上做PCR的話，下午就可以提質(zhì)粒，得到重組載體。注意事項：設(shè)計引物很關(guān)鍵。一般如果是定

19、向克隆，用載體上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克?。ㄈ鐔蚊盖谢蚱侥┒诉B接），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑒定了，而且錯誤概率很低。PCR條件的選擇接近最佳，同時挑取的菌體不宜太多，否則會有非特異性擴增。使用的引物濃度不能太高，濃度過高會導(dǎo)致非特異性擴增，反應(yīng)的循環(huán)數(shù)也不能太多，一般不超過25個。同時因為擴增的片段的GC含量問題，有的GC含量很低，有的又很高，導(dǎo)致菌落PCR不容易擴增出目的條帶，在此建議在設(shè)置PCR程序時以高GC的溫度為上限，每一循環(huán)降0.2度左右。實驗3. 16S rDNA序列分析鑒定【目的要求】1. 了解PCR 反應(yīng)

20、的基本原理和應(yīng)用2. 學(xué)習(xí)PCR的基本實驗方法【實驗器材】 【操作步驟】 1. 模板DNA的提取1）挑取單菌落接種至50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，28、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h； 2）取1.5 mL培養(yǎng)物離心，12000 r/min、1 min收集菌體，加入STE緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使之重懸，再次離心，菌體重懸于1 mL STE溶液中； 3）加入100 mg/mL溶菌酶溶液1 L（終濃度為100 g/mL），37保溫1 h2 h； 4）加入1/10體積10% SDS溶液，混合均勻，靜置片刻，6065水浴，不超過10 min； 5）加入1/10體積5 mol/L NaCl，至終濃度

21、為1 mol/L，充分混勻； 6）加入等體積的Tris平衡酚，混勻，12000 r/min離心5 min，取上清于另一潔凈離心管中，重復(fù)操作一次； 7）上清液中加入等體積的氯仿，混勻，離心12000 r/min、5 min，取上清于另一個潔凈的離心管中； 8）加入2倍體積的無水乙醇沉淀，-20靜置30 min以上，離心，12000 r/min、 5 min； 9）70%乙醇洗滌2次，室溫晾干； 10）冷凍抽干，于-20保存?zhèn)溆谩?2. 16S rDNA的PCR擴增以提取的各菌株的DNA為模板，采用通用引物P0（5-GAGTTTGATCMTGGCTCAG -3）和PC3（5-CTAHAGGGTA

22、TCTAATCCT-3），擴增各菌株的16S rDNA序列，PCR 反應(yīng)體系見表9.1。表7-1 PCR反應(yīng)體系的配制 反應(yīng)物 加入體積（L） 終濃度 10×Buffer（含MgCl2） 2.5 1× dNTP（10 mmol/L） 2.5 1 mol/L P0 （100 mmol/L） 0.75 3 mol/L PC3（100 mmol/L） 0.75 3 mol/L 模板DNA 1.0 1 g Taq酶 0.25 ddH2O 補加到總體積25 L PCR程序為：94預(yù)變性3 min，94變性1 min，45復(fù)性1 min，72延伸1 min，循環(huán)30次，72延伸8 mi

23、n，4保溫3 min。PCR擴增結(jié)果，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。3. PCR產(chǎn)物的純化及序列分析PCR產(chǎn)物按Omega Bio-Tek公司試劑盒操作方法純化后，寄給北京奧科生物技術(shù)有限公司或上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測序，測序引物為P0、PC3。將序列結(jié)果提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫（http：//BLAST） 中搜索比對。實驗4. 酶切與連接技術(shù) 【目的要求】 1、 將成功擴增出所需基因片段的PCR產(chǎn)物純化回收，除去DNA以外的雜質(zhì)，如蛋白（酶）、 RNA等，得到高質(zhì)量的DNA用于后續(xù)實驗。 2、 將純化好的DNA和表達型載體分別酶切后連接，

24、用于后續(xù)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。 【實驗器材】 選擇克隆載體多克隆位點上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，識別特定位點并切割DNA產(chǎn)生粘性末端或平端的外源片段，經(jīng)DNA的純化處理后在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實現(xiàn)外源片段的克隆。 粘性末端連接，DNA片段兩端的互補堿基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內(nèi)切酶消化DNA可產(chǎn)生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復(fù)原樣，有些限制性內(nèi)切酶雖然識別不同順序，卻能產(chǎn)生相同末端。平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產(chǎn)生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高。 【基本原理】 【操作步驟】 1、PC

25、R產(chǎn)物回收 （1）于PCR產(chǎn)物中加入其兩倍體積的Binding Buffer，即80ul。然后轉(zhuǎn)入2ml的收集管中（帶柱子），13000r，1min，離心，棄去收集管中濾液。 （2）加Binding Buffer 300ul，13000r，1min，離心，棄去收集管中濾液，此時DNA掛于柱子上。 （3）加Wash Solution 700ul，13000r，1min，離心，棄去收集管中濾液。 （4）重復(fù)步驟（3），此時已把DNA以外的雜質(zhì)洗脫完畢。 （5）將柱子裝入1.5ml的EP管中，加50ul，60的水洗脫DNA，13000r，1min，離心。 2、將回收所得產(chǎn)物酶切 （1）上游引物：Nc

26、ol 下游引物：Xhol 適應(yīng)溫度：37Buffer4 50ul體系： Ncol：0.5ul Xhol：0.5ul 10xBuffer4：5ul DNA片段：44ul 放入37水浴鍋酶切2.5小時。 （2）所得酶切產(chǎn)物按上述純化方法再次純化回收。 3、將DNA片段與載體連接 (1)20ul體系： 10xBuffer：2ul T4連接酶：2ul 載體：2ul DNA片段：14ul放入37溫箱過夜。 （2）回收所得連接產(chǎn)物。實驗5. 瓊脂糖凝膠電泳技術(shù) 【目的要求】 通過本實驗學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)【基本原理】 瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的常用方法。DNA分子在瓊脂

27、糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。不同濃度瓊脂糖凝膠可以分離從200bp至50kb的DNA片段。在瓊脂糖溶液中加入低濃度的溴化乙錠（ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以檢出 10ng的DNA條帶，在電場中，pH8.0條件下，凝膠中帶負電荷的DNA向陽極遷移。瓊脂糖凝膠有如下特點：(1) DNA的分子大小 在凝膠基質(zhì)中其遷移速率與堿基對數(shù)目的常用對數(shù)值成反比，分子越大遷移得越慢。 (2) 瓊脂糖濃

28、度 一個特定大小的線形DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率(u)的對數(shù)與凝膠濃度(t)成線性關(guān)系。 (3) 電壓 低電壓時，線狀DNA片段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。 (4) 電泳溫度 DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳行為受電泳時的溫度影響不明顯，不同大小的DNA片段其相對遷移速率在4與30之間不發(fā)生明顯改變，但濃度低于0.5%的凝膠或低熔點凝膠較為脆弱，最好在4條件下電泳

29、。 (5) 嵌入染料 熒光染料溴化乙錠用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料嵌入到堆積的堿基對間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA,使其剛性更強,還會使線狀遷移率降低15%。 (6) 離子強度 電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠，電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴重時會引起凝膠熔化。對于天然的雙鏈，常用的幾種電泳緩沖液有TAE、TBE等，一般配制成濃縮母液，室溫保存，用時稀釋?！緦嶒炂鞑摹?1. 恒溫培養(yǎng)箱 2. 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 3. 高壓滅菌鍋 4. 紫外線透射儀

30、 1.三羥甲基氨基甲烷（Tris） 2.硼酸 3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.溴酚藍 5.蔗糖 6.瓊脂糖 7.溴化乙錠 8.DNA marker 9.DNA樣品【操作步驟】 1.緩沖液的配制 5×TBE(5倍體積的TBE貯存液) 配1000ml 5×TBE:Tris 54g硼酸 27.5g0.5mol/l EDTA20mlPh8.0 凝膠加樣緩沖液(6×)溴酚藍 0.25%蔗糖 40%溴化乙錠溶液(EB) 0.5g/ml2.制備瓊脂糖凝膠 按照被分離DNA的大小,決定凝膠中瓊脂糖的百分含量?？蓞⒄障卤恚?瓊脂糖凝膠濃度線性DNA的有效分離范圍0.3%5-60 kb0.6%1-20 kb0.7%0.8-10 kb0.9%0.5-7kb1.2%0.4-6kb1.5%0.2-4kb2.0%0.1-3kb3.膠板的制備(1) 用高壓滅菌指示紙帶將洗靜、干燥的玻璃板的邊緣（或電泳裝置所皿備的塑料盤的開口）封住，形成一個膠膜（將膠膜放在工作臺的水平位置上，用水平儀校正）。(2) 配制足夠用于灌滿電泳