講義2 基因診斷

1、 基因診斷基因診斷Gene Diagnosis 疾病的根本原因: 疾病的各種表型的改變 是基因的改變?cè)斐傻幕蛟\斷基因診斷: 采用分子生物學(xué)的技術(shù)方法分子生物學(xué)的技術(shù)方法來(lái)分析受檢者的某一特定基因的結(jié)構(gòu)某一特定基因的結(jié)構(gòu)(DNA(DNA水平水平) )或功能功能(RNA(RNA水平水平) )是否異常，以此來(lái)對(duì)相應(yīng)的疾病進(jìn)行診斷。是病因的診斷。是病因的診斷。 檢查基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)和檢查基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過(guò)程。疾病作出診斷的方法和過(guò)程?；蛟\斷(Gene Diagnosis)的含義基因診斷的原理1、基因診斷的原理：DNA診斷-檢測(cè)相關(guān)基

2、因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)功能是否正常。RNA診斷-對(duì)表達(dá)產(chǎn)物mRNA質(zhì)和量表 達(dá)的分析。第一節(jié)第一節(jié) 基因診斷的技術(shù)方法基因診斷的技術(shù)方法一、基因診斷中常用的分子生一、基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)物學(xué)技術(shù) 核酸分子雜交核酸分子雜交 PCR SSCP（PCR-SSCP） 限制酶酶譜分析限制酶酶譜分析 DNA序列測(cè)定序列測(cè)定 DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù)印跡技術(shù)的類(lèi)別及應(yīng)用印跡技術(shù)的類(lèi)別及應(yīng)用（一）（一）DNA印跡技術(shù)印跡技術(shù) (Southern blotting) 用于基因組用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。的分析。(不僅可以檢出特異的不僅可以檢出特異的DNA片段，而且能進(jìn)行定片段

3、，而且能進(jìn)行定位和測(cè)定分子量，可用于基因的酶切圖譜分析、基因突變分位和測(cè)定分子量，可用于基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等析等)（二）（二）RNA印跡技術(shù)印跡技術(shù) (Northern blotting) 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析（三）蛋白質(zhì)的印跡分析 (Western blotting) 用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。 Southern 印跡雜交用于基因探測(cè)的基本過(guò)程印跡雜交用于基因探測(cè)的基本過(guò)程 Southern印跡雜交常用于探測(cè)印跡雜交常用于探測(cè)DNA的限制性內(nèi)切的限制性內(nèi)切酶圖譜。通過(guò)檢測(cè)某個(gè)體特定基因及旁

4、側(cè)區(qū)域限制性酶圖譜。通過(guò)檢測(cè)某個(gè)體特定基因及旁側(cè)區(qū)域限制性內(nèi)切酶圖譜的變化，可判斷是否發(fā)生了明顯的內(nèi)切酶圖譜的變化，可判斷是否發(fā)生了明顯的DNA突變。具體方法圖示如下突變。具體方法圖示如下：組織或細(xì)胞 含已知基因的重組質(zhì)粒菌株 基因組DNA 質(zhì)粒DNA 限制酶酶解及電泳分離 限制酶酶解及電泳分離回收含已知基因的DNA片段 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或尼龍膜 標(biāo)記的探針 預(yù)雜交雜交 洗膜 放射自顯影 圖圖 用用Southern 印跡雜交方法進(jìn)行基因診斷的基本步驟印跡雜交方法進(jìn)行基因診斷的基本步驟 三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較分子雜交實(shí)驗(yàn)分子雜交實(shí)驗(yàn)?zāi)磕?錄錄放放射射自自顯顯影影照照片片目目 錄錄核

5、酸分子雜交核酸分子雜交制備樣品制備樣品制備探針制備探針雜交雜交檢測(cè)檢測(cè)獲得滿意的高特異性雜交的關(guān)鍵是獲得滿意的高特異性雜交的關(guān)鍵是控制好雜交條件和雜交后沖洗條件控制好雜交條件和雜交后沖洗條件獲得滿意的高特異性雜交的關(guān)鍵是控制好雜交條件和獲得滿意的高特異性雜交的關(guān)鍵是控制好雜交條件和雜交后沖洗條件。雜交雙鏈的穩(wěn)定程度主要由其雜交后沖洗條件。雜交雙鏈的穩(wěn)定程度主要由其Tm值（熔解溫度）決定。影響雜交雙鏈值（熔解溫度）決定。影響雜交雙鏈Tm值的因素包值的因素包括以下幾個(gè)方面：括以下幾個(gè)方面：1)雜交雙鏈的堿基組成。GC含量越高，Tm越高。2)雜交雙鏈的長(zhǎng)度。越長(zhǎng)，Tm越高。3)雜交雙鏈的堿基錯(cuò)配程度

6、。錯(cuò)配程度越低，Tm越高。4)溶液中的離子強(qiáng)度。離子強(qiáng)度越高，Tm越高。5)變性劑（如常用的甲酰胺）的影響。甲酰胺濃度越高，Tm越高。 在液相體系中，完全配對(duì)的核酸雙鏈的Tm值可以下列公式估計(jì)： DNA/DNA Tm(0C)81.5 + 0.41(G-C)% + 16.6logM 0.63甲酰胺(%) 600/LDNA/RNATm(0C)79.8 + 0.58(G-C)% + 18.5logM + 11.8(G-C)%2 0.50甲酰 胺(%) 820/LRNA/RNATm(0C)79.8 + 0.58(G-C)% + 18.5logM + 11.8(G-C)%2 0.35甲酰胺(%) 820

7、/L寡聚核苷酸Tm(0C)2（AT堿基對(duì)數(shù)） 4（GC堿基對(duì)數(shù)） （適用于1030bp）Tm(0C)81.5 + 0.41(G-C)% + 16.6logM600/L （適用于1470bp） 其中M為單價(jià)陽(yáng)離子（通常為Na+）濃度, L為雜交雙鏈的長(zhǎng)度，以堿基對(duì)計(jì)算。這些公式適用于0.010.4mol/L Na+濃度及3075GC。 在無(wú)變性劑存在的條件下，最適雜交發(fā)生在比DNA/DNA Tm低20250C，比DNA/RNA Tm 低10150C。 在固液體系中，雜交條件對(duì)雜交雙鏈Tm值的影響更為復(fù)雜，一般低于按上述公式得到的計(jì)算值。(二二) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)5 Primer 15

8、 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 （1 1）、基本工作原理）、基本工作原理目目 錄錄Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。萬(wàn)倍以上。目目 錄錄n模板模板DNAn 特異性引物特異性引物n耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ （2 2）、）、PCRPCR體系基本組成成分體系基本組成成分（3 3）、）、PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性95C延伸延伸72C退火

9、退火Tm-5C（三）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（三）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP) 分析分析PCR和單鏈構(gòu)象多態(tài)性和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single stranded conformation polymorphism, SSCP) 分析分析 把把 PCR后獲得的雙股后獲得的雙股DNA加熱變性后形成單鏈加熱變性后形成單鏈DNA，相同長(zhǎng)度的相同長(zhǎng)度的DNA單鏈由于堿基順序不同，它們?cè)谥行跃郾﹩捂溣捎趬A基順序不同，它們?cè)谥行跃郾０纺z中可有不同的構(gòu)象而導(dǎo)致電泳速度的不同，這種現(xiàn)酰胺凝膠中可有不同的構(gòu)象而導(dǎo)致電泳速度的不同，這種現(xiàn)象稱為單鏈構(gòu)象多態(tài)性。象稱為單鏈構(gòu)象多態(tài)性。 PCR產(chǎn)物變性后經(jīng)由產(chǎn)物變性后經(jīng)由

10、SSCP分析，可能有效的檢出分析，可能有效的檢出DNA順順序變異。不是所有的核苷酸序列改變都引起可檢測(cè)的單鏈構(gòu)序變異。不是所有的核苷酸序列改變都引起可檢測(cè)的單鏈構(gòu)象改變，因此象改變，因此SSCP方法并不能鑒別所有的突變。方法并不能鑒別所有的突變。PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正常基因和變異基因的遷移位置不同，可分析確定致病基因的存在。 四、限制酶酶譜分析四、限制酶酶譜分析基因突變導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的丟失或相對(duì)位基因突變導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的丟失或相對(duì)位置發(fā)生改變置發(fā)生改變 以此酶消化待測(cè)以此酶消化待測(cè)DNA和野生型對(duì)照和野生型對(duì)照DNA，通

11、過(guò)比，通過(guò)比較二者的酶切片段，的長(zhǎng)度，數(shù)量上的差異就可較二者的酶切片段，的長(zhǎng)度，數(shù)量上的差異就可判斷待測(cè)判斷待測(cè)DNA的突變情況。的突變情況。 DNA序列測(cè)定序列測(cè)定 是進(jìn)行基因突變檢測(cè)的最直接、最準(zhǔn)確的方法。不僅是進(jìn)行基因突變檢測(cè)的最直接、最準(zhǔn)確的方法。不僅可確定突變的部位，而且可確定突變的性質(zhì)。可確定突變的部位，而且可確定突變的性質(zhì)。 分子克隆到分子克隆到T載體上，或直接對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。載體上，或直接對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。 DNA芯片芯片(DNA chip) cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指將許多特定的是指將許多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固

12、定于單位段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上面積的支持物上 。（六）（六） DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù)基因芯片基因芯片(gene chip)目目 錄錄二、基因診斷的基本方法二、基因診斷的基本方法基因變異致病的類(lèi)型：基因變異致病的類(lèi)型：1. 內(nèi)源基因的變異內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)的突變基因結(jié)構(gòu)的突變點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、異位、點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、異位、基因擴(kuò)增，基因擴(kuò)增，基因表達(dá)異?；虮磉_(dá)異常mRNA剪接異常剪接異常2. 外源基因的插入外源基因的插入基因突變的診斷基因突變的診斷1.點(diǎn)突變的診斷點(diǎn)突變的診斷診斷已知的點(diǎn)突變?cè)\斷已知的點(diǎn)突變 （PCR/ASO） ASO alle

13、le specific oligonucleotide等位基因特異性寡核苷酸探針等位基因特異性寡核苷酸探針突變堿基置探針中央突變堿基置探針中央控制雜交條件控制雜交條件 結(jié)果分析：結(jié)果分析：A TC G 探針定位 正常 C T (純合子) C T C G C A(雜合子) （新突變） （新突變）診斷未知的突變?cè)\斷未知的突變 PCR/SSCP/測(cè)序測(cè)序DNA芯片技術(shù)（大規(guī)模未知突變的篩芯片技術(shù)（大規(guī)模未知突變的篩查）查）N 4n1.28平方平方cm 16000個(gè)寡核苷酸個(gè)寡核苷酸 2 .大片段丟失或插入的診斷大片段丟失或插入的診斷外側(cè)確定有無(wú)缺失及缺失片斷的相對(duì)大小外側(cè)確定有無(wú)缺失及缺失片斷的相對(duì)

14、大小內(nèi)側(cè)確定缺失部位內(nèi)側(cè)確定缺失部位.多態(tài)性連鎖分析多態(tài)性連鎖分析DNA多態(tài)性多態(tài)性在同種生物不同個(gè)體的在同種生物不同個(gè)體的基因組中，常存在一些不影響基因功基因組中，常存在一些不影響基因功能的能的DNA順序變異，稱為順序變異，稱為DNA多態(tài)性多態(tài)性（polymorphism）DNA多態(tài)性標(biāo)記多態(tài)性標(biāo)記1. 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism, RFLP)2. 短串聯(lián)重復(fù)序列（短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandom repeat, STR）3. 單核苷酸多態(tài)性（單核苷酸多態(tài)性（single nucleot

15、ide polymorphism, SNP）1.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）DNA酶切酶切Southern雜交分析雜交分析DNAPCR 酶切酶切電泳分析電泳分析2.由串聯(lián)重復(fù)順序?qū)е碌拈L(zhǎng)度多態(tài)性由串聯(lián)重復(fù)順序?qū)е碌拈L(zhǎng)度多態(tài)性STR含有較高的信息量且容易檢測(cè)含有較高的信息量且容易檢測(cè)STR由由26個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)組成，微衛(wèi)星個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)組成，微衛(wèi)星DNA基因表達(dá)異常的診斷基因表達(dá)異常的診斷1.mRNA的相對(duì)定量分析的相對(duì)定量分析斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交RTPCR2.mRNA的絕對(duì)定量分析的絕對(duì)定量分析RTPCR/競(jìng)爭(zhēng)性競(jìng)爭(zhēng)性PCR(50bp標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)cDNA已知濃度已知濃度)

16、3.mRNA長(zhǎng)度分析長(zhǎng)度分析Northern雜交雜交/ RTPCR產(chǎn)物電泳產(chǎn)物電泳 外源外源DNA檢測(cè)檢測(cè) 核酸分子雜交核酸分子雜交 PCR技術(shù)技術(shù) 許多病原體的基因結(jié)構(gòu)已被闡明，設(shè)計(jì)基因特異性探許多病原體的基因結(jié)構(gòu)已被闡明，設(shè)計(jì)基因特異性探針，或合成特異的寡核苷酸引物，可直接從臨床標(biāo)本針，或合成特異的寡核苷酸引物，可直接從臨床標(biāo)本中檢測(cè)病原體基因組核酸中檢測(cè)病原體基因組核酸(DNA或或RNA)的存在，即可的存在，即可早期、快速、敏感、特異地確定病原體的存在。早期、快速、敏感、特異地確定病原體的存在。第二節(jié)第二節(jié) 基因診斷的應(yīng)用基因診斷的應(yīng)用1、遺傳疾病2、感染性疾?。?）病毒性感染（2）細(xì)菌

17、性感染（3）寄生蟲(chóng)（4）其他3、惡性腫瘤4、法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（1）DNA指紋分析（DNA fingerprinting）（2）短串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性分析（short tandem repeat，STR）一、遺傳性疾病一、遺傳性疾病 Hb D Punjab血紅蛋白病血紅蛋白病 121位位co密碼子由密碼子由GAA突變位突變位CAA，該突變導(dǎo)致限制酶，該突變導(dǎo)致限制酶EcoR1位點(diǎn)消失（位點(diǎn)消失（GAATTC） 鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥：鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥： 第六位密碼由第六位密碼由GAG突變成突變成GTG,導(dǎo)致不能被導(dǎo)致不能被OxaN1酶切酶切Mst酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5 3 正?；蛘；?

18、 3 突變基因突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析OxaN10.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突變攜帶著突變攜帶著患者患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析 遺傳性疾病遺傳性疾病-DMD的分子診斷的分子診斷杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchene muscular dystrophy,DMD）X染色體連鎖隱性遺傳性肌肉疾病,發(fā)病率為1/3 500個(gè)男孩，是 一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X染色 體連鎖的遺 傳性疾病。DMD基因位于Xp21.2-21.3，全長(zhǎng)2400Kb

19、 DMD基因的突變導(dǎo)致抗肌萎縮蛋白dystrophin缺陷DMD基因外顯子缺失的檢測(cè)二、感染性疾病基因二、感染性疾病基因診斷的策略診斷的策略1.針對(duì)病原體特異的核酸序列設(shè)計(jì)探針針對(duì)病原體特異的核酸序列設(shè)計(jì)探針進(jìn)行雜交進(jìn)行雜交2.應(yīng)用應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增病原體基因保守序技術(shù)擴(kuò)增病原體基因保守序列列3.核酸雜交技術(shù)與核酸雜交技術(shù)與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷 20032003年年4 4月，香港研究者月，香港研究者PeirisPeiris等報(bào)等報(bào) 告了告了50 50 例例SARSSARS病人的臨床表現(xiàn)和病人的臨床表現(xiàn)和 病毒學(xué)研究結(jié)果證明，新冠狀病毒病毒學(xué)研究結(jié)果證明，

20、新冠狀病毒 可能是可能是SARSSARS的致病原因。的致病原因。 （Lancet, 2003, 361: 9365)Lancet, 2003, 361: 9365) 其它實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)得出相同結(jié)論。其它實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)得出相同結(jié)論。 2003年4月，德國(guó)漢堡Bernhard- Nocht熱帶醫(yī)學(xué)研究所學(xué)者 Drosten 等用隨機(jī)擴(kuò)增技術(shù)，獲得長(zhǎng)度為 300 bp的核苷酸序列。 根據(jù)這段序列，建立了檢測(cè)新冠狀 病毒的常規(guī)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。（.org on April 10, 2003）引物和探針 BNIoutS2-BNIoutAs BNI-1片段，189 bp BNIinS-BNIinAs BNI-

21、1片段的內(nèi)套片段，108bp BNITMSARS1BNITMSARAs2 BNITMSARP(熒光素標(biāo)記的探針） 產(chǎn)物長(zhǎng)度：77 bp 檢測(cè)標(biāo)本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺 泡灌洗液 、血漿、糞便。 檢測(cè)方法 逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR 討 論 疾病的早期即可獲得陽(yáng)性結(jié)果（早 于血清轉(zhuǎn)換期）。 特異性較高（SARS患者中的陽(yáng)性 率約為80%，對(duì)照中的陰性率約為 98%100%）。 現(xiàn)有的方法敏感性較差，陰性結(jié)果 不能排除病毒感染。討 論痰液中病毒RNA濃度極高，說(shuō)明病毒從呼吸道 排放是主要傳播途徑。血清中檢測(cè)到極低濃度的病毒RNA，提示病毒 復(fù)制不僅發(fā)生于呼吸道。病人恢復(fù)晚期的糞便中存在病毒RNA

22、，說(shuō)明糞 便可能也是一種傳播途徑。鼻、咽拭子中含有的病毒RNA顯著少于痰液， 提示不適合作為標(biāo)本（有可能漏檢）。三、腫瘤的基因診斷三、腫瘤的基因診斷 腫瘤是由于遺傳物質(zhì)（腫瘤相關(guān) 基因）發(fā)生突變而導(dǎo)致的疾病。 腫瘤相關(guān)基因的突變只是增加了 個(gè)體對(duì)腫瘤的易感性而并不一定 馬上產(chǎn)生腫瘤， 腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟 的過(guò)程。生物芯片技術(shù)在今后的腫瘤發(fā)病機(jī)制研究和腫瘤的診斷等方面將發(fā)揮越來(lái)越顯著的作用1.檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因2.檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒的基因檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒的基因鼻咽癌鼻咽癌EB，宮頸癌，宮頸癌HPV3.檢測(cè)腫瘤標(biāo)志

23、物基因或檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物基因或mRNA 肝癌肝癌甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP）結(jié)腸癌結(jié)腸癌癌胚抗原（癌胚抗原（CEA）ras癌基因的檢測(cè)癌基因的檢測(cè)ras基因中最常見(jiàn)的點(diǎn)突變是第基因中最常見(jiàn)的點(diǎn)突變是第12，13或或61密密碼子突變碼子突變檢測(cè)方法：檢測(cè)方法：1. PCR/ASO2. PCR-SSCP p53的檢測(cè)的檢測(cè)p53基因突變主要為點(diǎn)突變，熱點(diǎn)區(qū)域位基因突變主要為點(diǎn)突變，熱點(diǎn)區(qū)域位于密碼子于密碼子130290，其中，其中175、273、284密碼子突變最常見(jiàn)。密碼子突變最常見(jiàn)。檢測(cè)方法：檢測(cè)方法：1. PCRSSCP2. PCR測(cè)序測(cè)序3. PCRRFLPTotal RNA from HeLa or NCI-H23 cells were reverse-transcribed into cDNAs in the presence of Biotin-dUTP. The biotin-labeled cDNA probes were then